Multi-fotone intracellulare di sodio Imaging Combinato con UV-mediata uncaging focale di glutammato in neuroni piramidali CA1

Riepilogo

Descriviamo la combinazione di focale indotta da UV foto-attivazione di composti neuro-attivi con whole-cell patch-clamp e multi-Photon Imaging di transitori di sodio intracellulari in dendriti e spine di neuroni ippocampali in fettine di tessuto acute del cervello di topo.

Abstract

Multi-fotone microscopia a fluorescenza ha permesso l'analisi dei parametri morfologici e fisiologici delle cellule cerebrali nel tessuto intatto con elevata risoluzione spaziale e temporale. Combinato con elettrofisiologia, è ampiamente usato per studiare i segnali di calcio di attività legate in piccoli compartimenti subcellulari come i dendriti e spine dendritiche. Oltre a transienti di calcio, attività sinaptica induce anche i segnali di sodio post-sinaptici, le cui proprietà sono solo marginalmente comprensibili. Qui, descriviamo un metodo per combinato whole-cell patch-clamp e l'imaging di sodio multi-fotone in micro domini cellulari dei neuroni centrali. Inoltre, si introduce una procedura modificata per l'ultra-violetta (UV) uncaging-luce-indotta di glutammato, che consente l'attivazione affidabile e focale dei recettori del glutammato nel tessuto. A tal fine, le registrazioni cellule intere sono state effettuate su Cornu Ammonis suddivisione 1 (CA1) neuroni piramidali in fettine di tessuto acute dellaippocampo di topo. I neuroni sono stati riempiti con il sodio-sensibile colorante fluorescente SBFI attraverso la patch-pipetta, e multi-fotone di eccitazione del SBFI consentito la visualizzazione dei dendriti e spine adiacenti. Per stabilire uncaging focale indotta da UV, diversi parametri tra cui l'intensità della luce, volume interessato dal fascio uncaging UV, posizionamento del fascio così come la concentrazione del composto in gabbia sono stati testati e ottimizzati. I nostri risultati mostrano che la perfusione locale con glutammato in gabbia (MNI-glutammato) e il suo risultato UV-uncaging focale nelle correnti interiori e transitori di sodio in dendriti e spine. Naturalmente il tempo e l'ampiezza delle due correnti attivo e segnali sodio correlano con la durata dell'impulso uncaging. Inoltre, i nostri risultati mostrano che i segnali di sodio intracellulari sono bloccati in presenza di bloccanti per i recettori ionotropici del glutammato, dimostrando che essi sono mediati da afflusso di sodio se questo percorso. In sintesi, il nostro metodo fornisce uno strumento affidabile per laricerca di segnali di sodio intracellulari indotti da attivazione del recettore focale nel tessuto cerebrale intatto.

Introduzione

Recenti miglioramenti nelle tecniche microscopiche leggeri quali microscopia multi-fotone hanno consentito lo studio dei parametri morfologici e fisiologici delle cellule cerebrali nel tessuto intatto con elevata risoluzione spaziale e temporale. Combinato con elettrofisiologia, queste tecniche sono ora ampiamente utilizzati per analizzare i segnali elettrici di attività legate sui neuroni e segnali di calcio concomitanti in piccoli compartimenti subcellulari, vale a dire in dendriti sottili e spine dendritiche. Oltre a transienti di calcio, attività sinaptica induce anche i segnali di sodio in dendriti e spine, le cui proprietà sono in gran parte inesplorate. Tali segnali possono essere analizzati da due fotoni di imaging di sodio intracellulare ([Na ^+] _i) che permette la misurazione on-line di [Na ^+] _i transienti per periodi prolungati senza significativo sbiancamento colorante o foto-danno ^1,2.

Per l'imaging di _i [Na ^+] , a pochi coloranti indicatore chimico sono disponibili, ad esempio Corona Verde o Asante Natrium Verde ^3,4. La sonda fluorescente più comunemente usato per Na ⁺ imaging è sodio-binding isoftalato benzofuran (SBFI). Si tratta di un raziometrica, colorante UV-eccitato simile al noto colorante calcio-sensibile fura-2 ed è stato impiegato per l'imaging convenzionale Na ⁺ in molti tipi di cellule (ad esempio ^5,6). Ci sono diverse possibilità di emozionanti del colorante e raccogliendo sua fluorescenza. Se è richiesta alta risoluzione temporale (cioè un frame rate elevato di imaging) in combinazione con le informazioni spaziali, SBFI può essere eccitato con una lampada allo xeno ad arco o un diodo dispositivo ad alta potenza di uscita della luce (LED) e la sua emissione rilevato con una carica ad alta velocità Dispositivo -coupled (CCD), fotocamera ^7,8. Per la risoluzione spaziale massima profondità nel tessuto, microscopia a scansione laser multi-fotone è il metodo di scelta ^9. Il relativamente basso efficie quantisticaNCY di SBFI richiede concentrazioni relativamente alte di colorante (0,5-2 mm), e il caricamento diretto del modulo membrana impermeabile di SBFI tramite un forte microelettrodo ¹⁰ o la patch pipetta ^1.

