In vivo e in vitro Allevamento di Nematodi entomopatogeni (Steinernematidae e Heterorhabditidae)

Riepilogo

L'obiettivo di questa presentazione è quello di dimostrare in vivo e in vitro tecniche per l'allevamento di nematodi entomopatogeni. Metodi in vivo considerano l'allevamento di questi nematodi con un host insetto, mentre i metodi in vitro utilizzano rich media agar.

Abstract

Nematodi entomopatogeni (EPN) (Steinernematidae e Heterorhabditidae) hanno una partnership mutualistico con Gram-negativi Gamma-Proteobacteria della famiglia Enterobacteriaceae batteri. Xenorhabdus sono associati con steinernematids nematodi, mentre Photorhabdus sono simbionti di heterorhabditids. Insieme nematodi e batteri formano un complesso potente insetticida che uccide una vasta gamma di specie di insetti in una intima e specifico. Qui, dimostriamo in vivo e in vitro tecniche comunemente utilizzate nell'allevamento di questi nematodi in condizioni di laboratorio. Inoltre, queste tecniche rappresentano passaggi fondamentali per la creazione di successo di culture EPN e costituiscono anche la base per altri test biologici che utilizzano questi organismi per la ricerca. La produzione di aposymbiotic nematodi (senza simbionti) è spesso fondamentale per un approfondito e approccio multiforme allo studio della simbiosi. Questoprotocollo non richiede l'aggiunta di antibiotici e può essere realizzato in un breve lasso di tempo con attrezzature di laboratorio standard. Nematodi prodotti in questo modo sono relativamente robusti, anche se la loro sopravvivenza in deposito possono variare a seconda delle specie utilizzate. Le tecniche descritti in questa presentazione corrispondono a quelli descritti da vari autori e raffinato dal Laboratorio di P. Archivio, University of Arizona (Tucson, AZ, USA). Queste tecniche sono distinti dal corpo di tecniche che vengono utilizzati nella produzione di massa di tali organismi a fini di gestione nocivo.

Introduzione

Nematodi entomopatogeni (EPN) Steinernema e Heterorhabditis spp. (Steinernematidae, Heterorhabditidae) e dei loro simbionti batterici, Xenorhabdus e Photorhabdus spp (Enterobacteriaceae) sono considerati un modello emergente di animali terrestri-microbici relazioni simbiotiche ^2-4,6,10,19. Xenorhabdus e Photorhabdus spp. sono nutrito come simbionti nell'intestino della sola fase di vita libera dei nematodi, noto anche come il giovanile infettiva (IJ) o stadio 3 ^° infettivo giovanile ^8,10,13. La coppia batterio-nematode è patogeno per una vasta gamma di insetti ed è stato implementato con successo in programmi di lotta biologica e lotta integrata in tutto il mondo ^6,8.

Qui mostriamo una selezione di in vivo e in vitro tecniche che sono spesso esercitati per l'allevamento di EPN in condizioni di laboratorio. In metodi in vivo contemplano un host insetto per l'allevamento dei nematodi. Di solito, stadi immaturi di vari ordini di insetti (ad esempio Lepidotteri, Coleotteri, Ditteri, ecc.) Sono considerati host adatti. In vivo i metodi sono di solito presi in considerazione per la manutenzione delle culture nematodi in laboratorio. Questo metodo potrebbe non essere adatto se si considera la produzione di massa dei nematodi. Grandi quantità di insetti ospiti possono essere richiesti a tale scopo chiedendo più tempo e costi supplementari connesse con l'allevamento degli insetti.

Nematodi entomopatogeni possono anche essere coltivate in vitro su diversi supporti. A seconda l'obiettivo dello studio, metodi in vitro può o prendere in considerazione l'incorporazione dei batteri simbiotici nei media. In questa presentazione, descriviamo due metodi comunemente utilizzati per la propagazione della EPN. Gli ingredienti dei media forniscono una fonte di nutrienti per il batterio simbiotico unMetodi in vitro trovare una fonte di steroli per i nematodi. offrono il vantaggio l'allevamento di EPN senza un host insetto.

In origine, molti dei media in vitro sviluppati sono stati utilizzati per la moltiplicazione di EPN quando adatti insetti ospiti non sono disponibili. Tuttavia, negli ultimi anni, in vitro metodi di allevamento sono diventati largamente impiegato nel campo della ricerca al fine di comprendere il rapporto mutualistico tra EPN ed i loro batteri simbionti ^17,19.

