Live-imaging del<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupa Eye

Riepilogo

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

Abstract

Processi di sviluppo inerenti pupa Drosophila possono spostare e distorcere l'epitelio occhio in modo tale da rendere il comportamento delle cellule individuali difficili da rintracciare durante l'imaging cellulare dal vivo. Questi processi comprendono: la rotazione della retina, la crescita cellulare e la circolazione organismal. Inoltre, irregolarità nella topologia dell'epitelio, compresi urti sottili e pieghe spesso introdotti come la pupa è preparato per l'imaging, rendono impegnativo per acquisire immagini in-fuoco di più di qualche ommatidi in un unico piano focale. Il flusso di lavoro delineato qui rimedi questi problemi, consentendo un facile analisi dei processi cellulari durante lo sviluppo di Drosophila pupa occhio. Pupe Opportunamente-messa in scena sono disposti in una piattaforma di imaging che può essere facilmente montato nella maggior parte dei laboratori Ubiquitin-DE-caderina. GFP e GMR-GAL4 -driven UAS-α-catenina: GFP sono utilizzati per visualizzare i bordi delle celle nell'epitelio dell'occhio ^{1 -3.} Dopo deconvoluzione èapplicata alle immagini catturate fluorescenti a più piani focali, immagini massimi proiezione vengono generate per ogni punto di tempo e migliorate utilizzando un software di editing delle immagini. Algoritmi di allineamento vengono utilizzati per stabilizzare rapidamente il movimento superfluo, rendendo il comportamento delle cellule individuali più facile tenere traccia.

Introduzione

Il composto Drosophila occhio è caratterizzato dalla disposizione dei suoi stereotipo ~ 750 ommatidi separati da un reticolo a nido d'ape di cellule pigmentate accessorie ^4,5. Queste cellule del pigmento sono modellati da una combinazione coordinata di eventi: i movimenti delle cellule locali, la crescita delle cellule, cambiamenti di forma delle cellule e l'apoptosi. Visualizzazione diretta di questo epitelio permette di studiare i meccanismi molecolari alla base di questi eventi in un contesto tridimensionale fisiologicamente rilevanti e imperturbabile.

Diversamente dai precedenti protocolli ^6,7, la tecnica qui delineato incorpora un metodo efficace per stabilizzare il movimento del tessuto estraneo che non può essere disaccoppiato dal processo di imaging. Questo metodo migliora studi di comportamento delle cellule in via di sviluppo Drosophila pupa occhio epitelio - un tessuto che cresce, ruota e si sposta nel corso di imaging. Inoltre, il movimento di stabilizzazione technique dedescritto qui sarà utile per studiare le cellule in altri contesti in cui si verifica il movimento estraneo.

Per visualizzare i bordi delle celle nel campo della retina Drosophila, linee mosca transgenici sono stati generati che esprimono ubi-DE-caderina: GFP e UAS-α-catenina: GFP sotto il controllo del driver specifico-eye GMR-GAL4 ^1-3. L'uso di due marcatori di membrana GFP-tag permette la visualizzazione dei bordi delle celle a luce minore intensità. Questo riduce al minimo i danni ai tessuti e photobleaching esposizione ripetuta a lunghezze d'onda ad alta energia, che consente una maggiore frame rate e la durata del filmato. Per migliorare l'efficacia dei transgeni RNAi, UAS-DCR-2 è stato anche inserito in una seconda linea di volo ^8.

In un terzo aggiornamento da protocolli precedenti, un impianto di imaging semplice che può essere facilmente montato in maggior parte dei laboratori è descritto. Questo apparecchio evita la necessità di avere un dell'imaging r specializzataig generato da 'officina' di un'università o di un servizio simile. Questo impianto di imaging è simile a quella utilizzata per immagine altri tessuti pupa ^9,10.

Presentato qui è un semplice protocollo live-cell imaging che può essere utilizzato per valutare direttamente gli eventi morfogenetici che contribuiscono a patterning occhio da ~ 17-42 ore dopo la formazione puparium (hr APF). In particolare, questo protocollo permette di determinare le conseguenze di modificare l'espressione genica durante lo sviluppo pupa.

Protocollo

La figura 3 mostra una sintesi della procedura sperimentale.