Utilizzando SBFI, precedenti lavori eseguiti in fettine di tessuto acute dell'ippocampo roditori hanno dimostrato attività legate transitori di sodio in dendriti e spine dei neuroni CA1 piramidali che sono causati principalmente da afflusso di sodio attraverso ionotropici NMDA recettori ^1,2. Per lo studio delle proprietà di tali segnali sodio locali in maggior dettaglio, l'attivazione di specifici recettori postsinaptici di applicazione di agonisti del recettore è un metodo adatto di scelta. Per simulare l'attività presinaptica e rilascio del trasmettitore, l'applicazione dovrebbe essere relativamente breve e focalizzato per consentire la stimolazione locale. Questo, tuttavia, risulta essere molto impegnativo nel tessuto intatto. Applicazione di pressione locale di agonisti del recettore con una pipetta a punta fine permette di ap molto focaleplicatura, ma ospita il rischio potenziale per produrre il movimento della struttura di interesse (ad esempio, come un dendrite o spine dendritiche), e quindi ostacola imaging ad alta risoluzione. L'idoneità di ionoforesi di sostanze neuro-attivi dipende dalle loro proprietà elettriche e alte ampiezze di corrente può produrre artefatti cellulari pure.

Un modo per aggirare questi ostacoli è l'impiego di composti foto-attivati ​​e la loro fotolisi del flash. Fondamentalmente, due principi differenti vengono utilizzati per la foto-attivazione di sostanze in gabbia: I) a largo campo del flash fotolisi ¹¹ e II) uncaging focale impiegando moduli di scansione in combinazione con il laser ^12. Mentre in tutto il campo del flash fotolisi viene utilizzato per attivare più grandi regioni di interesse, ad esempio, un intera cella, uncaging focale è impiegata per stimolare in particolare i piccoli compartimenti cellulari. In questo studio dimostriamo una procedura per whole-cell patch-clamp e multi-pImaging sodio Hoton in dendriti e spine di neuroni centrali, unita ad una procedura modificata per uncaging luce UV-indotta di glutammato, che permette l'attivazione affidabile e focale dei recettori del glutammato nel tessuto.

Protocollo

Questo studio è stato condotto in stretta conformità con le linee guida istituzionali della Heinrich Heine di Düsseldorf, in Germania, così come la Direttiva Europea del Consiglio della Comunità (86/609 / CEE). Tutti gli esperimenti sono stati comunicati e approvati dal Welfare dell'Ufficio degli animali presso l'impianto di cura degli animali e l'uso della Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf, Germania (numero di atti istituzionali: O52 / 05). In conformità con la tedesca Animal Welfare Act (Tierschutzgesetz, gli articoli 4 e 7), senza ulteriore approvazione formale per la rimozione post-mortem del tessuto cerebrale era necessario.

Per la generazione di fettine acute, i topi sono stati anestetizzati con CO ₂ e rapidamente decapitato (in seguito alla raccomandazione della Commissione europea pubblicato in: Eutanasia degli animali da esperimento, Lussemburgo: Ufficio delle pubblicazioni ufficiali delle Comunità europee, 1997; ISBN 92-827-9694 -9).

1 Preparazione diSoluzioni

1. Preparare fluido cerebrospinale artificiale (ACSF) per dissezione contenente (in mM): 125 NaCl, 2.5 KCl, CaCl ₂ 0,5, 6 MgCl _2, 1,25 NaH ₂ PO _4, 26 _NaHCO3 e 20 glucosio, bollito con 95% O ₂ e 5% di CO _2, risultando in un pH di 7,4.
2. Preparare ACSF per esperimenti che contengono (in mm): 125 NaCl, 2.5 KCl, CaCl 2 _2, 1 MgCl _2, 1,25 NaH ₂ PO _4, 26 NaHCO _3, e 20 glucosio, bollito con il 95% O ₂ e il 5% di CO2, con conseguente in un pH di 7,4.
3. Preparare la soluzione intracellulare (ICS) contenente (in mM): 150 KMeSO _3, 12,5 idrossi piperazina etilico acido etano solfonico (HEPES), 40 KCl, NaCl 5, 1.25 etilenico acido glicole tetraacetico (EGTA), 5 Mg-ATP, 0.5 Na- GTP. Regolare il pH a 7,3. Negozio aliquote di 1 ml a -20 ° C.
4. Diluire-sodio vincolante isoftalato benzofuran (SBFI) -salt in acqua bidistillata e preparare aliquote di 5 mldi una soluzione stock 10 mM.
5. ICS Scongelare e aggiungere soluzione madre SBFI ad una concentrazione finale di 1 mM. Vortex e micro-filtrato (0,22 micron). Conservare a 4 ° C fino al momento in esperimento. Non ricongelare e utilizzare solo per un giorno.
6. Preparare la soluzione glutammato magazzino MNI di 50 mM sciogliendo il composto in acqua bidistillata. Diluire MNI soluzione glutammato magazzino ad una concentrazione finale di 5 mM in ACSF normale. Conservare a 4 ° C fino al momento in esperimento. Non ricongelare e utilizzare solo per un giorno. Negozio aliquote, che non vengono utilizzati immediatamente l'esperimento, a -20 ° C.

2 dissezione di tessuto

NOTA: La preparazione di fettine di ippocampo acute del cervello dei roditori è stato descritto in dettaglio in precedenza ^13,14. In breve, il seguente protocollo è stato impiegato nel presente studio.

