Metodo per la valutazione degli effetti di un intervallo di lunghezze d&#39;onda e intensità di / vicino-infrarosso di terapia della luce rossa sullo stress ossidativo<em&gt; In Vitro</em

Riepilogo

Non-coherent Xenon light was passed through narrow-band interference and neutral density filters to deliver light of varying wavelength and intensity to cultured cells. This protocol was used to assess the effects of red/near-infrared light therapy on production of reactive species in vitro: no effects were observed using the tested parameters.

Abstract

Red / terapia della luce nel vicino infrarosso (R / NIR-LT), consegnato da laser o diodi emettitori di luce (LED), migliora i risultati funzionali e morfologiche a una serie di lesioni del sistema nervoso centrale in vivo, possibilmente riducendo lo stress ossidativo. Tuttavia, gli effetti di R / NIR-LT sullo stress ossidativo hanno dimostrato di variare a seconda lunghezza d'onda o intensità di irraggiamento. Gli studi che confrontano parametri di trattamento mancano, a causa della mancanza di dispositivi disponibili in commercio in grado di offrire di più lunghezze d'onda o intensità, adatti per alta through-put in studi di ottimizzazione in vitro. Questo protocollo descrive una tecnica per la consegna di luce in un intervallo di lunghezze d'onda e intensità di ottimizzare dosi terapeutiche richieste per un determinato modello di lesione. Abbiamo ipotizzato che un metodo di fornire luce, in cui i parametri di lunghezza d'onda e intensità potrebbero facilmente essere alterati, potrebbe facilitare la determinazione di una dose ottimale di R / NIR-LT per ridurre le specie reattive dell'ossigeno(ROS) in vitro.

Non coerente Xenon è stata filtrata attraverso filtri interferenziali a banda stretta per offrire lunghezze d'onda diverse lunghezze d'onda (centro di 440, 550, 670 e 810 nm) e fluenze (8,5 x 10 ^-3 a 3,8 x 10 ^-1 J / cm ²⁾ della luce a cellule in coltura. L'emissione luminosa dall'apparato è stato calibrato per emettere terapeuticamente rilevanti, dosi uguali quantali di luce ad ogni lunghezza d'onda. Specie reattive sono state rilevate in glutammato sottolineato cellule trattate con la luce, utilizzando DCFH-DA e H ₂ O ₂ coloranti fluorescenti sensibili.

Abbiamo consegnato con successo luce in una gamma di lunghezze d'onda fisiologicamente e terapeuticamente e intensità rilevanti, a cellule in coltura esposte a glutammato come modello di lesioni del sistema nervoso centrale. Mentre le influenze di R / NIR-LT utilizzati in questo studio non esercitare un effetto sulla ROS generato dalle cellule in coltura, il metodo di consegna luce è applicabile ad altri systems compresi mitocondri o più fisiologicamente rilevanti modelli cultura fetta organotipiche isolate, e potrebbe essere utilizzato per valutare gli effetti su una serie di misure di outcome del metabolismo ossidativo.

Introduzione

Le specie reattive dell'ossigeno (ROS) sono necessari per una serie di trasduzione del segnale e le normali reazioni del metabolismo cellulare, inclusi quelli di neuroprotezione ^1. Tuttavia, quando il meccanismo endogeno antiossidante sono in grado di controllare la produzione di ROS, le cellule possono soccombere allo stress ossidativo ^2,3. Dopo lesioni al sistema nervoso centrale, gli aumenti legati in presenza di ROS e lo stress ossidativo sono pensati per svolgere un ruolo importante nella progressione del danno ^4,5. Nonostante l'ampio numero di strategie per attenuare lo stress ossidativo che sono stati valutati, non vi sono attualmente completamente efficaci, le strategie antiossidanti clinicamente rilevanti per attenuare la produzione di ROS e lo stress ossidativo associato in uso clinico dopo neurotrauma ^6. Pertanto, l'attenuazione dello stress ossidativo resta un obiettivo importante per l'intervento terapeutico ^7.