1. Preparazione del tessuto

1. Per determinare le conseguenze di espressione modificata di un gene di interesse, impostare il seguente croce in duplice copia e mantenere a 25 ° C: UAS-transgene (maschi) X GMR-GAL4; UAS-α-cat: GFP, ubi-DE-Cad: GFP; + / SM5-TM6b (femmine vergini) NOTA: Per ottenere il controllo incrociati tessuto UAS-lacZ maschi a GMR-GAL4; UAS-α-cat: GFP, ubi-DE-Cad: femmine GFP. β-galattosidasi genera difetti nel comportamento cellulare nella retina.
2. Per migliorare l'efficacia dei transgeni RNAi, croce UAS-RNAi maschi a GMR-GAL4, UAS-DCR-2; UAS-α-cat: GFP, ubi-DE-Cad: GFP; + / SM5-TM6b femmine vergini.
   NOTA: i difetti occasionali nel comportamento delle cellule in retine esprimono ectopica DCR-2 sono stati osservati (dati non riportati). La vigilanza è consigliata se si utilizza questo metodo.
3. Seletto bianco pre-pupe di genotipi appropriati e posto in provette da 1,5 ml microcentrifuga. Se le pupe esprimere DCR-2, selezionare pupe maschio o femmina: espressione di UAS-DCR-2, un inserto sul cromosoma X, è più forte nei maschi. Pupe dovrebbe essere sessuato a 0 hr APF prima pigmentazione caso pupa - gonadi di maschi sono visibili come grossi globi trasparenti ai lati laterali della pupa (circa un terzo del posteriore).
4. Incubare microprovette contenenti pupe, in una plastica tip-box pulito a 25 ° C. Per prevenire l'essiccamento del luogo pupe a 10 cm ² pezzo di tessuto, imbevuto di acqua distillata, nella punta-box.
   NOTA: se l'umidità nella punta-box diventa troppo alto il caso pupa può diventare molliccia e difficile da sezionare in fasi successive.
5. Incubare per momento opportuno. Per catturare i comportamenti cellulari associati con patterning l'occhio, preparare pupe per l'imaging a circa 17 ore APF, 20 hr APF o 24 ore APF. Vedi Rappresentante Risultati per ulteriori discussioni su quando i comportamenti di cellule specifiche sono meglio rispettati.
6. Posizionare un pezzo di nastro biadesivo fresco su un piatto dissezione sylgard nero. Posizionare un lato pupa, dorsale in su, con la testa della pupa aderito al nastro biadesivo (Figura 1A) .Try a non aderire toracica e addominale regioni della pupa al nastro biadesivo. Con una pinza con attenzione sollevare e rimuovere il opercolo per esporre la testa pupa. Strappo lungo il lato del caso pupa per esporre l'area intorno a un occhio.
7. Rimuovere delicatamente la pupa del nastro adesivo. Se la pupa rimane aderente, applicare una piccola quantità di acqua distillata alla giunzione tra il caso pupa e il nastro di indebolire l'adesione.

2. Montaggio

1. Costruire un piccolo 15 millimetri ² telaio da carta assorbente e un buco nel middlethat 5,5 mm di diametro (Figura 1B). Immergere in acqua distillata e posto inil centro di un vetrino da microscopio. Usando una siringa da 30 cc, spremere un anello uniforme di vaselina per circondare la cornice di carta assorbente. Assicurarsi che l'anello vaselina è marginalmente superiore alla larghezza della pupa e che il diametro dell'anello è leggermente inferiore alla larghezza di un vetrino.
2. Aggiungere una piccola goccia di vaselina direttamente sul vetrino, nel foro punzonato nella carta assorbente (Figura 1C) Accuratamente organizzare la pupa, sul suo lato, sostenuto dal tallone vaselina (Figura 1D).
3. Posizionare un coprioggetto sulla parte superiore dell'anello di vaselina in modo che viene a contatto con l'epitelio sopra neuroepitelio occhio (Figura 1D). Comprimere delicatamente la preparazione per sigillare il vetrino contro la vaselina e generare una piccola superficie di contatto piatta tra la regione occhio pupa e il vetrino.

