Whole-mount Imaging di embrione di topo Sensory Axon Proiezioni

Riepilogo

We present here an optimized protocol to genotype, stain and prepare fetal mice for the imaging of peripheral nociceptor axon projections in the whole animal, as an effective method to assess sensory axon growth phenotypes in developing genetically engineered mice.

Abstract

La visualizzazione del full-length proiezioni neuronali in embrioni è essenziale per acquisire una comprensione di come mammiferi reti neuronali si sviluppano. Qui si descrive un metodo per etichettare in situ un sottoinsieme di gangli delle radici dorsali (DRG) proiezioni assoni di valutare le loro caratteristiche fenotipiche con diverse linee di topi geneticamente manipolati. I neuroni TrkA-positivi sono neuroni nocicettori, dedicati alla trasmissione di segnali di dolore. Utilizziamo una linea di topi TrkA ^taulacZ etichettare le traiettorie di tutti assoni periferici TrkA-positivo nel topo embrione intatto. Abbiamo inoltre alleviamo la linea TrkA ^taulacZ su uno sfondo nullo Bax, che abolisce in sostanza l'apoptosi neuronale, al fine di valutare le domande di crescita relative indipendentemente possibili effetti delle manipolazioni genetiche sulla sopravvivenza neuronale. Successivamente, i topi geneticamente modificati di interesse sono allevati con il TrkA ^TaulLinea nullo ACZ / Bax e sono quindi pronti per lo studio utilizzando le tecniche qui descritte. Questa presentazione include informazioni dettagliate sui piani di allevamento del mouse, la genotipizzazione al momento della dissezione, preparazione del tessuto, colorazione e di compensazione per consentire la visualizzazione del full-length traiettorie assonali in tutto il montaggio di preparazione.

Introduzione

Creazione di precise reti neuronali è un complesso processo evolutivo essenziale per la funzionalità del sistema nervoso. Disturbi in questo processo porta a una disfunzione neuronale che è stato coinvolto in malattie neurologiche umane ^1-3. Per studiare i meccanismi molecolari alla base della crescita degli assoni e di destinazione innervazione nei mammiferi, abbiamo sviluppato un protocollo per visualizzare le traiettorie assonali di TrkA-esprimere i neuroni sensoriali utilizzando una combinazione di due linee di topi geneticamente modificati.

TrkA è un recettore per il fattore di crescita nervoso NGF ed è un marcatore funzionale dei neuroni sensoriali nocicettivi ^4. TrkA è altamente espresso nei neuroni nocicettivi durante lo sviluppo precoce e media di sopravvivenza dei neuroni NGF-dipendente, la crescita degli assoni, arborization e destinazione innervazione ^5-9. Nei topi TrkA ^taulacZ, il tipo selvatico gene TrkA è sostituito da un'espressione taulacZ cassette ^10, tale che la morfologia assonale dei neuroni TrkA-positive putativi può essere visualizzata dal β-gal (X-gal) colorazione ^11. Usando una linea TrkA ^{taulacZ / WT} eterozigote, possiamo esaminare i fattori che possono regolare o interferire con lo sviluppo di sensoriali proiezioni afferenti in vivo.

Inoltre, l'espressione TrkA è assente in omozigoti topi TrkA ^{taulacZ / taulacZ,} che possono quindi essere utilizzati per valutare la crescita degli assoni promuovere meccanismi in assenza di segnalazione NGF / TrkA. Poiché i neuroni nocicettivi dipendono NGF / TrkA segnalazione non solo per la crescita degli assoni, ma anche per la sopravvivenza, ci avvaliamo di un'altra linea di topi, manca la pro-apoptotico gene Bax, di inibire l'apoptosi nei neuroni DRG embrionali, sottraendoli morte cellulare che è altrimenti osservata in assenza di segnalazione TrkA. La Bax ^{- / -} sfondo ¹² consente quindi per la molecudissezione lar di vie di segnalazione che riguardano specificamente assone ^7-9,13-15 crescita. In TrkA ^{- / -:} Bax ^{- / -} mice, neuroni DRG sopravvivono, ma sensoriale innervazione afferente nella pelle è completamente aboliti ^14,15. Siamo in grado di attivare selettivamente vie di segnalazione per determinare i rispettivi contributi allo sviluppo delle proiezioni assoni. L'utilità di questo metodo è che permette la valutazione delle variazioni di fenotipi di crescita assonale quando diverse modificazioni genetiche sono allevati sul TrkA ^{taulacZ / taulacZ:} Bax ^{- / -} o TrkA ^{taulacZ / WT:} Bax ^{- / -} sfondi.

Protocollo

NOTA: Tutte le procedure sono conformi alla Guida NIH per l'uso e la cura di animali da laboratorio. Il protocollo animale è stato approvato dal IACUC al Weill Cornell Medical College.