Miglioramenti seguonoR ing / NIR-LT sono stati riportati in una vasta gamma di lesioni e malattie, tra cui la riduzione delle dimensioni dell'infarto miocardico, le complicanze renali ed epatiche durante il diabete, degenerazione della retina, lesioni del sistema nervoso centrale e ictus ^8, forse riducendo lo stress ossidativo. Con particolare riguardo alla lesione del sistema nervoso centrale, studi preclinici di efficacia della luce 670nm hanno mostrato effetti positivi in modelli di degenerazione retinica ^9-11, lesioni del midollo spinale ^12, morte neuronale ^13. Sono stati condotti studi clinici per l'età a secco degenerazione maculare e sono attualmente in corso per l'ictus ^14, ma i risultati di questi studi non appaiono promettenti, forse a causa di un errore di impiegare un trattamento efficace parametri ^15. Come tale, R / NIR-LT non è stato ampiamente adottato come parte della pratica clinica normale neurotrauma, pur essendo facile da amministrare, non invasivo e trattamento relativamente poco costoso. Ostacoli alla traduzione clinica includono la mancanza di un clmeccanismo di azione e l'assenza di un protocollo standardizzato efficace ^16,17 trattamento precoce compreso. Letteratura attuale per quanto riguarda la terapia della luce rivela una pletora di variazione di parametri di trattamento per quanto riguarda le fonti di irradiazione (LED o laser), la lunghezza d'onda (ad esempio, 630, 670, 780, 810, 830, 880, 904nm), dosi totali (joule di irraggiamento / unità di superficie), la durata (tempo di esposizione), tempistica (insulto pre- o post), la frequenza del trattamento e modalità di consegna (impulso o continua) ^8. La variabilità dei parametri di trattamento tra gli studi rende difficile il confronto e ha contribuito allo scetticismo per quanto riguarda l'efficacia ^16.

Pertanto, l'ottimizzazione della R / NIR-LT è chiaramente necessario, con sistemi di coltura di cellule in grado di fornire il meccanismo di screening high-throughput necessario per confrontare le molteplici variabili. Tuttavia ci sono alcuni sistemi di illuminazione disponibili in commercio in grado di fornire la flessibilità e il controllo sufficiente sulle wavelength e l'intensità di effettuare tali esperimenti di ottimizzazione. Commercialmente dispositivi disponibili LED sono generalmente in grado di fornire più lunghezze d'onda o intensità, con conseguente investigatori impiegano più dispositivi LED di diversi produttori, che possono variare non solo in intensità, ma anche lo spettro di lunghezza d'onda della luce emessa. Abbiamo affrontato questo problema utilizzando una sorgente di luce a banda larga Xenon filtrata attraverso filtri di interferenza a banda stretta, generando così una gamma di lunghezze d'onda e fluenze di luce, consentendo chiudere, accurato controllo dei parametri di R / NIR-LT.

È importante notare che la dose terapeutica del trattamento è definito dal numero di fotoni che interagiscono con il photoacceptor (cromoforo), che, nel caso di R / NIR-LT è postulata essere citocromo c ossidasi (COX) ^18. Energia Photon erogata varia con lunghezza d'onda; significato uguali dosi di energia a diverse lunghezze d'onda sarà compregiato diverso numero di fotoni. Pertanto, la luce emessa dal dispositivo è stato calibrato per emettere un numero uguale di fotoni per ognuna delle lunghezze d'onda scelte da testare. Abbiamo sviluppato un sistema che può essere utilizzato per fornire R / NIR-LT in un intervallo di lunghezze d'onda e intensità di cellule in vitro e dimostrato la capacità di misurare gli effetti del trasporto di R / NIR-LT sulla produzione di ROS in cellule sottoposte a lo stress glutammato.