1. Dopo la decapitazione, rimuovere rapidamente il cervello dal cranio.
2. Posizionare immediatamente il cervello in una capsula di Petricon ghiaccio-freddo dissezione ACSF e sezionare un emisfero eseguendo un taglio sagittale lungo la linea mediana.
3. Eseguire un secondo taglio nella posizione desiderata come una superficie di blocco e collegare questo per la fase di taglio di un vibratome con supercolla.
4. Prendete camera di taglio e di elemento di raffreddamento (sia mantenuto a -20 ° C) del vibratome fuori della fase di taglio congelatore e posto con la sezione del cervello nella camera. Poi mettere elemento di raffreddamento nella camera e immergere il tessuto in ghiaccio-freddo dissezione ACSF. Per stabilizzare la preparazione, uno potrebbe voler contrastare il blocco di tessuto con gel di agar.
5. Tagliare 250 micron di spessore, fette parasagittali dell'ippocampo con il vibratome. Assicurarsi che tutti i fluidi ACS sono bolliti in ogni momento.
6. Dopo affettatura, mantenere il tessuto su una maglia in un becher con ACSF normale e incubare a 34 ° C per 30 min. Quindi tenere a temperatura ambiente.

3 Preparazione di Hardware

Figura 1 Schema che mostra percorsi di luce e di controllo sperimentale della piattaforma consiste di multi-fotone di imaging, laser-scanning ai raggi UV del flash fotolisi, ed elettrofisiologia. Il multi-photon beam (rosso) è prodotto da un pulsato, sintonizzabile a infrarossi (IR) del laser (TISA). Si passa un otturatore meccanico, una cella di Pockels ', e il rivelatore IR (rilevazione dell'intensità del fascio), ognuno dei quali consentono il controllo della potenza del laser e la sua durata amministrazione. Il / flip-out diodo laser opzionale flip-in è impiegato per l'allineamento di base del raggio laser. L'espansore del fascio può essere utilizzato in combinazione con obiettivi con un piano estremamente ampia di back-focale. La ruota filtro ND telecomandato può essere utilizzata in aggiunta o in sostituzione delle cellule dei Pockels 'per controllare la potenza del fascio laser. Dopo aver superato la testa di scansione, l'pulsata IR-luce è guidata al campione. Emettereluce di fluorescenza ted (verde chiaro) viene raccolta sia dal esterno o rivelatori fotomoltiplicatori interni (PMT). I rilevatori esterni sono perfettamente sincronizzate con i PMT interni tramite un interruttore ad alta frequenza (regolatore PMT). Il fascio uncaging (azzurro) è prodotta da un laser a stato solido UV (UV-Laser DPSS). Si è quindi diretto all'unità di scansione galvanometrica-driven in alto-posteriore del condensatore epi-fluorescenza da una guida di luce. Il posizionamento preciso (aberrazione cromatica tra imaging e fascio uncaging) dello spot uncaging o area è abilitata per l'esportazione immagine dal software di imaging. La gestione della tempistica per la sincronizzazione di immagini, la elettrofisiologia, e la fotolisi flash è controllata elettronicamente. Il rivelatore transilluminazione (TL-PMT) è di necessità di documentazione del posizionamento delle pipette all'interno del tessuto. Le unità di controllo e software del sistema di imaging, che è stato modificato, viene utilizzato per controllare e sincronizzare tutti gli altri dispositivinecessari per eseguire il sistema. Componenti del sistema etichettati come "custom" sono state progettate e costruire / adattato dagli autori. Alcuni componenti sono stati adattati per soddisfare i requisiti del sistema multi-fotone abitudine-costruisce e sono etichettati come "modificato". Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

1. Accendere i componenti del sistema multi-fotone. Prova e regolare l'allineamento infrarosso del fascio laser.
   1. Controllo posizionamento del fascio girando nel prisma di centraggio invece di un obiettivo. Se il raggio è dislocata, ri-regolarlo dagli specchi del periscopio. Si noti che il piano di centraggio del prisma deve essere allo stesso livello del piano focale posteriore dell'obiettivo mentre imaging.
   2. Accendere lo spettrometro e verificare le caratteristiche di multi-fotoni del fascio.
   3. Impostare i parametri del software di imaging per i seguenti valori: Scegliuna dimensione di fotogramma di 512 x 512 pixel per immagini Panoramica delle cellule (caselle di clip più piccole con un fattore di zoom di 2.5 per frame rate elevato e ad alta risoluzione spaziale, rispettivamente). Impostare la velocità di immagini in modalità veloce e la modalità di scansione a XYT. Z-stepping deve essere di 1 micron per pile Panoramica e 0,2 micron per pile dettagliate per soddisfare i requisiti di campionamento spaziale per deconvoluzione eseguita più tardi.
2. Regolare il fascio laser multi-fotone (790 nm) Intensità modificando le impostazioni della cella dei Pockels '(finale di potenza sotto dell'obiettivo: ≈ 14 - 16? W) ed i fotomoltiplicatori (PMT).
3. Accendere e calibrare il sistema uncaging mettendo una diapositiva campione fluorescente sotto la lente dell'obiettivo.
   1. Usando il binocolo, regolare la messa a fuoco delle ottiche UV e spazialmente limitare il punto laser UV ad una dimensione di 2 micron di diametro al massimo utilizzando l'unità di messa a fuoco alla testa di scansione UGA.
   2. Avviare la procedura di calibrazione del softwar controllo dell'unità uncaginge.
      1. Impostare il laser UV a diversi punti all'interno della sua gamma di scansione, mentre la fluorescenza viene catturato con una telecamera CCD. Cliccando sul punto laser UV in ogni punto, regolare il posizionamento degli specchi di scansione galvanici corrispondere ad un certo coordinare nel software.

