Primer per immunoistochimica su Cryosectioned Rat tessuto cerebrale: Esempio colorazione per Microglia e neuroni

Riepilogo

This introductory level protocol describes the reagents, equipment, and techniques required to complete immunohistochemical staining of rodent brains, using markers for microglia and neuronal elements as an example.

Abstract

L'immunoistochimica è una tecnica largamente usata per rilevare la presenza, la posizione e l'abbondanza relativa di antigeni in situ. Questo protocollo di livello introduttivo descrive i reagenti, le attrezzature e le tecniche necessarie per completare immunoistochimica del tessuto cerebrale dei roditori, utilizzando marcatori per microglia e gli elementi neuronali come esempio. In particolare, questo documento è un protocollo step-by-step per la visualizzazione fluorescente della microglia e neuroni tramite immunoistochimica per Iba1 e Pan-neuronale, rispettivamente. Fluorescenza doppia etichettatura è particolarmente utile per la localizzazione di più proteine ​​all'interno dello stesso campione, fornendo la possibilità di osservare accuratamente interazioni tra tipi cellulari, recettori, ligandi, e / o la matrice extracellulare in relazione l'uno all'altro così come proteina co localizzazione all'interno di una singola cellula. A differenza di altre tecniche di visualizzazione, la fluorescenza immunoistochimica intensità della colorazione può diminuire inle settimane a mesi seguenti la colorazione, se non si prendono le opportune precauzioni. Nonostante questa limitazione, in molte applicazioni di fluorescenza doppia etichettatura è preferito su alternative come 3,3'-diaminobenzidina tetraidrocloruro (DAB) o fosfatasi alcalina (AP), come fluorescenza è più tempo efficiente e permette di differenziare più precisa tra due o più marcatori. La discussione include la risoluzione dei problemi e consigli per promuovere il successo.

Introduzione

L'immunoistochimica è un processo per rilevare antigeni (cioè proteine) in sezioni di tessuto utilizzando anticorpi primari che si legano specificamente agli antigeni di interesse. L'immunoistochimica è stato lanciato da JR Marrack nel 1934, quando decise che gli anticorpi possano localizzare gli antigeni con grande specificità ^1. A partire dal 1942, tra i primi studi in vitro con anticorpi fluorescenti per visualizzare immunoistochimica sono stati pubblicati ^2,3, dopo di che il primo studio in vivo istochimico è stato pubblicato ^4. Durante il 1960, tre decenni dopo l'inizio dei metodi di immunoistochimica, gli anticorpi enzima-coniugati cominciarono ad essere usati come reagenti secondari. Questi metodi sono stati contemporaneamente e indipendentemente sviluppate in Francia e negli Stati Uniti ^5,6. Oggi, una vasta gamma di anticorpi fornisce infinite possibilità per gli studi di immunoistochimica ^7.

"> L'obiettivo generale di questa corrispondenza è quello di fornire una breve introduzione in immunoistochimica, ma non vuole essere una rassegna completa ed esaustiva di questa tecnica Nel metodo descritto, tecniche di immunoistochimica per due antigeni sono presentati (marker di microglia e. neuroni) per la colorazione di paraformaldeide perfuso, saccarosio crioprotetti, cervello di ratto cryosectioned. La colorazione immunoistochimica inizia con il blocco vincolante per ridurre la colorazione di fondo aspecifica antigene. Successivamente, l'incubazione con l'anticorpo primario consente per il legame ad un antigene specifico nel tessuto. Dopo l'anticorpo primario, un altro anticorpo, chiamato anticorpo secondario, viene applicato per collegare l'anticorpo primario a un segnale di visualizzazione coniugato ^8. L'anticorpo secondario obiettivi delle immunoglobuline G (IgG) dominio specifico per le specie in cui l'anticorpo primario è stato sollevato. L'anticorpo secondario amplifica il segnale dell'anticorpo primario poiché le regioni Fab di tegli anticorpi legano secondario a più siti sul dominio IgG dell'anticorpo primario. O enzimi o molecole fluorescenti coniugate alle regioni _c F dell'anticorpo secondario consentono la visualizzazione. Per esempio, un anticorpo primario anti-Iba1 coniglio è un coniglio IgG molecola specifica per Iba1. Quando IgG anti-coniglio asino viene applicato come anticorpo secondario, sarà riconoscere e legarsi a più regioni dell'anti Iba1-IgG di coniglio (vedere Figura 1). L'anticorpo asino può essere visualizzata con vari metodi. Questa corrispondenza concentra sulla rilevazione di un fluoroforo coniugato con l'anticorpo secondario, che riconosce l'anticorpo primario, per la visualizzazione mediante microscopia a fluorescenza. In immunoistochimica fluorescente, una macchia nucleare come Hoechst o DAPI può essere utilizzato per visualizzare tutti i nuclei.

