Derivazione di cellule cardiache progenitrici di cellule staminali embrionali

Riepilogo

In this protocol, derivation of cardiac progenitor cells from both mouse and human embryonic stem cells will be illustrated. A major strategy in this protocol is to enrich cardiac progenitor cells with flow cytometry using fluorescent reporters engineered into the embryonic stem cell lines.

Abstract

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great promise in cell therapy against heart disease. Among various methods to isolate CPCs, differentiation of embryonic stem cell (ESC) into CPCs attracts great attention in the field since ESCs can provide unlimited cell source. As a result, numerous strategies have been developed to derive CPCs from ESCs. In this protocol, differentiation and purification of embryonic CPCs from both mouse and human ESCs is described. Due to the difficulty of using cell surface markers to isolate embryonic CPCs, ESCs are engineered with fluorescent reporters activated by CPC-specific cre recombinase expression. Thus, CPCs can be enriched by fluorescence-activated cell sorting (FACS). This protocol illustrates procedures to form embryoid bodies (EBs) from ESCs for CPC specification and enrichment. The isolated CPCs can be subsequently cultured for cardiac lineage differentiation and other biological assays. This protocol is optimized for robust and efficient derivation of CPCs from both mouse and human ESCs.

Introduzione

Le malattie cardiache rimane la causa nel mondo leader di oggi e il tasso di mortalità sono rimasti pressoché invariati negli ultimi due decenni (American Heart Association). Vi è una necessità critica per lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche per prevenire o invertire l'insufficienza cardiaca in modo efficace. Una strategia promettente è terapia cellulare a seguito del rapido sviluppo della biologia delle cellule staminali ^1. A questo proposito, CPC multipotenti potrebbero essere una fonte eccellente cellule per la terapia a causa della loro capacità di proliferare ma impegnata solo differenziazione lineage cardiaca. Pertanto, il metodo efficiente e robusto per generare ed isolare CPC è di grande importanza per gli studi di terapia cellulare cardiaca.

Questo protocollo si concentra su CPC embrionali individuati durante l'embriogenesi precoce e di come la loro generazione dal CES. Vari CPC sono stati isolati dai cuori embrionali e adulte, anche da midollo osseo ^2. Durante lo sviluppo embrionale, morphoge ossoproteine ​​tiche (BMP), senza ali di tipo familiari sito di integrazione MMTV (Wnts) e segnali nodali inducono l'impegno della Mesp1 ⁺ mesoderma multipotenti ^{3. +} Cellule Mesp1 poi differenziano nelle CPC embrionali ^4. Questi CPC sono tipicamente caratterizzati da HCN4, NK2 homeobox 5 (NKX2-5), Isl LIM homeobox 1 (Isl1), T-box 5 (Tbx5), e dei miociti fattore enhancer 2C (MEF2C), formano campi cuore primarie e seconde, e contribuire alle principali parti del cuore durante cardiogenesis ^5-10. CPC Sia NKX2-5 ⁺ e Isl1 ⁺ / MEF2C ⁺ sono in grado di differenziarsi in cardiomiociti, cellule muscolari lisce (SMC), e le cellule endoteliali ^5-8. Così questi CPC daranno luogo a vascolare cardiaca così come i tessuti cardiaci e sono una fonte di cellule ideale per la terapia cardiaca cell-based. Di conseguenza, generando CPC in vitro è stato un obiettivo importante di ricerca in studi cardiovascolari. Dal CES hanno la capacità di espansione illimitata and rappresentano le cellule ICM allo stadio di blastocisti, la differenziazione dei CES in CPC embrionali seguito della embriogenesi naturale è considerato un approccio logico ed efficace per ottenere CPC.

Un approccio ampiamente applicata per ottenere CPC dal CES è quello di aggregare CES in EBs ^11. Per migliorare l'efficienza differenziazione, fattori chimici e crescita definiti sulla base della conoscenza di sviluppo cardiaco sono stati utilizzati ^12-14. Tuttavia, non ci sono marcatori CPC definitive, in particolare marcatori della superficie cellulare, che sono ampiamente accettate nel settore. Per risolvere questo problema, i CES sono progettati per contrassegnare Isl1 ⁺ o MEF2C CPC ⁺ e loro derivati, con i giornalisti fluorescenti che utilizzano il sistema / loxP Cre. Il ricombinasi cre è buttato in sotto il controllo di Isl1 / MEF2C promoter / enhancer. Modificata la proteina fluorescente o RFP gene YFP guidata da un promotore costitutivo possono essere attivate da escissione di arresto flox codone con cre ricombinasi(Isl1: cre; pCAG-flox-STOP-flox-GFP o RFP / Isl1-cre; Rosa26YFP / MEF2C-cre; Rosa26YFP) ^5,6. Una volta che i CES sono differenziati in CPC secondo campo cuore, Isl1 / MEF2C promoter / enhancer cre guidato attiverà i reporter fluorescenti e CPC può essere arricchita da FACS-purificazione. In breve, il metodo di aggregazione EB viene utilizzato per avviare ESC differenziazione. Per migliorare l'efficienza differenziazione, le cellule differenziate sono trattati con acido ascorbico (AA) e fattori di crescita come Bmp4, Activin A e VEGF ^13,15. Questo protocollo permette robusto ed efficiente differenziamento CPC utilizzando sia il mouse e CES umani.