Figura 2 schema dettagliato che illustra le caratteristiche di eccitazione, emissione e percorsi ottici uncaging. Il fascio di eccitazione IR (rosso) passa il raggio che unisce specchio dicroico a livello alla torretta filer nel condensatore epi-fluorescenza del microscopio e l'obiettivo di raggiungere il campione. Il fascio uncaging (blu) avviene tramite un quarzo fibra ottica luce alla collimazione del fascio e unità di messa a fuoco e poi successivamente guidato le mi scansionerrors nell'unità di scansione, passa uno specchio dicroico per fascio combinare specchio dicroico. Qui si combina con il raggio di scansione di eccitazione. La luce emessa dal campione segue il percorso del percorso ottico di scansione di eccitazione con orientamento opposto verso la testa di scansione imaging. La telecamera è utilizzato per il controllo visivo della pipetta di patch e per il posizionamento del fascio uncaging in combinazione con il microscopio confocale a scansione laser (non mostrato). Il percorso della luce verde rappresenta una illuminazione epi-fluorescenza opzionale che può essere di uso con altre applicazioni.

3. 2. 2. Utilizza il sistema di flash fotolisi in modalità spot per ottenere applicazioni focali. Assicurarsi che la regolazione focale del fascio uncaging (potenza media sotto l'obiettivo: 0.55 mW) si traduce in una dimensione del punto di 1,5 micron di diametro (estensione xy), come rivelato in una diapositiva fluorescente posizionato a un livello di z che corrisponde a quella di un tessutofetta (non mostrato).
   3. Il posizionamento preciso del punto uncaging si ottiene l'importazione di un'immagine del sistema di imaging tramite una connessione di rete tra uncaging- e di imaging-computer.
      1. Utilizzando un software di screen grabber, continuamente leggere i fotogrammi del software di imaging (invece del mangime telecamera) e regolare i fotogrammi di immagini e uncaging congruente. Esportare ogni 10 ^° fotogramma dal software di imaging come immagine di riferimento nell'unità flash per garantire la corretta regolazione durante l'intero esperimento.

Figura 3 Regolazione dello spot uncaging: Per posizionare con precisione il punto uncaging, una schermata del software di imaging (riquadro giallo) viene importato nel software uncaging (cornice verde). Ilimmagine di sinistra all'interno della cornice gialla rappresenta un'immagine codificata Hi-Lo (blu: pixel nero, rosso saturi pixel) di tutta la cella CA1 piramidale. L'immagine viene sovrapposta dalla griglia di calibrazione del software uncaging (link "X" s). A destra, una parte ingrandita della cella viene visualizzato con il punto uncaging sovrapposto (croce rossa). La macchia gialla è l'immagine sovrapposta automatico del fascio uncaging. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

4. Accendere micromanipolatori, componenti elettrofisiologia, e dispositivo di applicazione di pressione per la consegna del composto in gabbia per la regione di destinazione.
5. Installare un dispositivo di applicazione di pressione focale di perfusione locale di composti in gabbia. Ciò ridurrà i costi enormemente rispetto al bagno di perfusione di queste sostanze. Regolare la pressione tiene alla data pressione atmosferica per evitare il trascinamento di ACSF o in una fuoriuscita di sostanze in gabbia dalla pipetta applicazione.
   NOTA: Il dispositivo di applicazione di pressione ospita un micro-valvola di alta precisione e ultraveloce nel supporto pipetta. Ciò consente di impiegare minime pressioni di applicazione e quindi riduce gli artefatti di movimento al minimo durante la perfusione locale con il composto gabbia.
6. Tirare pipette per whole-cell patch-clamp e perfusione locale utilizzando capillari in vetro borosilicato fuoco lucido. Le pipette devono avere un diametro punta di ~ 1 micron e una resistenza di R ≈ 3 MW (valori determinati con K-meso ₃ basata su ICS).
7. Posizionare fetta nel bagno sperimentale e fissarlo con una griglia (telaio platino spessore 250 micron, attraversato con filamenti chirurgici, od 40 micron) (Figura 4A, B). Utilizzare un, (palla a lato di aspirazione della punta rotta) tip-rotto, e il fuoco lucidato pipetta Pasteur invertita per il trasferimento slice. Evitare di piegare e qualsiasi altra dura manipolazione della fetta.

Figura 4. Componenti della vasca sperimentale e posizionamento della vasca nella fase microscopio. (A) Il bagno sperimentale costituito da camera bagno stesso (quadrato blu), che è circondata da un anello metallico magnetico. Il tubo garantisce la perfusione continua del bagno con soluzione salina (ACSF). La griglia a tenere premuto e fissare la fetta viene immesso nella camera di bagno. (B) acuta preparazione fetta posizionato all'interno della camera di bagno. La fetta è fissato dai fili della griglia. (C) Posizionamento e geometria della vasca sperimentale nella fase microscopio durante gli esperimenti.