Le tecniche descritti in questa presentazione corrispondono a quelli descritti da vari autori e raffinato dal laboratorio Stock, University of Arizona (Tucson, AZ, USA). Queste tecniche sono distinti dal corpo di tecniche che vengono utilizzati nella produzione di massa di tali organismi a fini di gestione nocivo.

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Protocollo

1 In vivo Allevamento di Nematodi entomopatogeni con i loro batteri Symboitic

1. Invertire una capsula di Petri in plastica 100 x 15 mm e collocare due dischi di carta da filtro (90 mm) nel coperchio del piatto.
2. Distribuire uniformemente 1 ml della sospensione acqua IJ (larve infettive) (ad una concentrazione di 1.000-2.000 IJ / ml) sulla carta da filtro.
   NOTA: IJs non devono essere sterilizzati in superficie.
3. Aggiungere 10 ultimo instar larve della maggior waxmoth Galleria mellonella al piatto. L'obiettivo è quello di fornire circa 100-200 IJs / larva.
4. Coprire il coperchio con la parte inferiore della scatola di Petri (Figura 1) ed etichettare la piastra di Petri. Indicare le seguenti informazioni: nematode nome della specie (se noto); isolare il codice / designazione; trappola infezione data è stata impostata.
5. Porre la capsula all'interno di un sacchetto di plastica sigillato liberamente (per conservare l'umidità) e tenerlo al buio sia a temperatura ambiente o in un incubatore tra i 20-25 ° C. Controllare i piatti tutti i giorni
   NOTA: L'oscurità facilita l'infezione da nematodi, in quanto imita le condizioni naturali di infezione nel terreno.
6. Dopo 3-5 giorni, rimuovere i cadaveri con segni di infezione da nematodi ad una modifica trappola Bianco ^7.
   NOTA: Se i cadaveri odore putrido, questo può essere un'indicazione che la coltura non ha avuto successo e / o c'era contaminazione. Impostare una nuova camera di infezione con un nuovo lotto di nematodi e insetti.

2 in vitro Allevamento di Nematodi entomopatogeni con i loro batteri simbionti

1. Fegato-rene Agar Metodo di ^9,19
   1. Tritate il fegato e reni in piccoli pezzi (da 2 cm ³ o più piccoli) e mettere in un frullatore con NaCl, agar e 300 ml di acqua e mescolare fino a quando la carne diventa una poltiglia liquida, pasta spessa o purea. Poi, il trasferimento miscela di un pallone da 1 L Erlenmeyer.
   2. Aggiungere gli ultimi 200 ml di acqua al vaso frullatore e decantare eventuali supporti rimasti nelBeuta. Autoclave per 15 minuti a 121 ° C. Dopo la sterilizzazione in autoclave agar lasciare raffreddare a toccare prima di versare.
      NOTA: dispensazione dei media non è raccomandato perché questo mezzo tende ad avere pezzi di carne.
   3. Versare ~ 20 ml di agar su 5 (o 6) cm piastre di Petri agitando la mano o agitando la beuta tra versa per un supporto più omogeneo. Lasciare agar per solidificare e piatti conservare a 4 ° C fino al momento
      NOTA: Utilizzare una spatola di metallo-sterilizzati fiamma per rompere tutti i grandi pezzi di carne versato nella piastra di Petri.
2. Lipid Agar Metodo ^9,19
   1. Preparare mezzo lipidico agar mescolando brodo nutriente, estratto di agar e il lievito e mescolare versare in un pallone da 2 L Erlenmeyer. Aggiungere acqua distillata H ₂ O e MgCl ₂ • 6H ₂ O e autoclave per 15 minuti a 121 ° C.
   2. Aggiungere miscela sterile di olio e di sciroppo di mais mais mix e mescolare o agitare energicamente e spesso per disperdere goccioline di olio in modo uniforme.
      NOTA: Sterilizzare olio di mais e lo sciroppo mettendo il volume necessario in un UV cross-linker. L'olio non si dissolvono nel liquido, ma assicurarsi che sia in minuscole goccioline.
   3. Versare ~ 20 ml di agar su un 5 (o 6) cm piastre di Petri e lasciare solidificare l'agar e piatti conservare a 4 ° C fino al momento dell'uso.
   4. Streak il batteri simbionti desiderato sulla piastra di agar lipidi e incubare le piastre a 28 ° C per 24-48 ore.
      NOTA: Stendere 100-200 ml di una notte (12-16 ore) LB sottocultura.
   5. Il giorno dopo, aggiungere circa 0,4 ml di sospensione sterile superficie nematode (uova o larve infettive) e incubare le piastre a temperatura ambiente al buio o in un incubatore a 22 ± 3 ° C.
      NOTA: Non aggiungere più di 0,4 ml di sospensione nematode come si può creare un ambiente eccessivamente umido che è sfavorevole alla crescita nematode.
   6. Monitorare culture quotidiana. Le culture dovrebbero produrre una nuova generazione di IJs in circa 12 giorni (Figura 2).
   7. Trasferire piatto fondo con agar quando nematodi sono visti strisciare i lati del piatto (Figura 3A) ad una trappola Bianco modificata (vedi Orozco et al. ¹²⁾ per raccogliere IJs (Figura 3B). Eseguire questo passaggio sotto una cappa a flusso laminare per ridurre la contaminazione dei media.
   8. Raccogliere IJs dalla trappola Bianco modificato sulla nascita e risciacquare sospensione IJ per rimuovere eventuali detriti mezzo. Conservare IJ in acqua distillata sterilizzata a 10 ° C (in un incubatore a freddo-temperatura o cella frigorifera) o utilizzare immediatamente, se necessario.
      NOTA: A seconda l'obiettivo dello studio, il seme piatti sia con nematodi simbionti-colonizzati o aposymbiotic.

