3-D imaging e analisi di neuroni infetti<em&gt; In Vivo</em&gt; Con<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Riepilogo

Usando questo protocollo, siamo stati in grado di immagine di 160 micron di spessore sezioni di cervello di topi infettati con il parassita Toxoplasma gondii, che consente la visualizzazione e l'analisi del rapporto spaziale tra il parassita encysting e il neurone infetto.

Abstract

Toxoplasma gondii è un obbligato, parassita intracellulare con una gamma ampia di accoglienza, compresi gli esseri umani e roditori. In entrambi gli esseri umani e roditori, Toxoplasma stabilisce una infezione persistente per tutta la vita nel cervello. Mentre questa infezione cervello è asintomatica nella maggior parte delle persone immunocompetenti, nel feto in via di sviluppo o individui immunocompromessi, come sindrome da immunodeficienza acquisita (AIDS) pazienti, questa predilezione per la persistenza e nel cervello può portare a malattia neurologica devastante. Pertanto, è chiaro che l'interazione cervelli Toxoplasma è fondamentale per la malattia sintomatica prodotto da Toxoplasma, ma abbiamo poco comprensione dell'interazione cellulare o molecolare tra cellule del sistema nervoso centrale (CNS) e il parassita. Nel modello murino di CNS toxoplasmosi è noto da oltre 30 anni che i neuroni sono le cellule in cui il parassita persiste, ma poche informazioni sono disponibili su qualiparte del neurone è generalmente infettato (soma, dendriti, assoni) e se questo rapporto cellulare cambia tra i ceppi. In parte, questa mancanza è secondario alla difficoltà di imaging e visualizzazione interi neuroni infetti da un animale. Tali immagini richiede un complesso di sezionamento di serie e la cucitura del tessuto fotografato al microscopio elettronico o microscopia confocale dopo immunocolorazione. Combinando diverse tecniche, il metodo qui descritto consente l'uso di sezioni spesse (160 micron) per identificare e celle di immagine intera che contengono cisti, permettendo la visualizzazione e analisi del singolo, neuroni cronicamente infette tridimensionale senza bisogno di immunocolorazione, microscopia elettronica , o sezionamento seriale e cuciture. Utilizzando questa tecnica, possiamo cominciare a capire il rapporto cellulare tra il parassita e il neurone infetto.

Introduzione

L'obiettivo generale di questo metodo è quello di ottenere alta risoluzione, immagini tridimensionali di singoli neuroni che sono infettati dal parassita intracellulare obbligato Toxoplasma gondii.

Toxoplasma è spesso considerato uno dei parassiti di maggior successo per la sua vasta gamma ospite intermedio, che comprende l'uomo e roditori. In entrambi gli esseri umani e roditori, dopo l'infezione acuta attraverso l'ingestione di cibo o acqua contaminati, Toxoplasma è in grado di causare una infezione persistente del sistema nervoso centrale convertendo dalla sua forma replica veloce (il tachizoite) per la sua lenta replicante e encysting forma (il bradyzoite ). In individui immunocompetenti, questa infezione CNS latente è pensato per essere relativamente asintomatica, ma in individui immunocompromessi, come i malati di AIDS o pazienti sottoposti a trapianto, recrudescenza del parassita può portare alla fatale encefalite toxoplasmic ^1,2. Inoltre, studi recenti have dimostrato che l'infezione latente da Toxoplasma può portare a cambiamenti comportamentali nei roditori ^3,4, anche se il meccanismo rimane sconosciuto.