8. Posizionare il bagno nella fase microscopio e permanentemente profumato fetta con ACSF.

4 Whole-cell patch-bloccaggio

1. Caricare il patch pipetta con ICS contenenti SBFI e caricare pipetta perfusione locale con mescola in gabbia. Fissare pipette per micromanipolatori corrispondenti. Mettere elettrodo di riferimento in bagno. Assicurarsi che si sta a terra in modo permanente per evitare danni allo stadio testa (cf Figura 4C).
2. Abbassare entrambe le pipette in bagno e metterli sopra la regione ippocampale CA1. Applicare una leggera pressione per pipetta di patch (+40 mbar) per evitare la diluizione del SCI con ACSF.
3. Compensare il potenziale di offset della pipetta di patch utilizzando il software elettrofisiologia.
4. Approccio una cellula piramidale CA1 con la patch pipetta impiegando video microscopia IR-DIC. Esercitare una leggera aspirazione fino ad ottenere un Giga-sigillo. Scegliere una cellula soma di che si trova a 30 -70 micron sotto la superficie della fetta di garantire morfologia cellulare intatta sul lato da un lato e bassa dispersione e attenuazione del fascio uncaging sull'altro lato.
5. Compensare capacità veloce. Pausa a membranaE e cellule aperte per ottenere la configurazione whole-cell.
6. Compensare capacità lento e resistenza serie.
7. Lasciare la cella da dializzato con i SBFI-ICS per almeno 30 minuti prima di iniziare gli esperimenti di imaging.

5. multi-fotone imaging e la stimolazione

Figura 5 Protocollo sperimentale. Per inizializzare un esperimento, un impulso di trigger (indicato dal segno rosso (ᴨ) e la linea rossa) è impostato per avviare simultaneamente imaging (blu), l'elettrofisiologia (verde), e l'amministrazione della gabbia composto (giallo) al momento punto 0 sec. Durante questo primo periodo, il fascio di imaging dovrebbe essere completamente oscurata (luce blu). Dopo 4,5 sec (linea tratteggiata), la perfusione locale del composto gabbia è terminato e il fascio di imaging dovrebbe essere impostato al suo worintensità re per l'acquisizione dei dati (blu). 1,5 sec dopo (ora punto 6 sec), un secondo impulso di trigger viene dato (indicato dal segno rosso (ᴨ) e la linea rossa), che inizializza l'unità flash UV (durata del flash: 300 msec, mediante la lampo giallo ) e imposta marcatori nel elettrofisiologia e il protocollo di imaging.

1. Aggiungi tetrodotossina (TTX, 500 nM) per ACSF per impedire l'attivazione dei canali del sodio voltaggio-dipendenti e la generazione di potenziali d'azione.
2. Visualizza morfologia cellulare con multi-fotone di eccitazione e conseguente SBFI fluorescenza e scegliere un dendrite spinosa per l'esperimento. Zoom in per le immagini a una risoluzione superiore e inserire una casella clip attorno al dendrite.
3. Riempire una pipetta di patch di serie con ACSF 10 microlitri contenenti glutammato in gabbia. Collegare la pipetta al sistema di applicazione della pressione e collegarlo al micromanipolatore.
4. Posizionare la pipetta con mescola in gabbia vicino al dendrite (~ 30 micron). Posizionare la pipetta per consentireefficiente perfusione locale del dendrite di scelta. Regolare il laser uncaging: posizionare il punto uncaging vicino (~ 1 - 2 micron) alla struttura di interesse.
5. Impostare le regioni di interesse sul dendrite scelto e spine adiacenti utilizzando il software di imaging.
6. Avvicinati alla regione di interesse e focally iniettare il composto in gabbia per diversi secondi a bassa pressione (<3 PSI). Inizia patch clamp e registrazioni fluorescenza (a 790 nm multi-fotone di eccitazione) tramite segnale di trigger.
   NOTA: Durante la perfusione locale del composto in gabbia, il fascio di eccitazione è completamente oscurata per evitare lo sbiancamento.
7. Arrestare perfusione locale del composto gabbia. Aumentare l'intensità del laser a due fotoni per consentire l'eccitazione efficiente di SBFI e applicare un lampo UV per inizializzare uncaging (uncaging durata di 300 msec).
8. Monitorare i cambiamenti nel SBFI fluorescenza. Interrompere la registrazione dopo SBFI fluorescenza ha recuperato di nuovo al basale.

6. Farmacologia

1. Per verificare il coinvolgimento dei recettori del glutammato ionotropici nella generazione delle correnti e / o segnali di sodio evocate da UV in flash fotolisi del glutammato in gabbia, impiegare bloccanti del recettore.
   1. Passare ACSF contenente il bloccante del recettore AMPA-ciano-nitroquinoxaline-dione (CNQX, 10 mM) e il blocco del recettore NMDA-amino-phosphonopentanoate (APV, 50 mM) in aggiunta alla TTX (vedi sopra) e profumato fetta per almeno 10 min.
   2. Ripetere la procedura di stimolazione (vedi 5.4 e 5.5.)
2. Reversibilità degli effetti degli inibitori '
   1. Tornare alla ACSF normale contenente solo TTX.
   2. Profumato fetta per 20 min.
   3. Ripetere la procedura di stimolazione (vedi 5.4 e 5.5.).