3. in vitro allevamento di Aposymbiotic (Symbiont-gratuito) Nematodi entomopatogeni

1. Infettare 10-20 G. mellonella larve con IJs delle specie di nematodi desiderati (vedi capitolo 1). Dopo 3 o 4 giorni (in questo momento IJs avrebbe maturatoagli adulti di prima generazione) raccogliere cadaveri.
   NOTA: Il tempo a scadenza e numero di femmine necessari per ottenere un adeguato numero di uova può variare da specie. Infettare più G. mellonella larve se necessario e iniziare dissezioni già alla 48 ore dopo l'infezione per valutare se sono in fase di sviluppo destra.
2. Mettete ogni cadavere singolarmente in una capsula di Petri con una soluzione salina (tampone M9 ^18). Sezionare un cadavere tirando la sua testa con una pinza sottile punta.
3. Raccogliere almeno 20 gravido (con le uova all'interno) femmine con un ago sottile (L-forma preferibilmente) e metterli in un vetro da orologio contenente 10 ml di tampone M9 (Figura 4A).
4. Preparare una soluzione axenizing considerando i seguenti ingredienti: 6,75 ml di acqua distillata, 1,25 ml 5 N NaOH, e 2,25 ml di soluzione di candeggina disponibile in commercio diluito al 3% di ipoclorito.
   NOTA: NaOH è una soluzione di base-guanti, occhiali e altro adeguato di protezioneabbigliamento deve essere indossato.
   NOTA: Preparare soluzione axenizing fresco ogni volta, come candeggina degrada alla luce. Preparare diversi lotti di soluzione axenizing ed eseguire la sterilizzazione di superficie e la raccolta delle uova in più vetri da orologio.
5. Risciacquare femmine almeno tre volte con riempimento del buffer M9 vetro d'orologio con soluzione tampone e succhiare buffer con una pipetta. Assicurarsi che le femmine rimangono nel vetro d'orologio. Ripetere questa operazione altre due volte.
6. Aggiungere immediatamente la soluzione axenizing e permettono le femmine di rimanere in questa soluzione per non più di 10-15 minuti. Osservare i tessuti nematode cominciano a disintegrarsi, mentre le uova (che sono resistenti alla soluzione axenizing) rimangono intatti.
7. Interrompere manualmente corpi femminili per accelerare il processo, tagliandoli con un ago o un bisturi (Figura 4B, C). Rimuovere le uova da loro pipettando in provette da 1,5 ml microcentrifuga, evitando l'aggiunta di qualsiasi tessuto non disciolto.
   NOTA: Utilizzare come meventuali microprovette se necessario per raccogliere le uova e lavorare rapidamente, come la vitalità delle uova diminuisce per un periodo prolungato di esposizione alla soluzione di axenizing.
8. Tubi vortex per 15 secondi utilizzando l'impostazione "alta velocità" per rimuovere ulteriormente i tessuti nematodi attaccati alle uova. In alternativa, se un vortice non è disponibile, pipettare su e giù per le soluzioni più volte.
9. Uova pellet di centrifugazione a 18.000 g per circa 2 min. Aumentare la velocità se le uova non fanno sufficientemente pellet. Rimuovere la soluzione axenizing e risciacquare due volte riempiendo la provetta con acqua distillata sterile e centrifugare ancora una volta a 900 xg per 1 min.
10. Dopo l'ultimo lavaggio, risospendere le uova in 300-500 ml di acqua distillata sterile e metterli in una sterile 3 centimetri scatola di Petri o vetro da orologio sterilizzati. Ricordate che le uova sono ormai sterilizzato superficie, in modo da utilizzare pipette sterili e / o suggerimenti pippetter e acqua per mantenere la pulizia delle uova.
11. Esaminare le uova sotto un microscopio da dissezione (30-50X ingrandimento) per confermare che sono intatti (Figura 4D) e trasferirli in una piastra 5 cm e agar fegato-rene (vedere paragrafo 2.1)
    NOTA: Non aggiungere più di 400 microlitri della sospensione uovo sulle piastre come farà l'agar eccessivamente bagnato.
12. Le targhette di identificazione con le informazioni appropriate e memorizzarli in posizione verticale al buio a 28 ° C. Schiusa delle uova dovrebbe essere evidente durante la notte.
    NOTA: L'acqua può condensare sul coperchio del piatto ma evapora dopo 1 o 2 giorni. A questo punto, porre il recipiente in sacchetto di plastica per trattenere l'umidità del agar ed evitare la sua essiccazione.
13. Osservare piatti periodicamente e scartare tutti i piatti che mostrano segni di contaminazione batterica o fungina. Una volta IJs sono visti migrare il muro della capsula di Petri, togliere il coperchio e trasferire il piatto fondo con agar ad una modifica trappola Bianco ^12. Considerare condizioni sterili quando si trasferisce il piatto nel Modified trappola bianco per evitare la contaminazione dei mezzi esposti.
14. Continua il monitoraggio delle trappole bianche e raccolto IJ, se necessario.
    NOTA: nematodi Aposymbiotic continueranno a migrare in acqua della trappola Bianca per molti giorni e addirittura settimane.