Sorprendentemente, nonostante questi dati evidenziano l'importanza dell'interazione CNS- Toxoplasma, relativamente poco si sa su questo rapporto, soprattutto a livello cellulare e molecolare. La possibilità di studiare gli aspetti anche semplici dell'interazione cervello parassita è stata ostacolata in parte dalle limitazioni tecnologiche. Ad esempio, la maggior parte del lavoro dimostrando che i neuroni sono le cellule in cui cisti persistono è stato fatto con microscopia elettronica (EM) ^5,6. Anche se EM dà alta risoluzione, è ad alta intensità di tempo, di lavoro, e costoso. Immunofluorescenza (IF) saggi sono stati recentemente utilizzato in combinazione con la microscopia confocale per confermare il lavoro fatto da EM ^7. Se le analisi sono tecnicamente facili da eseguire e relativamente poco costoso, ma utilizzando queste tecniche per undertand il rapporto spaziale tra la cisti e il neurone infettato richiede la ricostruzione di serie, che richiede molto tempo, tecnicamente difficile, e può portare alla perdita di preziose informazioni. Così, abbiamo sviluppato un metodo che può essere utilizzato con il modello murino di CNS toxoplasmosi e ci permette di immagine la totalità dei neuroni infetti senza EM o immunoistochimica (IHC). Sviluppando tale tecnica, possiamo cominciare a esplorare il rapporto cellulare tra la cellula infettata e la cisti in modo relativamente rapido e poco costoso.

Il metodo abbiamo sviluppato combina più recenti tecniche di compensazione otticamente e sezioni di cervello spessore di imaging mediante microscopia confocale ⁸ con un sistema che segna in cellule in vivo che sono stati iniettati con proteine ​​parassita ^9,10. In questo sistema, abbiamo infettare topi Cre-giornalista che esprimono una proteina fluorescente verde (GFP) solo dopo ¹¹ ricombinazione Cre-mediata con Toxoplasma Ceppi che esprimono una proteina fluorescente rossa (RFP) e iniettano Cre ricombinasi nelle cellule ospiti ^9. Questa combinazione ci permette di raccogliere il cervello infetto del mouse dopo l'infezione del sistema nervoso centrale è stabilita, tagliare sezioni di cervello di spessore, e rapidamente individuare le aree di pertinenza immagine trovando la RFP ⁺ cisti. È importante notare che, come espressione della GFP cellula ospite dipende unicamente dalla iniezione di Cre da parassiti, infezioni e non su una serie di cellule GFP ⁺ non contengono parassiti ^10. Poiché l'obiettivo di questo protocollo è quello di essere in grado di immagine intere neuroni infettati, l'attenzione è solo sulla GFP ⁺ neuroni che contengono anche un RFP ⁺ cisti, ma il protocollo può essere utilizzato anche per l'immagine della GFP ⁺ / RFP ^- neuroni.

Una volta che il cervello infetto è raccolto e sezionata, le sezioni sono resi trasparente glicerolo compensazione. Regioni appropriate di sezioni sono poi ripreso con microscopia confocale, almuggito visualizzazione senza precedenti di cellule ospiti infette e parassiti incistate nella loro interezza. Qui forniamo un protocollo completo per l'identificazione, la compensazione ottica, e di imaging infetti neuroni.

Protocollo

NOTA: I topi sono stati allevati e mantenuti in temperatura e umidità ambiente controllata con 12 hr invertito cicli di luce / buio, con cibo e acqua ad libitum presso la University of Arizona. Gli esperimenti sono stati condotti secondo le linee guida e l'approvazione della Cura e uso Comitato Animal Istituzionale della University of Arizona. Sono stati fatti tutti gli sforzi per ridurre al minimo le sofferenze. I topi Cre-giornalista sono su un C57BL / 6 di fondo ¹¹ e sono disponibili in commercio.

1. mouse Infezione

NOTA: Il metodo di infezione mouse con Toxoplasma gondii descritto qui di seguito è stato utilizzato in studi precedentemente pubblicati ^{10 - 12.}