Figura 1: SchRappresentazione ematico di vs diretta tecniche di etichettatura di anticorpi indiretto. Gli anticorpi legano all'antigene di interesse e può essere amplificata da anticorpi secondari sollevate contro la specie degli anticorpi primari. Questa tecnica può essere eseguita utilizzando complesso avidina-biotina (ABC) per l'amplificazione e DAB per la visualizzazione (A), o di un anticorpo secondario fluorescente direttamente coniugato (B). In alternativa, gli anticorpi primari possono essere coniugati direttamente con molte etichette diverse, tra cui la biotina o un fluoroforo (C). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Un metodo alternativo per la visualizzazione di colorazione immunoistochimica utilizza 3,3'-diaminobenzidina tetraidrocloruro (DAB; vedi figure 1 e 2). Ciò differisce dalla fluorescenza utilizzando un biotinilato orafano perossidasi (HRP) anticorpo secondario coniugato, che fornisce un enzima per convertire DAB ad un precipitato che è visibile al microscopio in campo chiaro. Nei casi in cui un unico antigene è di interesse o colorazione è tenuto ad essere di lunga durata, DAB può essere più adatto di colorazione fluorescente. Tuttavia, DAB colorazione non è molto adatto per la differenziazione tra più marcatori, soprattutto se due antigeni nucleari sono di interesse. Per informazioni sui materiali DAB e modifiche di protocollo, consultare Tabella 1. In alternativa, nitro blu tetrazolio cloruro / 5-Bromo-4-cloro-3-indolil fosfato (NBT / BCIP) può essere utilizzato per visualizzare una fosfatasi alcalina (AP) secondario coniugato anticorpo.

Figura 2:. Immagini rappresentative della DAB sezioni di tessuto cerebrale di ratto con etichetta singola nichel-enhanced cervello Rat sareZIONI che sono contrassegnati con DAB nichel-enhanced per Iba1 (A) e Pan-neuronale (B) consentire l'analisi di lunga durata della microglia o neuroni da soli. Bar Scala 20 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Si deve considerare l'abbondanza stimata dell'antigene di interesse all'interno del tessuto che viene analizzato. I metodi indiretti (come descritto sopra) sono utili per gli obiettivi a bassa abbondanza. Quando l'antigene di interesse è molto abbondante, metodi diretti possono essere applicati. Metodi diretti implicano un anticorpo primario che è direttamente coniugato ad un segnale di visualizzazione, e quindi non è richiesta anticorpo secondario. Questo metodo semplifica il processo di colorazione, ma elimina l'amplificazione ottenuti con metodi indiretti. Utilizzando un anticorpo primario direttamente coniugato elimina anche cross-reattività di anticorpi secondariquando doppia etichettatura.

Dettagli La presente comunicazione il protocollo per la doppia etichettatura con Iba1 e Pan-neuronali (dettagli nella tabella 1). Iba1 macchie microglia in molti stati di attivazione, tra cui ramificato, iper-ramificato, attivato, ameboidi, e l'asta. Macchie Pan-neuronali neuronale assoni, dendriti, e soma. Poiché Iba1 macchie più microglia e obiettivi Pan-neuronali del neurone, questa combinazione di macchie è utile ad acquisire una vasta comprensione delle interazioni microglia-neuroni.