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Risultati

Il metodo di allevamento in vivo utilizza insetti vivi come host per la crescita e la riproduzione dei nematodi. Camere di infezione sono un metodo efficiente per esporre insetti IJs. Questa è l'unica fase del ciclo di vita dei nematodi 'che i vettori simbionti batterici da un insetto host all'altro. Figura 1 mostra il set up per una camera un'infezione così come i materiali necessari per costruire questa camera. In vitro metodi di allevamento consentono EPN a crescer...

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Discussione

Utilizzando un ospite adatto è un fattore chiave per il successo in allevamento vivo di EPN. Di solito, sia steinernematids e heterorhabditids possono riprodursi e completare il loro ciclo di vita in larve della maggiore tarma della cera, Galleria mellonella (Lepidoptera: Pyralidae). Tuttavia, altre specie di insetti provenienti da diverse famiglie e / o gli ordini possono essere considerati. Alcune delle specie di nematodi attualmente descritte sono noti per avere specificità per un partico...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
For In vivo Infections
100 x 15 Petri dishes	VWR	25384-088
Filter paper, 9 cm grade 1 cellulose	Whatman/VWR	28450-081	Grade 1 filter paper recommended
Insect hosts	Timberline	http://www.timberlinefisheries.com/ProductDetails.asp?ProductCode=WAXLG	Galleria mellonella are recommended
For Liver-kidney Agar (for 500 ml)
60 x 15 mm Petri dishes	VWR	25384-092
Beef liver, 50 g	Locally sourced; butcher or supermarket		Remaining may be stored frozen and thawed for future use
Beef kidney, 50 g	Locally sourced; butcher or supermarket		Remaining may be stored frozen and thawed for future use
Sodium chloride 2.5 g (0.5% final concentration)	Acros/VWR	200002-434	any research grade NaCl can be used
Agar, 7.5 g (1.5% agar, final concentration)	HiMedia/VWR	95026-642	any media grade agar can be used
500 ml distilled H2O
For Lipid Agar (for 1 L)
100 x 15 Petri dishes	VWR	25384-088
Nutrient broth, 8 g	BD/VWR	90002-660
Yeast extract, 5 g	EMD/VWR	EM1.03753.0500
Magnesium chloride hexahydrate 10 ml (0.2 g/ml)	EMD/VWR	EM-MX0045-1
Corn oil, 4 ml	Any brand	Locally source; supermarket	Any brand of corn oil can be used
Corn syrup, 96 ml combine 7 ml corn syrup in 89 ml heated H2O and swirl for homogeneity	Karo	Locally sourced; supermarket
Agar, 15 g	HiMedia/VWR	95026-642	any media grade agar can be used
Distilled H2O, 890 ml