1. Preparazione del tessuto

1. Euthanize femmine scaduta a gravidanza per dislocazione cervicale ^15. Sezionare embrionali E16 - E18 embrioni da femmine scaduta a gravidanza e posto embrioni singolarmente nei pozzetti di un piatto 6-bene, pieni di fosfato salino freddo tamponata (PBS).
2. Sciacquare embrioni in PBS freddo.
3. Rimuovere una piccola porzione della membrana amniotica dell'embrione e posto in una soluzione di proteinasi K pre-preparato per la successiva genotipizzazione. In alternativa, se la membrana amniotica è perso, rimuovere una piccola porzione della punta della coda dell'embrione e metterlo in soluzione proteinasi K
4. Poke i fori nella pelle in tutto l'embrione utilizzando perni di insetti (almeno 100 per lato).
5. Rimuovere PBS e aggiungere lentamente fresco 2% paraformaldeide (PFA),pH 7.4, al pozzo.
6. Agitare delicatamente per 2 ore a 4 ° C.
7. Risciacquare embrioni due volte in PBS e conservare in PBS a 4 ° C fino colorazione.

2. Genotipizzazione

1. Immergere membrane amniotiche o croce embrione in proteinasi K miscela secondo le istruzioni del produttore.
2. Incubare a 56 ° C per 10 min.
3. Estrarre DNA utilizzando un kit di purificazione di DNA disponibile in commercio.
4. Prendere 0,5 l di totali 200 microlitri purificati soluzione di DNA genomico, combinarlo con 0,5 ml di ciascuna delle senso e antisenso primer specifici geni (10 micron), 2 microlitri dNTP Mix (2,5 mm di dATP, dCTP, dGTP e dTTP) , 0,2 microlitri polimerasi Taq (5 U / ml) e 2 microlitri tampone PCR (10x), aggiungere H ₂ O per un volume totale di 20 microlitri.
   NOTA: sequenze primer sono le seguenti (Tabella 1):
   TrkA: TrkA_F: GCG GGC GCC GCC GCG ATG, TrkA_R: GAA GCC GCC TGC GCG GCT CTG CCA GGG TG; PCR fragLunghezza mento: 400 paia di basi (bp).
   Bax: In5R: GTT GAC CAG AGT GGC GTA GG, Ex5F: TGA TCA GAA CCA TCA TG, neor: CCG CTT CCA TTG CTC AGC GG; PCR lunghezze frammento: wild type, 304 bp; Bax null, 507 bp.
   TauLacZ: lacZup: ACA ACG TCG TGA GTG GGA AAA, lacZdown: ATC AAC ATT AAA TGT GAG CGA G; PCR frammento lunghezza: 360 bp.
5. Eseguire un PCR con il seguente programma per TrkA: passo 1: 1 min a 95 ° C, punto 2: 10 sec a 95 ° C, punto 3: 20 sec a 68 ° C, il punto 4: 30 sec a 72 ° C. Ripetere i punti 2 - 4 per 40 cicli.
   1. Per LacZ e Bax, eseguire una PCR con il seguente programma: punto 1: 1 min a 95 ° C, punto 2: 10 sec a 95 ° C, punto 3: 1 min a 54 ° C, il punto 4: 1 min a 72 ° C, ripetere i punti 2 - 4 per 35 cicli.
6. Campioni Run PCR su un gel di agarosio 2% a 100 V in 1x tampone Tris-acetato-EDTA per 20 minuti con una corsia di scala DNA per valutare lunghezze frammento.
7. Analizzare gli embrioni per la presenza di tipo selvaggio TrkA, TRKA-tauLacZ e Bax alleli nulli. I genotipi di embrioni sperimentali sono TrkA ^{taulacZ / WT:} Bax ^{- / -} e TrkA ^{taulacZ / taulacZ:} Bax ^{- / -,} a seconda delle questioni sperimentali. Gli embrioni privi del giornalista tauLacZ saranno negativi per assonale colorazione e può quindi servire come controlli negativi per calibrare il processo di colorazione.

3. Embryo Colorazione

1. Utilizzare un kit commerciale per lacZ colorazione con alcune modifiche come descritto di seguito nelle sezioni 3,2-3,8. Qui, utilizzare il kit Millipore.
2. Immergere embrioni in tampone A per almeno 1 ora, scuotendo leggermente a temperatura ambiente.
3. Direttamente immergere embrioni in tampone B per almeno 15 minuti, agitando dolcemente alla temperatura ambiente.
4. Mentre gli embrioni sono in Buffer A / B, soluzione Tissue Base pre-caldo a 37 ° C. Utilizzare 5 ml di soluzione di tessuto di base per embrione.
5. Mentre gli embrioni sono in Buffer A / B, preparare fresco 5-bromo- 4- cloro- 3- indolil α-D-galattopiranoside (X-gal) ad una concentrazione di 40 mg / ml in 100% dimetilsolfossido (DMSO).
6. Diluire X-gal nella soluzione Tissue Base pre-riscaldato ad una concentrazione di 1 mg / ml e si aggiungono 5 ml di X-gal / miscela Base Tissue in una fiala di scintillazione in vetro.
7. Trasferire gli embrioni in una fiala di scintillazione di vetro contenente miscela Base X-gal / tessuto. Sigillare coperchio con Parafilm e incubare a 37 ° C durante la notte, controllando la presenza di blu macchia.
8. Embrioni Postfix con freschi 4% PFA, pH 7.4. Agitare delicatamente per 4 ore a 4 ° C.
9. Sciacquare embrioni due volte in PBS freddo.