In sintesi, immunoistochimica si basa sulla selezione accurata degli anticorpi. Poiché la domanda di ricerca diventa più specifica, anticorpi diretti contro antigeni alternativi possono desiderare. Per individuare un particolare stato di attivazione della microglia, si può scegliere di utilizzare anticorpi CD45 o CD68, piuttosto che Iba1. Inoltre, in collaborazione con i topi, F4 / 80 può fornire i risultati necessari. Allo stesso modo, gli elementi neuronali possono essere specificamente mirati con anticorpi razato contro il nucleo, sinapsi (pre o post), assone, e cono di crescita. Inoltre, ci sono altri indicatori che differenziano l'età del neurone (Double-Cortin, NeuN) e rigenerazione neuronale (GAP-43).

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Protocollo

NOTA: Tutte le procedure sono state eseguite in conformità alla cura e l'uso degli animali Comitato Istituzionale (IACUC) della University of Arizona. Un elenco di materiali e attrezzature raccomandate possono essere trovate nella tabella 1.

1. Preparazione del tessuto

1. Perfusion
   1. Euthanize roditore con una overdose di pentobarbital sodico (25 mg / kg, IP), e profumato transcardially con tampone fosfato salino (PBS) fino a completo dissanguato (3-5 min) a una velocità di flusso di 8 ml / min. Per le istruzioni di perfusione in profondità, vedi Gage et al 2012 ^9.
   2. Subito dopo PBS filo, fissare il tessuto mediante perfusione con paraformaldeide al 4% in PBS per 15-20 min ad una velocità di flusso di 8 ml / min.
   3. Rimuovere cervello e posto in paraformaldeide al 4% per 24 ore, seguita da soluzioni di saccarosio graduati (15%, 30%, 30%, in sequenza, preparata in soluzione salina tamponata con Tris) a 4 ° C. Trasferire il cervello per la successiva soluzione di saccarosio oolo dopo che il cervello ha affondato in ogni soluzione. Nota: Di solito, 5 giorni in ogni soluzione è un tempo sufficiente per il tessuto di affondare.
2. Tissue Congelamento e criosezionamento
   1. Posizionare il cervello in mezzo di inclusione, quali OCT e immergere in isopentano a una temperatura di -35 ° C. Lasciare che il cervello di congelare per un minimo di 10 minuti, e poi conservare a -80 ° C. Possono sorgere problemi se diligenza a temperatura non è presa; si rimanda la discussione per la risoluzione dei problemi.
   2. Tagliare sezioni coronali seriali ad uno spessore di 20 um e una temperatura di -20 ° C. Raccogliere il tessuto su vetrini caricati positivamente. Sezioni del cervello possono essere collocati in una scatola di diapositive avvolto in un foglio in una busta zip-top e conservati a lungo termine a -80 ° C. Questo metodo di memorizzazione crea un doppio limite per evitare l'esposizione all'aria e al gelo.

2. Tissue Processing

NOTA: attrezzature e materiali Esempio r, facoltativo per la colorazione sono mostrati in figura 3. Le alternative sono disponibili, tuttavia, queste immagini aiuteranno chi è nuovo di immunoistochimica per visualizzare elementi del caso prima di procedere all'acquisto.

Figura 3: Esempio di oggetti necessari per la colorazione immunoistochimica La scatola nera mostrato in (A) è una camera di umidità ideale per immunofluorescenza, come diapositive sono protetti dalla luce, senza la necessità di avvolgere la scatola su un foglio.. Dopo sezionamento, vetrini possono essere memorizzati in una scatola quali la scatola gialla mostrato in (B). Avvolgere la scatola ermeticamente in un foglio e messa in un sacchetto di zip-top prima freezer aiuta a proteggere i campioni di tessuto da bruciature da freddo. Un esempio di diapositive è dato in (C), con diversi piatti di colorazione descritti in (D) e (E ). Coprioggetto può variare in termini di dimensioni e spessore (F), tuttavia 1.2 vetrini spessi di risultati di imaging belle sulla maggior parte microscopi diritti e confocale. Una matita come quello mostrato in (G) può essere utilizzato per etichettare diapositive. Marcatore permanente dovrebbe essere evitato come l'inchiostro può essere eseguito, che interessano sia la colorazione e la capacità di determinare ciò che il campione è. Un mini penna pap come quello mostrato in (H) permette un bordo repellenti da trarre su vetrini.