7 Morfologia

1. Registrare un XYZ-stack del clip box-set regione per le misure effettuate. Assicurarsi che questo stack è sovracampionamentod spazialmente (almeno 0,2 micron per pixel) per consentire ottimale deconvoluzione nell'immagine e per aumentare la qualità dell'immagine e la risoluzione.
2. Registrare un XYZ-pila di l'intera cella per valutare la morfologia delle cellule.
3. Algoritmo di deconvoluzione Esegui.

Risultati

Nel presente studio, abbiamo dimostrato una procedura per la microscopia multi-fotone delle dinamiche di sodio cellulari con il colorante fluorescente SBFI sodio-dipendenti nei neuroni piramidali CA1 di topo acuta fettine di tessuto ippocampale. Inoltre, mostriamo come combinare questa tecnica di imaging con uncaging a base di laser-scanning di composti neuro-attiva (ad esempio glutammato in gabbia) e la sua precisione di targeting per cellulari micro-domini.

Caricamento neuroni con SBFI attraverso la patch-pipetta permesso la visualizzazione di tutta la cellula compresi dendriti e spine sottili adiacenti impiegando multi-fotone di eccitazione (Figura 6A, B, D e Figura 7a).

Figura 6 segnali di sodio e correnti sinaptiche indotte dal flash fotolisi del glutammato in gabbia. (A) MaximAl proiezione dell'immagine di un neurone piramidale CA1 caricato con SBFI tramite la pipetta di patch (PP). La casella indica l'area indicata ampliata nel B. LP indica la posizione e l'orientamento della pipetta per perfusione locale di glutammato in gabbia. (B) ad alta potenza massima proiezione di una pila di sezioni ottiche di un dendrite con spine dendritiche adiacenti. Le pile di sezioni ottiche sottoposti z-allineamento e deconvoluzione. La croce rossa indica la regione di destinazione del fascio uncaging. La linea tratteggiata arancione delimita la regione di interesse da cui è stata registrata l'emissione di fluorescenza. La casella indica l'area indicata ampliata nel D. (C) A sinistra: il segnale di sodio (riga superiore) e somatica verso l'interno di corrente (riga inferiore) indotta dal flash fotolisi del glutammato in gabbia (indicato dal lampo giallo). La linea rossa rappresenta un fit dei dati sperimentali. L'area grigia rappresenta il periodo in cui il flash uncaging (300msec) ostruito l'imaging di fluorescenza SBFI Destra:. senza pre-perfusione con glutammato in gabbia, la stessa UV-flash né evocato un cambiamento di emissione SBFI, né una corrente verso l'interno (D) A sinistra:. Immagine ad alta potenza del dendrite e adiacente spine come delineata in B. Accanto, la stessa immagine con valori di grigio invertite. Le linee tratteggiate indicano le regioni di interesse in cui è stato registrato l'emissione di fluorescenza. La croce rossa indica la localizzazione del fascio uncaging Destra:. Transienti sodio indotta da UV-flash fotolisi del glutammato in gabbia. Blu traccia: segnali di sodio nel dendrite; traccia rossa: risposta media da tre spine adiacenti al punto uncaging; traccia verde: risposta media da tre spine lontane. Cliccare qui per una versione più grande di questa figura.

Dopo la perfusione locale con Cagedglutammato, applicando un UV-flash vicino ad un dendrite portato ad una diminuzione transitoria emissione di fluorescenza di SBFI, riflettendo un aumento della concentrazione di sodio intracellulare (Figura 6C, D e Figura 7B). Allo stesso tempo, una corrente verso l'interno è stato registrato al soma (Figura 6C e Figura 7B). Aumentare la durata del flash UV ha portato ad aumentare ampiezze sia della suscitato verso l'interno correnti e segnali di sodio (dati non mostrati), indicando che il sistema era ben all'interno della sua gamma dinamica e che le risposte non uncaging né cellulari erano saturi. Applicazione di un UV-lampo di identica durata o più per sezioni che non sono state pre-perfusi con glutammato in gabbia, non ha provocato cambiamenti nel SBFI fluorescenza né correnti interiori, indicando che questi segnali sono dovuti alla uncaging di glutammato (Figura 6C). Inoltre, questi risultati mostrano che nessuna interdipendenza dei componenti imaging- e uncaging si osserva under nostre condizioni sperimentali. Segnali di sodio potrebbe essere rilevato anche in spine dendritiche (Figura 6D). Anche se non abbiamo tentato di ottenere la stimolazione di un singolo colonna vertebrale solo con glutammato uncaging, ampiezze di picco tendevano ad essere leggermente superiore a spine vicino al punto uncaging, considerando spine più lontano hanno mostrato variazioni di fluorescenza praticamente identiche come il dendrite genitore (Figura 6D).

Infine, abbiamo studiato il percorso per afflusso di sodio nei dendriti e spine in risposta a uncaging di glutammato. A tal fine, abbiamo impiegato CNQX e APV, che sono bloccanti selettivi per i sodio-permeabili, recettori ionotropici del glutammato del AMPA- e NMDA-sottotipo, rispettivamente. I nostri risultati mostrano che i segnali sodio intracellulare indotta da glutammato e le correnti somatici stimolate sono stati omessi in presenza di questi bloccanti (Figura 7B). Al momento del wash-out dei bloccanti, i segnali sono riacquistato. Questo dimostra that uncaging di glutammato attiva i recettori del glutammato ionotropici sui neuroni piramidali CA1, che mediano l'afflusso di sodio nei dendriti e spine, con conseguente transienti intracellulari di sodio e correnti verso l'interno.