3. imaging di fluorescenza

1. Immagine preparazione pupa con unmicroscopio a fluorescenza. Ogni 7 min cattura sezioni seriali attraverso il dominio apicale neuroepitelio dell'occhio, nella regione delle giunzioni adherens.
   NOTA: a) sezioni seriali appropriati sono di solito 4-5 per z-stack composto da 0,2 micron z-passi. b) Irregolarità nella topologia dell'epitelio, compresi urti lievi e pieghe, può rendere difficile per acquisire immagini a fuoco di grandi regioni di tessuto. Mentre l'imaging, si può trovare una parte di una zona di interesse per essere a fuoco, e una regione confinante di essere out-of-focus. Tra cui una piccola goccia di acqua distillata tra l'occhio e la pupa coprioggetto può eliminare alcune pieghe del tessuto acuti ma non la topologia caratteristico leggermente irregolare delle prime fasi della pupa morfogenesi dell'occhio. In questi casi sovracampionamento tessuto estendendo la z-stack fino a fuoco fette vengono acquisiti per l'intero settore. c) Acquisizione di sezioni seriali ogni 7 minuti dovrebbe consentire vivo imaging per 3 a 4 ore, senza una significativa reduction nell'intensità di fluorescenza GFP che possono compromettere la qualità dell'immagine. Intervalli di tempo più brevi possono ridurre il tempo totale di imaging.
2. Proseguire l'imaging per 3 a 4 ore. Non utilizzare un messa a fuoco automatica e funzione di tempo che è disponibile su molti microscopi a fluorescenza in quanto la crescita pupa e pompaggio del emolinfa sposta la posizione della retina e vigile rifocalizzazione è necessaria ogni 14-21 min. NOTA che l'imaging più di 4 ore può rallentare o stallo morfogenesi dell'occhio.
3. Utilizzare software appropriato deconvoluzione per ridurre sfondo e migliorare il contrasto delle immagini della sezione seriale. Per ogni file z-stack, eseguire il seguente in software LAS AF (vedi Tabella dei Materiali): Selezionare il pannello Strumenti, selezionare 3D Deconvoluzione e fare clic su Applica.
4. Generare immagini un massimo di proiezione (MP) per ogni file di stack deconvoluto: Selezionare il pannello Strumenti, selezionare Proiezione 3D e fare clic su Applica.
   NOTA: L'algoritmo Maximum Projection potrebbe non riuscire a generare un uniformely immagine in-focus per il tessuto che è stato sovracampionato. Una tecnica per affilare le regioni out-of-focus è descritto al punto 5.2.

4. Post-Imaging pupa Rescue e fenotipo di verifica

1. Per affrontare se artefatti sono stati introdotti o la pupa danneggiato durante l'imaging, rimuovere con attenzione la pupa del rig immagini: con pinze rimuovere il vetrino e trasferire la pupa di una fiala pulita di cibo. Conservare a temperatura ambiente o 25 ° C fino a quando la mosca adulta emerge.
2. Esaminare attentamente il fenotipo dell'occhio adulti e confrontare agli occhi di mosche adulte emergono dalla mosca croce originale.

Elaborazione 5. Immagine

1. Automatico Allineamento Immagine:
   NOTA: Il tessuto vivo Drosophila si sposterà e crescere durante tutto il processo di imaging. Di conseguenza, i centri di immagini riuniti in momenti successivi non possono corrispondere allo stesso punto nel tessuto Drosophila. Inoltre laintero disco retina ruota di circa 30 ° tra ~ 21 e 23 hr APF. Per evidenziare i comportamenti delle singole celle e ridurre le distrazioni causate dalla crescita organismal, allineare ogni deputato image.While questo può essere eseguito manualmente, il software di editing delle immagini qui utilizzato (vedi Tabella dei Materiali) ha algoritmi incorporati che possono accelerare il processo.
   1. Dalla scheda File del menu principale, script aperti e selezionare i file di carico in Stack.
   2. Importare i file immagine MP nel pannello Livelli di carico e selezionare OK. Assicurarsi che il tentativo di allineare automaticamente l'opzione Images non è selezionata.
      NOTA: Se questa opzione è selezionata, il software può utilizzare un algoritmo di allineamento che distorce i dati di immagine.
   3. Una volta che tutti i file MP hanno caricato nel riquadro Layers, assicurarsi che tutte le immagini sono in ordine cronologico tale che il punto di tempo prima è in cima alla pila dei livelli. Se i livelli non sono nell'ordine corretto, trascinarli fino a quando non sono ordinatecorrettamente.
   4. Selezionare Allineamento automatico livelli dalla scheda Modifica del menu principale. Scegli riposizionare e fare clic su OK.
   5. Se l'algoritmo Auto-Align non orientare i fotogrammi di un punto di riferimento rilevante, apportare piccole modifiche utilizzando lo strumento Sposta.
2. Affilatura Composite:
   NOTA: Out-of-focus regioni di un'immagine iniziale MP possono essere affilate da 'coltivazione' della corrispondente pila deconvoluto nel software LAS AF. Ritaglio di un file di stack permette di limitare manualmente l'intervallo di un z-stack che viene sottoposta all'algoritmo massima proiezione.
   1. Individuare la funzione Ritaglia nel pannello Strumenti (nella scheda Process). Limitare manualmente le fette iniziali e finali tale da colpire solo la cinghia aderenza all'interno della regione inizialmente fuori fuoco. Fare clic su Applica per generare un nuovo file di stack che è ottimizzato per questa regione.
   2. Generare un nuovo proiezione massima per lo stack ottimizzato a livello locale e l'esportazione come file TIFF.
   3. In the software di editing delle immagini (vedi Tabella dei Materiali), script aperti (situati nella scheda File del menu principale) e selezionare Carica file in Stack.
   4. Importare il file immagine MP iniziale e file MP ottimizzato localmente per un particolare punto di tempo nel pannello Livelli di carico e selezionare OK. Assicurarsi che il tentativo di allineare automaticamente l'opzione Images non è selezionata.
   5. Selezionare entrambi gli strati negli strati riquadro e quindi selezionare Fusione automatica livelli (che si trova nella scheda Modifica del menu principale) per mascherare automaticamente le regioni competenti delle due immagini, ottenendo una uniforme a fuoco campo retinico. Salva questa immagine composita come file TIFF.
   6. Ripetere i passaggi 5.2.1 tramite 5.2.5 per tutte le immagini non ottimali MP.
3. Ulteriori Regolazioni: ruotare, ritagliare e regolare i livelli dei Livelli Movie:
   1. Con tutti i livelli selezionati, utilizzare lo strumento Trasforma (Modifica> Trasformazione libera) per ruotare le immagini in modo che l'asse dorso-ventrale della retina è allineatoper l'asse y del telaio filmato.
   2. Se necessario, utilizzare lo strumento Ritaglia per ridurre il campo visivo di una dimensione e forma desiderata.
   3. Utilizzare la regolazione del livello (di singoli fotogrammi) per contribuire a migliorare il contrasto tra la membrana cellulare e corpo cellulare.
   4. Per ragioni stilistiche e per sottolineare comportamenti cellulari specifici, introdurre falsi colori per evidenziare i punti di interesse in ogni fotogramma.
4. Animazione: convertire le immagini in un filmato:
   1. Aprire il pannello Animazione dalla scheda di Windows del menu principale. Selezionare Crea fotogrammi dai livelli dal menu che si trova nell'angolo in alto a destra del riquadro Animazione.
   2. Si noti che gli strati vengono aggiunti al riquadro di animazione in ordine sequenziale a partire dal fondo della pila. Per invertire l'ordine dei fotogrammi, prima selezionare tutti i fotogrammi e selezionare Inverti fotogrammi dal menu del riquadro Animazione.
   3. Selezionare un tempo di ritardo fotogramma per ciascun fotogramma utilizzando il menu a discesa sotto il pollice telaiochiodo.
      NOTA: Il ritardo cornice per Film da 1 a 4 presentato in questo articolo è di 0,8 sec.
   4. Dalla scheda File del menu principale, aperto Esporta e selezionare rendering video. Scegli QuickTime Export in Opzioni file e selezionare un formato video desiderato. Sotto rendering Opzioni impostare Frame Rate di ordinazione, inserire un frame rate di 15, e fare clic su Render.