1. Preparazione diapositive
   1. Estrarre i vetrini da freezer e scongelare a temperatura ambiente.
      1. Opzionale: Se le sezioni hanno già galleggiare da diapositive, collocare le diapositive scongelati in forno a 60 ° C per non più di 4 ore per evitare sezioni di tessuto da galleggiante al largo diapositive.
   2. Posizionare i vetrini in un rack scorrevole e piatto corrispondente.
   3. Lavare i vetrini tre volte in PBS per 5 minuti ciascuno, cambiando soluzione tra un lavaggio. Da questo punto in avanti, evitare di avere sectiComponenti senza liquidi per periodi di tempo prolungati. Nota: Se le sezioni asciugano, la colorazione di fondo è aumentata e dati significativi non può essere ottenuto in modo affidabile.
2. Tissue Colorazione
   1. In una scatola di colorazione a tenuta di luce, creare una "camera umida" con i tessuti privi di lanugine imbevuto con acqua deionizzata.
   2. Asciugare i bordi della slitta con un tessuto privo di lanugine, usare un mini penna pap per fare un bordo liquido repellente ai margini della diapositiva, lontano da sezioni di tessuto. Questo bordo dovrebbe garantire un ampio spazio fra il menisco del liquido e il bordo del tessuto in modo che la tensione superficiale non influisce colorazione.
      NOTA: Il confine repellente penna pap può essere applicato prima del 2.1.3, se gli anticorpi di interesse non richiedono microonde recupero dell'antigene. Se la penna pap è stato applicato prima del lavaggio in PBS, l'integrità del confine liquido repellente deve essere controllato in questa fase. Utilizzare una penna mini-pap per colmare eventuali lacune nel confine.
   3. Con diapositive disposti orizzontalmente, l'antigene non specifico blocco vincolante incubando nel 4% v / v siero in PBS (soluzione di blocco). Dispensare 300 ml di soluzione di blocco per vetrino per 1 ora a temperatura ambiente. Assicurarsi che la soluzione blocco estende alla penna pap al bordo della diapositiva e copre completamente il tessuto per evitare colorazione irregolare causato dalla tensione superficiale vicino al tessuto.
      1. Utilizzare siero dalla stessa specie in cui è fatto anticorpo secondario. Nota: In questa procedura, gli anticorpi secondari sono realizzati in asino, e quindi viene utilizzato siero asino. Se si utilizzano anticorpi secondari di due o più specie diverse, includere siero di ogni specie.
   4. Pipetta anticorpo primario su vetrini. Nota: le concentrazioni di anticorpi per questa colorazione sono stati ottimizzati a 1: 5.000 e 1: 500 per Iba1 e Pan-neuronale, rispettivamente. Queste concentrazioni sono stati trovati per mostrare colorazione significativo con l'assenza di colorazione di fondo.
      1. Diluire soluzione blocco1% di siero in PBS e aggiungere anticorpi primari. Dispensare 300 ml di soluzione di anticorpo primario in 1% di siero per vetrino. Ancora una volta, assicura il fluido è al bordo della penna pap. Incubare per una notte a 4 ° C.
      2. Include tre vetrini di controllo: uno che contiene anticorpi né Iba1 né Pan-neuronali, una con Iba1 senza anticorpi Pan-neuronale, e uno con l'anticorpo Pan-neuronale senza Iba1. Macchia queste diapositive nella stessa seduta con le stesse soluzioni, tuttavia omettere le anticorpi primari per verificare il legame degli anticorpi secondari non specifici.
   5. La mattina seguente, lavare i vetrini tre volte in PBS per 5 minuti ciascuno, cambiando soluzione tra un lavaggio.
   6. Gli anticorpi fluorescenti sono sensibili alla luce, quindi, da questo punto in avanti, ridurre al minimo l'esposizione alla luce garantendo contenitori lavaggio sono avvolti in fogli e ibridazione scatole sono nero o incubate al buio. Pipettare gli anticorpi secondari appropriati in tutte le diapositive e incubare per60 min a temperatura ambiente ad una concentrazione di 1: 250 in soluzione di blocco (vedere fase 2.2.3) in una "camera umida" a tenuta di luce (vedere fase 2.2.1).
      1. Utilizzare anticorpi secondari di differenti lunghezze d'onda. Qui, per il coniglio anticorpo primario anti-Iba1, utilizzare asino anti-coniglio 594 come l'anticorpo secondario appropriato. Per il mouse anticorpo primario anti-Pan-neuronale, utilizzare asino anti-topo 488 come l'anticorpo secondario appropriato. In alternativa, utilizzare anti-coniglio 488 e anti-topo 594.
   7. Lavare i vetrini tre volte in PBS per 5 minuti ciascuno.
   8. Opzionale: eseguire colorazione nucleare.
      1. Posto in Hoechst (o altro colorazione nucleare) ad una concentrazione di 0,03 mg / ml in doppia H ₂ 0 distillata per esattamente 60 sec.
      2. Lavare i vetrini tre volte in PBS per 5 minuti ciascuno.
   9. Lavare in DDH ₂ 0.
3. Coprioggetto
   1. Vetrini coprioggetto con un mezzo di montaggio a base acquosa, come Fluoromount-G o ProlongGold. Fare attenzione a rimuovere tutte le bolle con un applicatore di cotone con punta.
      Nota: Altri agenti di montaggio potrebbero essere utilizzati, per quanto alto sanguinare-through tra coloranti è stato notato da alcuni pochi giorni di copertura dei vetrini.
   2. Utilizzare smalto trasparente per sigillare i bordi, impedendo sezioni si secchi a causa dell'evaporazione. Lasciare smalto si asciughi in un contenitore a tenuta di luce mentre scivoli resta piatta ea temperatura ambiente, e poi conservare in un contenitore a tenuta di luce avvolti in un foglio a 4 ° C.