Protocollo

1. ottico di calibrazione: misurazione della luce emessa

1. Per preparare l'apparato consegna luce, collegare una sorgente di luce a banda larga (ad esempio, o lampada Xenon tungsteno) ad un'alimentazione adeguata. Posizionare una lente collimatrice di fronte alla sorgente di luce per produrre un fascio collimato di luce. Passare la luce attraverso un filtro di calore liquido per rimuovere la maggior parte del calore dal fascio di luce. A seconda dell'applicazione, concentrare il fascio collimato al diaframma all'ingresso di una guida di luce liquida, che prevede la consegna più flessibile della luce (ad es., In un incubatore).
2. All'altra estremità della guida di luce liquida, posizionare un secondo collimatore e quindi un supporto per l'interferenza e filtri di densità neutri. Controllare che questo accordo produce una macchia uniformemente illuminato di luce della lunghezza d'onda e intensità desiderata.
   Nota: La distanza tra l'estremità della guida di luce e il piano del campione può essere necessario variare a secondal'area che deve essere illuminato, ma ricordate che la distanza fra l'estremità delle guide di luce aumenta, l'intensità della luce diminuirà. Nel presente studio, questa distanza è 14 centimetri e produce una sezione trasversale del fascio che illumina uniformemente un'area ben 3x3 su una piastra a 96 pozzetti.
3. Assicurarsi che la luce diffusa dalla lampada e componenti ottici associati è in grado di raggiungere il campione.
4. Accendere il refrigeratore d'acqua per il filtro di calore liquido e assicurarsi che ci sia lo scambio di acqua attraverso la camicia del filtro. Accendere la fonte di alimentazione della lampada e attendere almeno 5 minuti per la sorgente di luce a banda larga per stabilizzare. Nota: è richiesto l'uso del dispositivo di raffreddamento dell'acqua per evitare il surriscaldamento del dispositivo.
5. Selezionare un filtro di interferenza a banda stretta (di solito descritta dalla loro lunghezza d'onda centrale, picco trasmittanza e la larghezza a metà altezza (FWHM) larghezza di banda) per generare la banda desiderata dell'illuminazione. Nota: I filtri di interferenza a banda stretta utilizzati in questo studio sono stati 442 nm, 550 nm, 671 nm e 810 nm.
6. Misurare la luce prodotta dalla lampada al piano in cui il campione deve essere posizionato durante il trattamento. Misurare la luce utilizzando una sonda irraggiamento calibrato (collettore coseno) collegato ad un spettroradiometro adeguata, utilizzando software proprietario in base alle istruzioni del produttore.
7. Utilizza filtri di densità neutri per regolare l'intensità della luce fino ad ottenere il risultato desiderato. Nota: Nel presente studio, l'intensità della luce passata da ogni filtro di interferenza è regolata per fornire un'uscita quantal uguali in ciascuna delle quattro bande d'onda di trattamento. E 'importante controllare la taratura regolarmente, in quanto la potenza della lampada è soggetta a modifiche.
   Nota: Dopo la costituzione dell'apparecchio, le cellule sono pronte per essere illuminata figura 1 è una rappresentazione del dispositivo consegna luce utilizzata in questo studio..

Figura 1. Immagine dell'apparato consegna luce. Illustrated sono la fonte di energia di luce, lampada allo xeno con alloggiamento, lente di collimazione, filtro per l'acqua, l'apertura d'ingresso, guida di luce liquida, seconda lente di collimazione, porta filtro, telaio e trattamento opaco carta nera. Si noti che i filtri di lunghezza d'onda e intensità banda stretta non sono mostrati.