1. Grow ceppi Toxoplasma nell'uomo prepuzio fibroblasti (HFFS) coltivate in Dulbecco alta glucosio Modificato (DMEM) integrato con il 10% FBS, 100 U / ml di penicillina, 100 mg / ml streptomycin, e 2 mM L-glutammina (cDMEM) in un pallone T-25 all'interno di un incubatore CO ₂ 5% fino parassiti hanno costituito grandi vacuoli parassitoforo.
2. Parassiti Siringa a rilascio raschiando cellule dal fondo del pallone e passando la soluzione risultante attraverso un ago calibro 25 collegato ad una siringa da 3 ml 2 volte all'interno del pallone poi trasferire la soluzione in un caso siringa da 5 ml collegato ad un ago calibro 27 che è stato collocato capovolto all'interno di un tubo da 15 ml. Collegare lo stantuffo alla siringa e passare la soluzione del parassita nel tubo conico.
3. Centrifugare la provetta per 10 min a 300 x g. Aspirare il surnatante quindi risospendere il pellet in 4-6 ml sterile di grado USP 1x tampone fosfato (PBS) pH 7.4 (Soluzione Stock).
4. Caricare un emocitometro con 10 ml di soluzione madre, aspettare 5-10 min per i parassiti di stabilirsi poi contare il numero di parassiti nei quattro angoli e centrali piazze della grande piazza centrale.
5. Diluire parasiti di adeguata dimensione inoculo di 100K / 200 ml PBS 1X poi iniettare topi per via intraperitoneale (ip) con un volume totale di 200 microlitri.
   NOTA: Per questa procedura, i topi sono stati inoculati con 100K tipo III (CEP) ¹³ tachizoiti a 200 microlitri 1x PBS. Quando infettare topi con altri ceppi di Toxoplasma, concentrazione di inoculo può essere necessario un aggiustamento per tenere conto di livello di virulenza.

2. perfusione cerebrale e raccolta

NOTA: Questo protocollo è stato condotto a 21 giorni dopo l'infezione (dpi) in quanto questo rappresenta il punto di tempo in cui un picco di cisti si trovano nel cervello di topo, ma altri punti di tempo può essere utilizzato. Size, il numero, la posizione e la presenza o assenza di cisti dipende da molti fattori, tra cui ceppo di topi, parassiti ceppo così come il formato inoculo ^{7,14 - 17.} Gli investigatori dovranno stabilire individualmente l'inoculo appropriato per il mouse e Toxoplasceppo ma lui / lei usa.

1. Installazione di tutti gli strumenti di raccolta chirurgici (Figura 1).
2. Per ogni mouse, preparare e tenere in ghiaccio: siringa 20ml riempito di sodio cloruro 0,9% (NaCl) + 10 U / ml di eparina in 1x sterile grado USP PBS (Eparina / Saline); Siringa da 20 ml riempito con 4% paraformaldeide (PFA); Scintillazione flaconcino con 15 ml 4% PFA. Per di più i topi, preparare un bicchiere pieno di l'intero importo di ogni soluzione necessaria per tutti i mouse poi elaborare una siringa nuova completa di soluzioni per ogni perfusione.
3. Anestetizzare l'ip mouse con 200 microlitri / 25 g di peso corporeo di ketamina / xilazina cocktail (24 mg / ml e 4,8 mg / ml) del giorno di interesse. Monitorare il mouse per il livello di anestesia controllando pizzico punta reflex. Continuare con protocollo solo quando il mouse mostra alcuna risposta ad una presa punta ferma.
   NOTA: Altri metodi di anestesia può essere usato fino a quando il livello appropriato di anestesia viene raggiunto primaprocedere con il protocollo.
4. Posizionare il mouse in posizione supina sulla piattaforma di schiuma coperto. Pin tutti e quattro gli arti fuori ai piedi poi spruzzare il petto e l'addome con il 70% di etanolo (EtOH) (Figura 2A). L'aggiunta di alcuni asciugamani di carta sterili sotto il mouse può essere utilizzato per assorbire troppo pieno di liquidi di perfusione.
5. Sollevare la pelle appena sotto lo sterno con una pinza poi usare le forbici per fare un'incisione. Tirate la pelle per esporre il torace (Figura 2B).
6. Sollevare xiphoid processo ed effettuare una incisione addominale appena sotto il diaframma, esponendo il fegato che viene bruscamente sezionato distanza dal diaframma. Fare due incisioni, uno a sinistra e uno a destra attraverso il diaframma e la parte inferiore delle costole. Estendere le incisioni sinistro e destro circa 1 / 2-2 / 3 fino alla cassa toracica, che viene poi riflessa indietro per aprire la cavità toracica (Figura 2C).
   NOTA: Fare attenzione a non tagliare tutti gli organi o vasi sanguigni principali duanello questa procedura come in questo modo si compromette la qualità di perfusione.
7. Profumato transcardiaca con 10-20 ml eparina / Saline seguita da 10-20 ml 4% PFA.
   NOTA: Se la perfusione è fatto correttamente, il fegato si trasformerà da rosso a marrone (Figura 2D). Se non fatto correttamente, i vasi sanguigni saranno visibili (Figura 2E).
8. Capovolgere il mouse sul suo addome, i piedi ri-pin poi spruzzare testa e il collo con il 70% EtOH. Sollevare pelle dalla base del collo e fare una incisione. Togliere la pelle per esporre il cranio (Figura 2F). Decapitare testa a livello delle spalle. Rimuovere il cranio, rimuovere delicatamente il cervello, e metterlo in una fiala di scintillazione pieno di 4% PFA (Figura 2G-H).
   NOTA: Se ben perfuso, il cervello appare bianca senza vasi sanguigni visibili (Figura 2i). Se il cervello non è ben perfuso, vasi sanguigni saranno visibili (Figura 2J).
9. Posizionare la scintillazione flaconcino con cervello in 4% PFA a 4 ° C durante la notte, coperto dalla luce. Sciacquare il cervello in non-USP grado 1x PBS e trasferimento in un nuovo flacone scintillazione piena di freddo 1x PBS. Conservare il cervello in 1x PBS a 4 ° C, coperto dalla luce.
   NOTA: compensazione di successo e di imaging è stato realizzato con sezioni memorizzati in 1x PBS per fino a un mese, ma è meglio sezione cervello in pochi giorni lo stoccaggio prolungato in PBS inverte la fissazione PFA e potrebbe portare a meno di immagini ottimali . Autofluorescenza e una maggiore sfocatura sono stati notati in alcuni tratti imaged dopo stoccaggio in 1x PBS per un mese o più.