Protocollo

1. Derivazione embrionali di topo CPC da mouse CES

1. Preparare il mouse fibroblasti embrionali (MEF) feeder layer.
   1. Medio MEF caldo (10% FBS in DMEM) a 37 ° C.
   2. Preparare piatti gelatina rivestito.
      1. Aggiungere 1 ml di 0,1% di gelatina in acqua in un pozzetto della piastra da 6 pozzetti o 5 ml in un piatto 10 cm.
      2. Lasciare piatti o piatti a 37 ° C oa temperatura ambiente per almeno 30 min. Aspirare la gelatina prima dell'uso.
   3. Scongelare irradiato MEF rapidamente in un bagno d'acqua a 37 ° C, agitando delicatamente.
   4. Trasferire le cellule delicatamente per un tubo da 15 ml o 50 ml. Aggiungere 5 ml di terreno MEF pre-riscaldato. Agitare le cellule lentamente e centrifugare a 200 xg per 5 min.
   5. Risospendere le cellule in terreno MEF e contare le cellule vitali. Utilizzare i seguenti volumi di MEF medio: 2 ml per cellule per bene da un 6-pozzetti e 10 ml per le cellule da un piatto di 10 cm.
   6. Cellule piastra in 6 pozzetti o 10 piatti cm a 1-2x 10 ⁶ per piatto / piatto.
   7. Incubare le piastre MEF / stoviglie a 37 ° C, 5% CO ₂ almeno 24 ore prima dell'uso.
      NOTA: Eliminare MEF piatti / stoviglie più vecchi di una settimana.
2. Preparare CES del mouse
   1. Culture del Isl1-cre; Rosa26YFP / MEF2C-cre; Rosa26YFP del mouse CES sul MEF fino al 90% confluenti. Media cell Uso ES comprende 410 ml DMEM, 75 ml FBS, 0,1 mm MEM NEAA, 2 mM L-glutammina, 0.1 mM piruvato, 100 U Pen / Strep, e 0,1 mm β-mercaptoetanolo.
   2. Preparare 6 pozzetti gelatina rivestito come descritto al punto 1.1.2.
   3. Aspirare media da piatti e lavare le cellule con DPBS.
      1. Aspirare DPBS e aggiungere 0,4 ml 0,25% tripsina in un pozzetto di 6-pozzetti. Incubare le cellule a 37 ° C, 5% CO ₂ per 5 min. Aggiungere 1 ml di pre-riscaldato medie ES cessare reazione tripsina.
   4. Celle di raccolta e le cellule centrifugare a 200 xg e aspirare media. Risospendere le cellule in 1 ml di mezzo ES cellulare e contare le cellule.
   5. CES piastra su piastre di gelatina rivestite a densità di 3 x 10 ⁴ / cm ^2. Incubare a 37 ° C, 5% di CO ₂ per circa 2 giorni in cui i CES raggiungono circa il 90% confluenti. Cambiare la media di tutti i giorni.
   6. Quando CES sono 90% confluenti, ripetere i punti 1.2.2-1.2.5 per rimuovere completamente gli alimentatori MEF.
3. Indurre CPC differenziazione dalla formazione EB
   1. Preparare medio differenziazione seguito: 36 ml IMDM, 12 ml F12 di Ham, 2 mM L-glutammina, 0,34 ml BSA (7,5%), 0,25 ml N2, 0,5 ml B27, 50 mg / ml AA, e 0,45 mm 1-thioglycerol.
   2. Medio Aspirare dalle cellule e risciacquare con DPBS. Aspirare DPBS e aggiungere 0,4 ml 0,25% tripsina in un pozzetto di 6-pozzetti. Incubare a 37 ° C per 5 min.
   3. Aggiungere 1 ml di mezzo di differenziazione di cessare la reazione e la pipetta su e giù per disperdere gruppi di cellule in cellule singole.