2. Cella Preparazione

1. Il metodo di consegna R / NIR-LT descritto può essere applicato a qualsiasi tipo di cellula o sistema modello in vitro; come tali le seguenti descrizioni di coltura cellulare sono generali, con tecniche consolidate alla cultura feocromocitoma (PC12), Müller (RMC1) e cellule della retina misti primarie.
2. Prima della semina delle cellule per il trattamento della luce e ossidativo test di stress, cultura immortalato cellule nel loro mezzi di crescita rispettiva contenente integratori adeguati (ad es., FBS, antibiotici) in flas T75ks fino 70-80% confluenti.
3. Staccare le cellule immortalati da fiaschi T75, utilizzando il metodo appropriato per il tipo di cellule da testare ad esempio., Tripsina. Se necessario, prima di procedere alla semina di cellule in 96 pozzetti piastre test, pozzetti della piastra dosaggio cappotto con 10 mcg / ml di poli-L-lisina per 1h (ad es., Per le cellule PC12) o 10 mcg / ml di poli-L-lisina per 1h seguita da un / N incubazione O con 10 mcg / ml laminina (ad es., per le cellule retiniche misti).
4. Centrifugare le cellule per la raccolta a seconda dei casi (ad es., 3 min a 405 g per PC12 o 10 min a 218 xg per le cellule RMC1), rimuovere il surnatante e risospendere in 8 ml di mezzi appropriati di coltura cellulare.
5. Se le cellule retiniche misti devono essere utilizzati, preparare da P0-5 cuccioli di ratto neonatale di digestione enzimatica (papaina) secondo le procedure stabilite ¹⁹
6. Contare il numero di cellule vitali esclusi 0,4% (w / v) trypan colorante blu, utilizzando un emocitometro.
7. Regolare suc densità cellulareh che le cellule saranno circa il 70-80% confluenti dopo 24 o 48 ore in cultura. (Per cellule PC12 la densità di semina è 4,0 x 10 ⁵ cellule vitali / ml, per le cellule RMC1, è di 2,5 x 10 ⁵ cellule vitali / ml e per cellule retiniche misti è 8 x 10 ⁵ cellule / ml vitali). Dopo l'aggiunta di cellule o piastre a 96 pozzetti trasparente o nero (utilizzati per l'H ₂ O ₂ o DCFH-DA assay rispettivamente), in 100 ml di mezzi di crescita appropriata, consentono piastra di sedersi su una superficie piana a 37 ° C, 5 % di CO ₂ (o qualunque condizione siano appropriati per il tipo cellulare specifico) per almeno 24 ore per permettere l'adesione cellulare.
8. Cellule culturali in mezzi di crescita negli appositi vassoi 96 e fino a quando non sono il 70-80% confluenti (24 ore per PC12 e cellule RMC1, 48h per le cellule retiniche misti).

3. Aggiunta di glutammato Stressor a Celle

1. Preparare L-acido glutammico monosodico concentrazioni idrato sale stressanti di 0-10mm in appropriate crescere pienoterreni di coltura th.
2. Rimuovere i supporti dalle cellule e lavare delicatamente le cellule 3 volte con PBS (PC12) o HBSS (RMC1 e cellule retiniche miste). Dopo lavaggi, aggiungere media-glutammato contenente fino ad un volume totale di 100 microlitri / pozzetto.

4. Prima dosaggi di trattamento Luce

1. Subito dopo l'aggiunta di glutammato o di stress di scelta, esporre le cellule al trattamento della luce alle lunghezze d'onda e intensità desiderati mettendo sotto l'apparato consegna luce preparato. Assicurarsi di modificare l'output quantal del fascio luminoso utilizzando le combinazioni con sede di filtri di densità neutri a seconda della lunghezza d'onda di essere somministrata.
   Nota: Negli esperimenti attuali, esporre le cellule per il trattamento della luce per 3 min mantenere la temperatura appoggiando i 96 pozzetti su un pad termico C 37 ^o. Il tempo di trattamento può essere variato come richiesto.
   1. Mettere una carta nera opaca sotto le celle per evitare che la luce riflette in pozzi adiacenti nella 96-well vassoio designato per gli altri parametri di trattamento.
2. Se il trattamento è desiderata per lunghezze di tempo più lunghi, aggiungere tampone 25mM Hepes per mantenere il pH del terreno di coltura cellulare o idealmente, posizionare le piastre apparecchi e di trattamento all'interno di un incubatore con concentrazione di CO ₂ regolato al 5% di CO _2, o condizioni che sono ottimali per il tipo di cellula specifico.
3. Dopo il completamento del trattamento di luce, collocare le celle su una superficie piana e incubare a 37 ° C e 5% CO ₂ (o qualunque condizioni sono ottimali per il tipo di cellula) per 24h.
   Nota: Altri dosaggi di R / NIR-LT possono essere somministrati come sopra descritto, come desiderato.