Figura 7 profilo farmacologico dei segnali di sodio evocate e delle correnti verso l'interno. (A) SBFI pieno CA1 piramidale neuroni con la patch pipetta (PP) allegato al soma (B) A sinistra:. Transitorio di sodio e la corrente somatica indotta da foto-attivazione di glutammato in gabbia in un dendrite e spine collegate Center. Perfusione con l' ionotropici bloccanti del recettore del glutammato CNQX e APV inibisce sia il segnale di sodio e la corrente verso l'interno indotta da uncaging destra:. Su wash-out dei bloccanti, i segnali vengono ripristinati. I rappre linea rossats una misura dei dati sperimentali. L'area grigia rappresenta il periodo in cui il flash uncaging (300 msec) ostruito l'imaging di fluorescenza SBFI. Cliccare qui per una versione più grande di questa figura.

Discussione

Il presente studio dimostra che SBFI è adatto per due fotoni di imaging di transitori di sodio intracellulari in piccoli compartimenti cellulari. Va tenuto presente, tuttavia, che l'efficienza quantica di SBFI è piuttosto bassa ¹⁵ e relativi cambiamenti nella concentrazione di sodio è piuttosto piccola con attività fisiologica. Pertanto, la misurazione ad alta risoluzione di transitori Na ⁺ nei processi sottili è un compito relativamente noioso, e binning o media di diversi studi può essere necessario per ottenere segnali soddisfacenti. Inoltre, la cinetica di transienti sodio sono sorprendentemente lento, rendendo obbligatoria registrare per periodi di tempo prolungati. Questa osservazione corrisponde a quelle in studi precedenti, in cui il decadimento monoesponenziale dei transitori di sodio in dendriti neuronali e in astrociti è stata caratterizzata da grandi costanti di tempo di decadimento dell'ordine di 10 secondi a temperatura ambiente ^1,2,6. Transitori di sodio sembrano quindi esercitare un tempo molto più lento coUrse e molto più grandi costanti di tempo di decadimento rispetto ai transienti di calcio ^16.

Mettere da parte questi inconvenienti, l'imaging di sodio dimostra di essere un valido strumento per lo studio delle proprietà fisiologiche dei sottodomini neuronali. Ad esempio, l'imaging di sodio può servire per monitorare l'attività sinaptica eccitatoria in o vicino alla sinapsi attive. Poiché il sodio è essenzialmente non tamponato ^8,17, transitori sodio attività indotte sono linearmente correlate a una vasta gamma di rilascio di glutammato sinaptico o esogena glutammato applicati. Essi rappresentano quindi indicatori diretti e imparziali di attività glutamatergico neuronale. Inoltre, indicatore di sodio coloranti presentano s 'alta K _d (di SBFI K _d è nel range di 25 mm ^1). Anche a concentrazioni relativamente alte di colorante intracellulari utilizzati per raggiungere la luminosità sufficiente (di solito 0,5-1 mM), l'elevato K _d 's implica che i coloranti stessi non agiscono come buffer per sodium. Di conseguenza, essi non distorcano l'ampiezza né il tempo corso di transitori di sodio, che è sempre una preoccupazione quando coloranti calcio-sensibili vengono introdotti nelle cellule ^18. Si può pertanto ritenere che i segnali rilevati rappresentano una buona misura delle variazioni "reale" in sodio intracellulare. Il loro decorso lento quindi implica che la velocità di diffusione intracellulare del sodio nei neuroni è molto più piccolo di quanto precedentemente ipotizzato ^19.

Un requisito fondamentale per la corretta esecuzione di esperimenti che riguardano le proprietà di eccitatori vie di trasmissione e afflusso di sodio sinaptiche nelle spine e dendriti è l'induzione di una attivazione veloce e altamente localizzata di strutture post-sinaptici. Questo può essere ottenuta con l'applicazione facile e locale di glutammato o glutammato agonisti nelle immediate vicinanze di una colonna vertebrale o un dendrite dalla fotolisi lampo di composti gabbia. Fotolisi Flash non dama non meccanicamentege il tessuto, è privo di artefatti da movimento ed è ben stabilito per lo studio di questioni connesse (ad esempio la segnalazione di calcio locale). Il diametro dello spot uncaging è stato di 1,5 micron nel piano xy. Uncaging quasi un segnale di sodio spinosi dendrite indotti in entrambe le spine e il dendrite genitore. Considerando che i segnali tendevano ad essere più grande di spine più vicini al posto uncaging, le ampiezze della dendrite genitore e spine più lontano erano ancora piuttosto simili a quelle nelle immediate vicinanze del punto uncaging. Uncaging è stata eseguita per 300 msec durante il quale le correnti interiori aumentate in ampiezza. Glutammato Uncaged avrebbe diffuso nel tessuto durante lo stesso periodo di tempo, l'attivazione di recettori ionotropici del glutammato e afflusso di sodio sulle regioni dendritiche e le spine più lontano dal punto uncaging.