Risultati

Live-imaging dell'occhio pupa è una strategia di successo per osservare comportamenti delle cellule che contribuiscono al patterning del neuroepitelio. Il ruolo di specifiche proteine ​​può essere facilmente valutata esprimendo transgeni che modificano i livelli di proteina durante lo sviluppo degli occhi. Per fare questo GMR-GAL4 è usato per guidare l'espressione del transgene dietro il solco morfogenetica. Questo offre il vantaggio di non perturbare eventi precedenti che stabiliscono il campo o...

Discussione

La descrizione di wild-type sviluppo (sopra) costituisce la base per il confronto di eventi patterning in RNAi o genotipi iperespressione. Confronti di sviluppo del tessuto vivo hanno un valore inestimabile per determinare con precisione quali comportamenti cellulari sono regolati da una proteina di interesse. Inoltre, e non qui descritte, l'imaging cellulare dal vivo permette di fare descrizioni qualitative e / o quantitative del ruolo di un gene di interesse negli eventi che motivo l'occhio. In 30-32 ore APF m...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
GMR-GAL4; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP ; + / SM5-TM6b	Available on request from authors
UAS-dcr-2; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP; + / SM5-TM6b	Available on request from authors
Scotch double stick tape	3M	665
Black Sylgard dissection dish			Fill glass petri dish to rim with Sylgard (colored black with finely-ground charcoal powder) or Sylgard 170; leave at room temperature for 24-48 hr to polymerize
Sylgard	Dow Corning	SYLG184
Sylgard (Black)	Dow Corning	SYLG170
Glass petri dish	Corning	7220-85
25 x 75 x 1 mm glass microscope slide	Fisher Scientific	12-550-413
22 x 40 mm glass coverslip	VWR	48393-172
Forceps	Fine Science Tools	91150-20
Whatman 3mm Chromatography Paper	Fisher Scientific	05-713-336
Vaseline	Fisher Scientific	19-086-291	Or purchase at local pharmacy.
30 ml syringe	Fisher Scientific	S7510-30
Leica TCS SP5 DM microscope	Leica Microsystems
LAS AF Version 2.6.0.7266 microscope software	Leica Microsystems