5. finale Dosaggio del trattamento Luce e rilevamento di ROS

1. Prima di eseguire la fase finale del trattamento luce, preparano i reagenti da utilizzare per il rilevamento ROS. Preparare tampone 50 mM citrato (pH6.0), Triton X100, e H ₂ O ₂ lavora reagente di rilevamentoSoluzione (1: 2: 97 10mM rapporto H ₂ O ₂ reagente soluzione madre di rilevamento; 10 U / ml di rafano perossidasi; citrato di sodio 50 mM (pH 6,0)). Preparare DCFH-DA ad una concentrazione finale di 100μM nelle matrici appropriate.
   Nota: il reagente DCFH-DA per le cellule PC12 è nei media RPMI, reattivo DCFH-DA per le cellule RMC1 è nei media DMEM. Si noti che i reagenti di rilevazione disponibili in commercio hanno sensibilità differenziali a specifiche ROS e reagenti devono essere scelti con attenzione per fornire le informazioni desiderate per una singola applicazione.
2. Somministrare trattamento di luce alle cellule, come descritto nel passaggio 4.1-4.1.2. Assicurarsi che le cellule vengono trattate con i desiderati fluenze / lunghezze d'onda della luce.
3. Subito dopo il trattamento della luce, rimuovere i media-glutammato contenenti e lavare due volte con soluzione tampone adeguata (per cellule PC12, PBS è usato e per le cellule RMC1, viene utilizzato HBSS). Eseguire i saggi ROS sulle cellule come segue:
   1. H ₂ O ₂ dosaggio: aggiungere 45 ml di tampone 50 mM citrato (pH 6,0) e 5 microlitri Triton X100 a ciascuno dei pozzetti. Agitare delicatamente le cellule in un agitatore orbitale per 30 sec e incubare a 37 ° C e 5% CO ₂ per 15 min. Aggiungere 50 ml di H ₂ O ₂ soluzione di lavoro di rilevamento e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. Misurare la fluorescenza utilizzando un lettore di piastre con lunghezza d'onda di eccitazione di 530nm e una lunghezza d'onda di emissione di 480 nm.
   2. DCF dosaggio: aggiungere 100 microlitri della soluzione 100 mM di DCFH-DA a ciascun pozzetto ed incubare per 30 min a 37 ° C e 5% CO _2. Rimuovere il supporto contenente 100 mM DCFH-DA e lavare con soluzione tampone appropriato (come descritto sopra) due volte. Aggiungere 90 ml di soluzione tampone e 10 microlitri Triton X100 a ciascuno dei pozzetti e agitare delicatamente su un agitatore orbitale per 30 secondi prima di 15 min di incubazione a 37 ° C. Misurare DCF fluorescenza ottenuti utilizzando un lettore di piastre con lunghezza d'onda di eccitazione di 480 nm e una Wavel emissioneength di 530nm.
   3. Espresso ROS valori relativi alla concentrazione proteica di cellule rimanenti nei pozzetti, utilizzando un kit colorimetrico per quantificare la concentrazione di proteine ​​secondo le istruzioni del fabbricante, con riferimento ad una curva standard per calcolare mg di proteina.

Risultati

L'uscita di luce emesso alla lunghezza d'onda di 670nm è stato calibrato utilizzando filtri di densità neutri per irradiare le cellule con una gamma di fluenze che comprende una dose di luce 670nm precedentemente dimostrato di essere utile in vivo (0,3 J / cm ^{2) 20.} Poiché il numero di filtri di densità neutri di fronte alla sorgente luminosa aumentata, l'intensità (W / m ²⁾ è diminuita, con meno luce che passa per l'area di destinazione. Tabella 1 presenta i dati di ...