   4. Centrifugare CES a 200 xg per 5 minuti e scartare il medium.
      1. Risospendere 1 x 10 ^{6 <}/ Sup> CES in 1 ml di mezzo di differenziazione. Contare le cellule, e coltura le cellule a partire distacco piatto Petri a una concentrazione di 1 x 10 ⁵ cellule / ml in terreno di differenziamento a 37 ° C per prima aggregazione EB.
   5. Due giorni dopo la formazione EB, trasferire EBs dai piatti a 50 ml provette. Spin a 200 g per 1 min. Rimuovere medie e risciacquare EBs con 10 ml DPBS senza Ca ²⁺ e Mg ^2+.
   6. Aspirare DPBS e aggiungere 1 ml 0,25% tripsina. Incubare a 37 ° C per 5 min. Aggiungere 4,5 ml di mezzo di differenziazione per arrestare la reazione. Pipettare su e giù per dissociarsi EB in cellule singole.
   7. Centrifugare le cellule a 200 xg per 5 min. Aspirare media e risospendere le cellule in 1 ml di mezzo di differenziazione.
   8. Contare le cellule, e diluire 2 x 10 ⁶ cellule per 1 x 10 ⁵ cellule / ml in terreno di differenziamento. Aggiungere VEGF Bmp4 e Activin A al mezzo a una concentrazione finale di 5 ng / ml, 0,8 ng / ml, e 5 ng / ml, rispettivamente. Culture le cellule in capsula di Petri per la seconda formazione EB a 37 ° C.
   9. 40 ore dopo la seconda formazione EB, trasferimento EBs a 50 ml provette. Risciacquare con DPBS una volta, dissociare EBs con 1 ml 0,25% tripsina a 37 ° C per 5 minuti. Pipettare su e giù per dissociarsi EB in cellule singole.
   10. Risospendere le cellule in Stempro-34 media con 5 ng / ml VEGF, 10 ng / ml bFGF e 12,5 ng FGF10 / ml. Piastra le cellule a 2 x 10 ⁵ / cm ² in piastre rivestite di gelatina. Cultura in 37 ° C incubatore per circa 32 ore prima di isolamento CPC.
4. Isolare mCPCs
   1. Aspirare il terreno e risciacquare con DPBS. Aggiungere 0,5 ml di 0,25% tripsina a piastre di coltura a 37 ° C per 5 min. Aggiungere 4,5 ml di mezzo di differenziazione per arrestare la reazione. Pipettare su e giù per dissociarsi EB in cellule singole. Raccogliere le cellule cellule centrifuga e risospendere in 2% FBS / PBS per FACS-purificazione.
   2. Eseguire CES indifferenziate sul sorter come controllo negativo. Modifica tensione per regolare scat avantiter (FSC) e side scatter (SSC) per selezionare la popolazione desiderata. Utilizzare avanti spargere contro scatter lato e altezza scatter in avanti rispetto a larghezza di escludere detriti e farsetto. Nel sub-popolazione selezionata, in base alla distribuzione dei controlli ESC, elaborare un cancello di YFP positivo sulla istogramma per eliminare autofluorescenza cellule. Raccogliere YFP ⁺ CPC da YFP ⁺ gating.
   3. Piastra i CPC purificati (cellule YFP ⁺⁾ a 6 pozzetti con terreno di differenziamento (1.3.1). Cultura ulteriori 3-5 giorni a 37 ° C per la differenziazione del CPC in cardiomiociti e SMC.