4. Tissue Disidratazione e Clearing

1. Luogo embrioni in metanolo al 50% al 50% della miscela / PBS per 30 minuti a temperatura ambiente, agitando in fiale di vetro.
2. Continuare a disidratare in 75% metanolo / 25% PBS per 30 minuti a temperatura ambiente agitando in flaconcini di vetro.
3. Continuare a disidratare in metanolo al 90% / 10% PBS per 30 min a temperatura ambiente agitando in flaconcini di vetro.
4. Continuare a disidratare in metanolo 100% per 30 min (2x) a temperatura ambiente agitando in flaconcini di vetro.
5. Mentre embrioni sono disidratazione, preparare un 1: 1 (v: v) miscela di alcool benzoile e benzoil benzoato.
   NOTA: alcol benzoile e benzoil benzoato è tossico.
6. Immergere embrioni in 1: 1 (v: v) miscela di metanolo 100%: 100% BABB per 15 min. Utilizzare il vetro solo perché il BABB si dissolverà in plastica.
7. Immergere embrioni in 100% BABB completamente chiaro il tessuto e visualizzare X-gal colorazione nell'embrione eliminato.
   NOTA: L'immagine appena possibile perché la macchia X-gal sbiadiscono nel tempo.

5. intero monte Imaging

1. Stabilizzare l'embrione, immerso in 100% BABB, agli angoli appropriati per fotografia con pinze di metallo. Illuminare utilizzando una combinazione di up-light e sotto-light fonti.
2. Acquisire le immagini con un microscopio dissezionedotato di una fotocamera digitale. Prendere esposizioni multiple in campo chiaro a cinque piani focali successivi 0,5 millimetri di distanza lungo l'asse Z. I tempi di esposizione e f-stop possono variare a seconda di illuminazione e telecamere specifiche e devono essere ottimizzati per ogni installazione.
3. Utilizzare software standard di elaborazione delle immagini per elaborare immagini sovrapposte e generare fotomontaggi.

Risultati

I genotipi di TrkA ^{WT / taulacZ:} Bax ^{- / -} e TrkA ^{taulacZ / taulacZ:} Bax ^{- / -} gli embrioni possono essere inequivocabilmente determinati dal genotipo normale PCR (Figura 1). Display colorazione X-gal dettagliate pergole assonale periferici per via sottocutanea in embrioni convenzionalmente macchiati (figure 2, 3 bis), e in tutto l'embrione dopo schiarimento del tessuto (figure 3b, 4).

Abbiamo ...

Discussione

La procedura di colorazione X-gal sopra descritto di topi embrionali TrkA ^taulacZ permette la visualizzazione rapida e dettagliata delle proiezioni assoni lunga distanza nell'embrione fisso intatto. A causa del fondo nulla Bax questi topi permettono di sondare di meccanismi di segnalazione che possono contribuire sia alla crescita degli assoni e la sopravvivenza neuronale. Accoppiamento con transgenici o knockout mice di interesse consente per la valutazione complessiva di fenotipi asson...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
PFA	Sigma-Aldrich	P6418
PBS	Life Tech	10010-023
Tissue Rinse Solution A	Millipore	BG-6-B
Tissue Rinse Solution B	Millipore	BG-7-B
Tissue Stain Base Solution	Millipore	BG-8-C
X-gal	Sigma-Aldrich	B4252
Glass scintiallation vial	Kimble Chase	74500-20
Incubator	Labline	Model 120
Insect pins	FST	26000-30
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
6-well dish	USA Scientific	CC7672-7506
Primers	IDT	custom DNA primers
Takara dNTP mixture	Takara	4030
Takara LA buffer	Takara	RR002A
Takara LA Taq	Takara	RR002A
PCR machine	Bio-Rad	DNA Engine Dyad
Benzyl alcohol	Sigma-Aldrich	B-1042
Benzyl benzoate	Sigma-Aldrich	B-6630
Dissecting microscope	Leica	M205A
Camera	Leica	DFC310FX
Ring light	Leica	MEB110
Photoshop	Adobe	Photoshop 4.0