3. Imaging Tissue Stained

1. Microscopia
   1. Lasciare che il smalto ad asciugare per almeno un'ora prima di iniziare la microscopia, che dovrebbe avvenire in una stanza buia.
   2. Acquisire microfotografie usando un confocale o microscopio di ricerca con una sorgente di luce fluorescente e un attacco della telecamera digitale. Utilizzando il software di accompagnamento, impostare l'esposizione per ogni lunghezza d'onda - 405, 488, e 594 - separatamente. Nota: in modo approfondito le istruzioni di imaging dovrebbero essere disponibili on-line presso il produttore del microscopio.
   3. Acquisire microfotografie in ogni canale senza spostare le sezioni o la regolazione della messa a fuoco. Prendere immagini a colori, in scala di grigi o alternativamente e convertire in colore dopo.
      Nota: Il colore o scala di grigi di ciascun canale possono essere raccolti in post-processing.
   4. Assicurarsi che le sezioni di tessuto non siano esposti a luce ambiente o alla luce microscopica per lunghi periodi di tempo, come si verificherà fotometabolismo delle sezioni. Per evitare questo, aumentare il tempo di esposizione, piuttosto che aumentando l'intensità della luce / laser.
   5. Non spegnere la sorgente di luce fluorescente entro 30 minuti di essere stato acceso.
      Nota: Modificare la sorgente e lo spegnimento in rapida successione, potrebbe diminuire la durata della vita della lampadina fluorescente.