2. Determinazione dei embrionale umano CPC dal CES umani

1. Preparare Alimentatori
   1. Preparare topo fibroblasti embrionali (MEF) strato alimentatore come descritto sopra ad una densità di 2 x 10 ⁴ / cm ^2.
2. Mantenere CES umani
   1. Mantenere Isl1 umana: cre; pCAG-flox-STOP-flox-GFP o RFP CES di routine su MEF utilizzando media hESC regolare (Knockout DMEM / F-12 385 ml, Knockout SR 100 ml, 2 mM L-glutammina, 0.1 NEAA mM, 0,1 mm β-mercaptoetanolo, 10 ng / ml FGF base). Prima di differenziazione cardiaca, trasferire CES umani in alimentatore condizione libera per almeno 2 passaggi.
3. Preparare CES umani in condizioni di alimentazione gratuito
   1. Preparare piastre rivestite per la cultura CES umani.
      1. Scongelare matrigel a 4 ° C durante la notte. Mettere un tubo da 50 ml su ghiaccio e aggiungere 30 ml fredda terreno DMEM / F12 nel tubo.
      2. Aggiungere 1 ml matrigel nel mezzo freddo e mescolare bene. Aggiungere 1 ml di freddo Matrigel-DMEM / 12 di media in un pozzo di 6-pozzetti o 5 ml in un piatto di 10 cm.
      3. Lascia piatti / stoviglie a 4 ° C durante la notte o temperatura ambiente per 2 ore. Aspirare il terreno prima dell'uso.
   2. Split CES umane sulle piastre: Aspirare il terreno dalla piastra MEF e sciacquare CES umani con DPBS. Poi aggiungere 1 ml dispasi (1 mg / ml) in un pozzetto di piastra da 6 pozzetti. Incubare le cellule in 37 ° Cincubatrice fino bordi delle colonie cominciano a staccarsi.
   3. Rimuovere la soluzione dispasi. Risciacquare con DPBS due volte, quindi aggiungere 2,5 ml / per medie dimensioni, ben mTeSR o medio MEF condizionata alla piastra.
   4. Raschiare le cellule con un raschietto cellulare e con attenzione pipettare su e giù per rompere le colonie CES umani in piccoli grumi.
   5. Trasferire i ciuffi ESC e diluire 1: 3 nelle piastre rivestite.
   6. Aggiungere 2 ml / e medio mTeSR o medio MEF condizionata e cambiare media giornaliera.
   7. Cultura CES umani in mTeSR medio o medio MEF condizionata su piastre rivestite per almeno 2 passaggi.
4. Indurre CPC differenziazione dalla CES umani
   1. Quando le cellule sono ~ 90% confluenti, aspirare il terreno e risciacquare con DPBS. Poi incubare le hESC a 0,5 mg / ml dispasi a 37 ° C per 20 min.
   2. Sciacquare le hESC con DPBS due volte, rimuovere le cellule dai piatti con sollevatore cellulare, quindi risospendere morsetti cellulari in terreno di differenziamento (DMEM / F12 contenente 18% FBS, 0.1 NEAA mm, 2 mmL-glutammina, 0,1 mM β-mercaptoetanolo e 50 ug / ml acido ascorbico).
   3. Trasferire le cellule in piastre di fissaggio ultra-bassi 6 pozzetti per la formazione EB.
   4. Cambiare medio differenziazione giorno successivo.
   5. Sostituire media ogni 3 giorni e mantenere EBs in coltura in sospensione.
5. Isolare HCPCS
   1. Raccogliere EBs entro e non oltre il giorno 9 di differenziazione per l'isolamento CPC umana.
   2. Aspirare il terreno e lavare EBs con DPBS due volte. Aggiungere 0,5 ml di 0,25% tripsina in ciascun pozzetto di piastre di coltura 6 pozzetti a 37 ° C per 5 min.
   3. Aggiungere uguale volume di terreno di differenziamento per arrestare la reazione. Pipettare su e giù per dissociarsi EB in cellule singole. Raccogliere le cellule centrifugare a 200 xg per 5 minuti e risospendere le cellule in 2% FBS / DPBS. Celle filtranti con 40 micron filtro cellulare e FACS purificato la RFP ⁺ cellule CPC come descritto in 1.4.3.
   4. Piatto allineati HCPCS su piastre geltin rivestite. HCPCS culturali in media di differenziazione per 7Giorni -9 a differenziarsi in cellule muscolari lisce e cardiomiociti. 7 giorni dopo la placcatura, cultura cellule con 5% Knockout SR in terreno DMEM / F12 differenziato.

Risultati

Il protocollo mostra derivazione del CPC da diverse linee di cellule ES. CES sono aggregati per formare EB di differenziarsi in CPC. CES sono regolarmente mantenuti su alimentatori MEF (Figura 1A, F) e alimentatori vengono rimossi prima di differenziazione. Su aggregazione dei CES in EBs in terreno di differenziamento (Figura 1B, G), il secondo EBs formati vengono trattati con Bmp4 e Activin A per migliorare la differenziazione mesoderma in linee cellulari di topo (Figura 1C).

Discussione

This protocol combines a method using growth factors to guide mESCs differentiation and spontaneous differentiation of human ESCs into CPCs. CPC lineage marked with fluorescent reporter is used to efficiently identify and isolate CPCs by FACS. The FACS-purified CPCs retain the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle, and endothelial cells and have a comparable expression profile to the in vivo cells. Thus, these CPCs can serve as a great resource for cell based heart therapy because of their ability ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
FBS	Thermo scentific	SH30070.03E
Knockout SR	Life technology	10828028
Knockout DMEM	Life technology	10829018
DMEM	Life technology	11965118
NEAA	Life technology	11140050
GlutaMAX	Life technology	35050061
N2	Life technology	17502048
B27	Life technology	12587010
Ham’s F12	Life technology	11765062
IMDM	Life technology	12440061
Pen/Strep	Life technology	15140122
Pyruvate	Life technology	11360070
Dispase	Life technology	17105041
Stempro-34	Life technology	10639011
DMEM/F12	Life technology	11330032
BSA	Life technology	15260037
Trypsin	Life technology	25200056
Ascobic Acid	Sigma	A5960
1-Thioglycerol	Sigma	M1753
2-Mercaptoethanol	Sigma	M3148
VEGF	R&D	293-VE
Bmp4	R&D	314-BP
ActivinA	R&D	338-AC
bFgf	R&D	233-FB
Fgf10	R&D	345-FG
mTeSR	Stemcell technologies	5850
Matrigel	BD Biosciences	354277