3. Cervello sezionamento

1. Rimuovere il cervello da 1x PBS e metterlo in una matrice cerebrale (Figura 3A) per consentire una maggiore precisione e taglia anche attraverso il cervello. Tagliare i bulbi olfattivi cervelletto e, se presente, e poi tagliare il cervello coronale in 2 o 3 sezioni.
   NOTA: rifilatura e taglio del cervello può essere fatto senza l'aiuto di una matrice cerebrale. Numero di sezioni tagliate coronale dipenderà dalla distanza di taglio del Vibratome utilizzato. Il cervello può essere sezionato in qualsiasi orientamento, anche se le sezioni sagittali e coronali sono più comunemente utilizzati per l'identificazione neuroanatomica.
2. Fissare ciascuna sezione del cervello su un blocco di montaggio campione con cianoacrilato. Applicare un piccolo blocco di 5% agarosio gel dietro la parte del cervello per il supporto (Figura 3B).
   NOTA: altri meccanismi di sostegno possono essere utilizzati, ma senza il sostegno, la Vibratome possono spingere sul cervello provocando sezionamento irregolare.
3. Tagliare il tessuto in 160 micron (distanza di lavoro dell'obiettivo utilizzata per l'imaging) sezioni spesse con Vibratome impostati ad una velocità di 4 e ampiezza 9.
   NOTA: Le impostazioni per la velocità e l'ampiezza può essere regolata a seconda della particolare macchina utilizzata per ottenere anche, sezioni lisce. Se le impostazioni sononon è corretto, il risultato può essere sezioni irregolari, lacerazione dei tessuti marchi o chiacchiere.
4. Raccogliere sezioni di tessuto in una fiala di scintillazione pieno di fresche, refrigerate 1x PBS se stanno per essere liquidati entro una settimana. Se le sezioni non stanno per essere liquidati entro una settimana, luogo sezioni in provette da 1,5 ml microcentrifuga riempiti con una soluzione crioconservante e conservare a -20 ° C.

4. Compensazione ottica di tessuto cerebrale Sezioni

NOTA: Questo protocollo è stato modificato da un metodo precedentemente pubblicato ^8.