Discussione

Abbiamo adattato con successo un sistema di erogazione precisa della luce e tarato per fornire un meccanismo per lo studio di ottimizzazione di R / NIR-LT in vitro. Lunghezza d'onda e intensità di parametri R / NIR-LT sono in grado di essere manipolato accuratamente ed efficacemente usando questo sistema. Abbiamo stabilito che la luce il trattamento delle cellule non ha portato alla morte delle cellule, anche se ROS non sono stati ridotti alle lunghezze d'onda e dosaggi consegnati, nei tipi cellulari t...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
OxiSelect Intracellular ROS Assay Kit (Green Fluorescence)	Cell Biolabs	STA-342
Amplex UltraRed Reagent	Molecular Probes	A36006
300 Watt Xenon Arc Lamp	Newport Corporation	6258	Very intense light source, do not look directly into the lamp. Ensure there is sufficient cooling to the lamp whilst it is switched on
USB4000-FL Fluorescence Spectrometer	Ocean Optics
CC-3-UV Cosine Corrector for Emission Collection	Ocean Optics
200μm diameter quartz fibre optic	Ocean Optics
SpectraSuite Spectroscopy Platform	Ocean Optics
2300 EnSpire Multimode Plate Reader	Perkin Elmer
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225
Triton X-100	Sigma-Aldrich	9002-93-1	Acute toxicity, wear gloves when handling.
L-Glutamic acid monosodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	142-47-2 (anhydrous)
Pheochromocytoma rat adrenal medulla (PC12) cells	American Type Culture Collection	CRL-2522
Roswell Park Memorial Institute (RPMI1640) Media	Gibco	11875-119
Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin	Gibco	10082-147	Warm to 37 °C in water bath before use
Horse Serum, New Zealand origin	Gibco	16050-122	Warm to 37 °C in water bath before use
GlutaMAX Supplement	Gibco	35050-061	Warm to 37 °C in water bath before use
100 mM Sodium Pyruvate	Gibco	11360-070	Warm to 37 °C in water bath before use
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140-122	Warm to 37 °C in water bath before use
100X MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Gibco	11140-050	Warm to 37 °C in water bath before use
Retinal Muller (rMC1) cells	University of California, San Diego
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11965-118	Warm to 37 °C in water bath before use
75 cm2 Flasks	BD Biosciences	B4-BE-353136
Poly-L-lysine hydrobromide	Sigma-Aldrich	25988-63-0	Aliquot and store at -20 °C
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco	14025-134	Warm to 37 °C in water bath before use
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Gibco	10010-049	Warm to 37 °C in water bath before use
Laminin Mouse Protein, Natural	Gibco	23017-015	Aliquot and store at -20 °C
1X Neurobasal Medium	Gibco	21103-049	Warm to 37 °C in water bath before use
Trypan Blue Solution, 0.4%	Gibco	15250-061
165U Papain	Worthington
L-Cysteine	Sigma-Aldrich	W326305
Corning 96 well plates, clear bottom, black	Corning	CLS3603-48EA
Costar Clear Polystyrene 96-Well Plates Untreated; Well shape: Round; Sterile.	Costar	07-200-103
Seesaw Rocker	Standard lab epuipment
Centrifuge	Standard lab epuipment
Neutral Density Filter Paper (0.3)	THORLABS
442 nm Bandpass Filter	THORLABS	FL441.6-10
550 nm Bandpass Filter	THORLABS	FB550-10
670 nm Bandpass Filter	THORLABS	FB670-10
810 nm Bandpass Filter	THORLABS	FB810-10e
Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.1)	THORLABS	NE01B
Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.2)	THORLABS	NE02B
Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.3)	THORLABS	NE03B
Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.5)	THORLABS	NE05B
Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.6)	THORLABS	NE06B
Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (1.0)	THORLABS	NE10B