Un problema intrinseco che si verifica quando si utilizza un laser UV per fotolisi di composti in gabbia somministrati attraverso la soluzione di balneazione cellulareè 'filtraggio interiore'. A causa del tasso di assorbimento elevato della gabbia, la luce UV si attenua fortemente lungo la strada dall'obiettivo al sito di stimolazione ^20,21. Un modo pratico per evitare questo è perfusione locale con la gabbia che è limitato solo per il sito di stimolazione, che riduce inoltre la quantità di composto in gabbia necessaria al minimo. Rispetto al uncaging UV scansione laser-mediata, vicino-infrarossi a due fotoni uncaging ²² è spazialmente più precisa, soprattutto perché la precisione della stimolazione aumenta in asse z. D'altra parte, a causa della piccola sezione di gabbie comunemente usati per le lunghezze d'onda più lunghe come impiegati con eccitazione a due fotoni, sia una elevata concentrazione del composto in gabbia o molto elevato, richiedono intensità luminose potenzialmente fototossiche. Inoltre, due fotoni uncaging richiede un investimento molto maggiore nelle attrezzature; tra gli altri, un laser IR supplementare oltre ai componenti ottici richiesti, sono necessari.

Sia SBFI e MNI-glutammato sono eccitabili nella gamma di lunghezze d'onda identica. Questo può portare a una interdipendenza involontaria di laser UV uncaging e SBFI o laser per immagini IR e MNI-glutammato, con conseguente sbiancamento della SBFI dal flash uncaging e / o una uncaging continuo di glutammato dal fascio IR. Tuttavia, come mostrato nella Figura 6C, né un lampo UV per sé né la formazione immagine a più fotoni causato tali influenze reciproche nelle nostre condizioni sperimentali.

Sistemi UV-in flash simili a quello qui descritto sono utilizzati di routine in molti altri laboratori e possono essere relativamente facilmente incorporati in nessuna microscopio di imaging multi-fotone esistente. Esso offre il vantaggio che il fascio laser per fotolisi può essere posizionato liberamente nel campo visivo. Inoltre, il sistema permette un riposizionamento rapido ed automatico del fascio laser e il volume di rilascio, rispettivamente, nel campo visivo durante un esperimento. Oumodifica r semplifica e migliora il posizionamento accurato dello spot uncaging, in modo che i frame del software di imaging possono servire per regolare fotogrammi di imaging e uncaging congruente.

Nel loro insieme, whole-cell patch-clamp e l'imaging di sodio multi-fotone in dendriti e spine dei neuroni centrali, unita ad una procedura modificata per uncaging UV-luce-indotta di glutammato, permette l'attivazione affidabile e focale dei recettori del glutammato nel tessuto. Si può quindi servire per analizzare le proprietà di trasmissione sinaptica eccitatoria e segnali di sodio nei neuroni postsinaptici nel tessuto intatto.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Borosilicate-glass capillaries	Hilgenberg	1405059	75 x 2 mm, wall thickness 0.3 mm
Camera	Jenoptik	ProgRes MF	IR-DIC compatible camera
Deconvolution software	SVI	Huygens Pofessional X11
Fiber optic spectrometer	Ocean Optics	USB 4000	Miniature fiber optic spectrometer
Filter tubes	VWR		cenrifugal filter, 0.2 µm
Imaging software	Olympus Europe	Flowview Ver 5.0c, Tiempo
IR beam power controller	Custom built		Laser beam intensity control + fast switch to zero on flyback via pockels cell
IR laser	SpectraPhysics	Mai-Tai	fs-pulsed Ti:Sa tunable laser (710 - 990 nm); CAUTION
IR power monitor	Custom built
Micromanipulator	Burleigh	PCS 5000
Microscope/Imaging System	Olympus Europe	BX51WI/FV300	Both, the microscope and the imaging systems were strongly modified
ND filter wheel	Newport	50Q04AV.2	UV fused silica, optical density 0.05 - 2.0
Objective	Nikon Instruments Europe	NIR Apo 60x/1.0w
Patch clamp amplifier	HEKA	EPC-10
Pipette puller	Narishige	Model PP-830
Pneumatic drug ejection system	NPI Electronic	PDES-DXH
Pockels cell	Conoptics	350-80 LA-BK	EOM, used as fast switch and for power adjustment
Pockels cell driver	Conoptics	M302-RM	High voltage differential amplifier
Shutter	Vincent Associates	LS6ZM2	ALMgF2-coated BeCu blades
Shutter controller	Custom built
Shutter driver	Vincent Associates	Uniblitz VCM D1
Slicer/Vibratome	Thermo Scientific	Microm HM 650 V
Uncaging software	Rapp OptoElectronic	UGA40 1.1.2.6 + NetCam
UV laser	Rapp OptoElectronic	DL-355/10	cw DPSSL Laser, 355 nm; 10 mW; CAUTION
UV laser scanning system	Rapp OptoElectronic	UGA 40	Galvanometric scanning system
Name of Compound	Company	Catalog Number	Comments/ Description
CNQX	Sigma Aldrich	C-127	AMPA receptor antagonist; CAUTION
DL-AP5	Alfa Aesar	J64210	NMDA receptor antagonist; CAUTION
SBFI K+ salt	Teflabs	OO32
TTX	Ascent Scientific	Asc-055	Inhibitor of voltage-dependent Na+ channels; CAUTION
NMI-caged-L-Glutamate	Torcis	1490	Caged glutamate released upon UV absobtion