1. Preparare 25%, 50%, 75% e 90% vol / vol glicerolo in PBS 1x + 2% Tween-20 (Gl / PBST).
2. Rimuovere le sezioni da 1x PBS o, se in crioconservante, sciacquare in 1x PBS e trasferimento in una fiala di scintillazione contenente 10 ml di 25% Gl / PBST. Posizionare flaconcino su un agitatore a 4 ° C, coperto dalla luce, per 12 hr.
3. Verificare che tutte le sezioni sono affondate al bottom della fiala. Aspirare il 25% Gl / PBST, lasciando appena sufficiente a coprire le sezioni poi riempire la fiala con 10 ml 50% Gl / PBST e posto su un agitatore a 4 ° C, coperto dalla esposizione alla luce, per 12 ore. Ripetere questo processo per il 75% Gl / PBST poi il 90% Gl / PBST. Lasciare sezioni del 90% Gl / PBST per 24 ore per raggiungere la massima compensazione. Nel corso del processo di compensazione, osservare compensazione ottica graduale (Figura 4).
   NOTA: Questo processo può essere accelerato se le soluzioni sono cambiati immediatamente dopo sezioni sono affondate al fondo della fiala. Nelle soluzioni 75% e 90%, sezioni non affondare fino al fondo del flacone, ma galleggia nel mezzo.

5. montaggio Sezioni tessuto cerebrale

1. Tagliare un No. 1.5 coprioggetto in 5 pezzi per creare un distanziatore. Con una matita righello e diamantata a segnare e rompere il vetrino lungo le linee tratteggiate in Figura 5A. Elimina tegli pezzo centrale, organizzare i 4 pezzi esterni su un vetrino semplice per creare una finestra, e poi spazzolare smalto trasparente sulle cuciture di aderire i pezzi del distanziale alla diapositiva nella configurazione corretta (Figura 5B).
   NOTA: Il distanziale viene utilizzato per creare lo spazio necessario tra il vetrino e coprioggetto per il montaggio delle sezioni eliminato. Il coprioggetto può essere tagliato in modi diversi per creare qualsiasi finestra dimensione necessaria. Pre-taglio distanziali schiuma sono anche disponibili in commercio. Per consentire smalto si asciughi completamente, è meglio fare le diapositive con distanziatori almeno un giorno prima le sezioni di montaggio.
2. Sezioni Trasferire una diapositiva con una pipetta di trasferimento in plastica con la punta tagliata. Assicurati di inserire dintorni con il 90% Gl / PBST. Abbassare delicatamente un coprioggetto sopra sezioni facendo attenzione a non introdurre bolle. Eccesso Gl / PBST può essere malvagio via con un libero di pelucchi.
3. Immagine GFP ⁺ neuroni contenenti RFP ⁺ Cisti Toxoplasma gondii con un microscopio confocale immediatamente (Figura 7A-B), quindi conservare i vetrini piano e coperto dalla luce a 4 ° C.
   NOTA: In alternativa, tenuta scivola completamente intorno tutti i bordi per memorizzare e ripreso in un secondo momento. L'uso di smalto trasparente per sigillare diapositiva è opzionale e può rendere più difficile da rimuovere coprioggetto se si dovesse rimuovere le sezioni dal vetrino in un secondo momento per ulteriori elaborazioni.

6. Imaging

NOTA: Ogni microscopio può essere utilizzato che ha la capacità di ottenere alta risoluzione z-stack.

1. Dopo aver trovato inizialmente piano focale a 10X, passare ad un obiettivo 20X e la scansione attraverso la sezione di identificare una ciste situata all'interno di una GFP ⁺ cellule. Centra la regione di interesse (ROI) nel campo visivo.
2. Passare a un obiettivo 40X. Fuoco su e giù attraverso l'intero ROI per assicurarsi che l'intera cella e cyst sono visibili.
   NOTA: Le immagini sono state ottenute utilizzando un microscopio confocale con un obiettivo 40X / 1.30 Olio DIC M27.
3. Utilizzando il software di imaging installati, ottenere una z-stack che include l'intera cella con cisti. Impostazioni medi utilizzati per ottenere immagini sono mostrate in Figura 6.
   NOTA: Le impostazioni possono essere necessario modificare a seconda di ogni sezioni investigatori di tessuto e capacità microscopio.
4. Ottenere una immagine massima sporgenza del z-stack impostando il numero di proiezioni a 1. Ottenere una vista rotazionale intero impostando il numero di proiezioni a 64.
   NOTA: Altri pacchetti software sono disponibili e possono essere utilizzati per ottenere la sporgenza massima, rotazionale nonché altre viste immagini z-stack.
5. Analizzare l'immagine con il software di analisi delle immagini.