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Risultati

Questo protocollo di colorazione si traduce in sezioni di tessuto di cervello di ratto che hanno microglia fluorescente nel 594 canali (rosso) e neuroni marcati nel 488 canali (verde; vedi Figura 4). Se una colorazione nucleare è stato fatto, mostrerà nel canale 405 (blu). Le immagini possono essere prese in canali diversi e sovrapposti per confronto diretto dei tre canali, o tra due canali. Molte suite software di acquisizione digitale comprendono questa funzionalità. Doppia etichettatura con Iba1 e...

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Discussione

L'obiettivo generale di questa comunicazione è stato quello di introdurre procedure immunoistochimiche al lettore. Per questo, l'esempio della doppia etichettatura con Iba1 e antigeni Pan-neuronali per osservare microglia e neuroni in paraformaldeide perfusione, è stato utilizzato il saccarosio cervello crioprotetti, ratto cryosectioned.

Questa tecnica può essere adattata per servire scopi infinite. Una serie di diversi antigeni in una varietà di tipi di tessuto, come, ma non lim...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fisherbrand Superfrost Plus Glass Slides	Fisher Scientific	22-034-979	Used for tissue mounting (1.2.2)
Oven	Thermo Scientific	51028112	Used for tissue drying (2.1.1)
Mini Pap pen	Life Technologies	00-8877	Used in step 2.2.2
Andwin Scientific Tissue-tek Slide Staining Dish	Fisher Scientific	22-149-429	Used for all washes during staining (2.2), as well as the Hoechst step (2.2.8)
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666-A	Used for drying slides (2.2)
Black Staining Box	Ted Pella	21050	Used for blocking and staining steps (2.2)
Normal Donkey Serum	Fisher Scientific	50-413-253	Used for block and antibody incubation (2.2)
Mouse α-Pan-neuronal	Millipore	MAB2300	Used for primary antibody (2.2.4)
Rabbit α-Iba1	Wako Chemical	019-19741	Used for primary antibody (2.2.4)
Donkey α-rabbit 594	Jackson ImmunoResearch	711-585-152	Used for secondary antibody (2.2.6)
Donkey α-mouse 488	Jackson ImmunoResearch	715-545-150	Used for secondary antibody (2.2.6)
Caterer's foil	Any	N/A	Used in steps 1.2.2 and 2.3.2
Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01	Used for coverslipping (2.2.8)
Coverslips	Fisher Scientific	12544E	Used for coverslipping (2.2.8)
Clear Nail Polish	Any	N/A	Used for coverslipping (2.2.8)
Axio Observer.Z1 and LSM 710 (laser scanning, confocal)	Carl Zeiss	N/A	Used for imaging (3)
Axioskop A2	Carl Zeiss	N/A	Used for imaging (3)
CitriSolv	FisherScientific		For DAB protocol
ABC	Vector Laboratories	PK-6100	For DAB protocol
DAB Peroxidase kit	Vector Laboratories	SK-4100	For DAB protocol
Biotinylated horse α-rabbit IgG	Vector Laboratories	BA-1100	For DAB protocol
Biotinylated horse α-mouse IgG	Vector Laboratories	BA-2001	For DAB protocol
30% Hydrogen Peroxide	FisherScientific	H325-500	For DAB protocol
Wheaton slide racks and staining dishes	TedPella	21043	For DAB protocol
Masterflex perfusion pump and tubing	Cole-Parmer		Used for perfusion (1.1.1 and 1.1.2)
Andwin scientific tissue-tek CRYO-OCT compound (case of 12)	Fisher Scientific	14-373-65	Used for tissue freezing (1.2.1)
Thermometer (-50 to 50 C)	Fisher Scientific	15-059-228	Used for tissue freezing (1.2.1)
Cryostat	Leica	CM3500S	Used for tissue sectioning (1.2.2)
Staining Dish, Plastic with 2 Lids	Grale Scientific	353	For antigen retrival
20 Place Staining Rack, Slides Horizontal	Grale Scientific	354	For antigen retrival
Microwave	Any	N/A	For antigen retrival