Risultati

Figura 7 comprende immagini rappresentative di due cisti contenente GFP ⁺ neuroni da 160 micron due differenti sezioni spesse nonché una misurazione rappresentativa della distanza dal cisti-cellula-corpo Figura 7B. Figure 7 A e B illustrano che questa nuova protocollo permette la visualizzazione del neurone infetto nella sua interezza. Figura 7C mostra che con questa tecnica di imaging, è ora possibile quantificare la distanza tra la cisti ...

Discussione

Dato che i cambiamenti cellulari nelle cellule ospiti infette sono stati collegati a risultati malattia in infezioni da altri organismi intracellulari come l'HIV, la rabbia, e Chlamydia ^18,19, abbiamo sviluppato una tecnica che permetta di studiare le interazioni intime che si verificano tra il sistema nervoso centrale ospitare cellulare e Toxoplasma. Il metodo descritto qui realizza questo obiettivo, consentendo immagini efficiente di neuroni con infezione cronica. Prima dello sviluppo di questo...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vibratome Series 1000 Sectioning System	Technical Products International, Inc.		Other vibratomes are compatible
Glycerol	Fisher Scientific	BP229-1
Tween-20	Fisher Scientific	BP337-500
Premium Slides	Fisher Scientific	12-544-2
#1.5 Coverslips	VWR	48393 251
Diamond Scriber	VWR	52865-005
Zeiss LSM 510 Meta confocal microscope	Zeiss	LSM 510
Ketaject® Ketamine HCl Inj., USP 100 mg/ml	Western Medical Supply, Inc.	4165
AnaSed® Injection Xylazine 20 mg/ml	Lloyd Inc.
ZsGreen Mice	Jackson Laboratories	7906	B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm6(CAG-ZsGreen1)Hze/J
Surgical equipment			Thumb forceps; Fine scissors-angled to side, sharp-sharp; Sharp-sharp scissors; Kelly hemostats; Mayo scissors; Micro spatula.
Human Foreskin Fibroblasts (HFF) cells			These are primary cells from human foreskins.  We make these in-house but they may be purchased from outside vendors.
Dulbecco's High Glucose Modified Eagles Medium (DMEM)	HyClone	SH30081.01
Penicillin Streptomycin Solution, 100x	Corning	30-002-Cl
200 mM L-alanyl-L-glutamine	Corning	25-015-Cl
25 cm2 Canted neck flask	Fisher Scientific	1012639
Phosphate-Buffered Saline, 1x Without Calcium and Magnesium	VWR	45000-446
Phosphate-Buffered Saline, 10x, USP Sterile Ultra Pure Grade	amresco	K813-500ml
Fetal Bovine Serum	Gibco	26140-079
Bright-Line Hemocytometer	Sigma-aldrich	Z359629-1EA
Mouse Brain Slicer Matrix	Zivic Instruments	BSMAS005-1
Sodium Chloride	Fisher Scientific	BP358-1
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa	Sigma-aldrich	H3393-100KU
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	O4042-500
20 ml Disposable Scintillation Vials	Fisher Scientific	FS74500-20
Alcohol, Ethyl, 95%, 190 Proof	In-house	17212945	This product is purchased from an in-house stockroom.  Other companies are compatible.
Imaris Software	Bitplane
Clear nail polish			Other brands are compatible
10 ml Syringe with Luer-Lok	VWR	BD309604	Other syringes are compatible
Three-way Stopcock			Any brand is compatible
Hypodermic needle			Any brand is compatible - used to pin down mouse.
Cell Scraper			Any brand is compatible
25 G x 12" Tubing, Safety Blood Collection Set, with Luer Adapter	Greiner Bio-One	450099	Other brands are compatible