Preparazione e caratterizzazione di SDF-1α-Chitosan-Destrano solfato nanoparticelle

Riepilogo

The objective of this protocol is to incorporate SDF-1α, a stem cell homing factor, into dextran sulfate-chitosan nanoparticles. The resultant particles are measured for their size and zeta potential, as well as the content, activity, and in vitro release rate of SDF-1α from the nanoparticles.

Abstract

Chitosan (CS) and dextran sulfate (DS) are charged polysaccharides (glycans), which form polyelectrolyte complex-based nanoparticles when mixed under appropriate conditions. The glycan nanoparticles are useful carriers for protein factors, which facilitate the in vivo delivery of the proteins and sustain their retention in the targeted tissue. The glycan polyelectrolyte complexes are also ideal for protein delivery, as the incorporation is carried out in aqueous solution, which reduces the likelihood of inactivation of the proteins. Proteins with a heparin-binding site adhere to dextran sulfate readily, and are, in turn, stabilized by the binding. These particles are also less inflammatory and toxic when delivered in vivo. In the protocol described below, SDF-1α (Stromal cell-derived factor-1α), a stem cell homing factor, is first mixed and incubated with dextran sulfate. Chitosan is added to the mixture to form polyelectrolyte complexes, followed by zinc sulfate to stabilize the complexes with zinc bridges. The resultant SDF-1α-DS-CS particles are measured for size (diameter) and surface charge (zeta potential). The amount of the incorporated SDF-1α is determined, followed by measurements of its in vitro release rate and its chemotactic activity in a particle-bound form.

Introduzione

Solfato Dextran (DS) e chitosano (CS) sono polisaccaridi con più sostituiti gruppi solfato carica negativa (a DS), o gruppi di ammine cariche positivamente (deacetilata CS). Quando miscelato in una soluzione acquosa, i due polisaccaridi formano complessi polielettroliti attraverso interazioni elettrostatiche. I complessi risultanti possono formare grandi aggregati che verrà a fasi separate dalla soluzione acquosa (precipitati), o piccole particelle che sono disperdibili in acqua (colloidi). Le condizioni specifiche che contribuiscono a questi risultati sono stati ampiamente studiati e sono stati riassunti ed illustrato in dettaglio in una recente revisione ^1. Tra queste condizioni, due requisiti fondamentali per la produzione di particelle idrodispersibili sono i polimeri di carica opposta devono 1), una massa molare significativamente diverse; e 2) essere miscelato in un rapporto non stechiometrica. Queste condizioni permetteranno ai complessati segmenti polimerici carica neutrale generate dalla caricaneutralizzazione di segregare e formare il nucleo della particella, e il polimero in eccesso per formare il guscio esterno ^1. Le particelle glycan descritti in questo protocollo sono destinati per la consegna polmonare, e sono progettati per essere al netto carica negativa, e di dimensioni nanometriche. La carica superficiale negativa riduce la probabilità di assorbimento cellulare delle particelle ^2,3. Particelle di dimensioni nanometriche facilitano il passaggio attraverso le vie aeree distali. Per raggiungere questo obiettivo, la quantità di DS usato in questa preparazione è in eccesso di CS (rapporto in peso 3: 1); ed alto peso molecolare DS (medio ponderale Mw 500.000) e basso peso molecolare CS (MW 50-190 kDa, 75-85% deacetilato) sono utilizzati.

SDF-1α è un fattore di homing delle cellule staminali, che esercita la funzione di riferimento attraverso la sua attività chemiotattica. SDF-1α svolge un ruolo importante in homing e manutenzione di cellule staminali ematopoietiche del midollo osseo, e nel reclutamento di progecellule Nitor per tessuti periferici per la riparazione del pregiudizio ^4,5. SDF-1α ha un sito-eparina vincolante nella sua sequenza della proteina, che permette la proteina di legarsi all'eparina / eparansolfato, formare dimeri, essere protetti da proteasi inattivazione (CD26 / DPPIV), e di interagire con le cellule bersaglio tramite i recettori della superficie cellulare ^6-8. DS ha simili proprietà strutturali come eparina / eparansolfato; pertanto, il legame di SDF-1α DS sarebbe simile a quella dei ligandi polimerici naturali.

Nella seguente protocollo, si descrive la preparazione di nanoparticelle SDF-1α-DS-CS. Le procedure rappresentano una delle formulazioni precedentemente studiate ^9. Il protocollo è originariamente adattato da un'indagine di nanoparticelle VEGF-DS-CS ^10. Una piccola scala preparazione è descritta, che può essere facilmente scalata con le stesse soluzioni stock e condizioni di preparazione. Dopo la preparazione, le particelle sono caratterizzati by esaminando le loro dimensioni, potenziale zeta, estensione di incorporazione SDF-1α, tempo di rilascio in vitro, e l'attività del incorporata SDF-1α.

Protocollo

1. Preparazione di SDF-1α Glycan nanoparticelle

Grazie allo scopo della fornitura in vivo, sterilizzare tutti i contenitori, pipette e puntali usati nella preparazione.

1. Preparare le seguenti soluzioni madre in UltraPure Acqua: 1% di solfato di destrano; 1 M NaOH (sterile filtrata con una membrana PES); 0,1% chitosano in 0,2% di acido acetico glaciale (filtro attraverso 0,8 e 0,22 micron filtri consecutivamente e regolare il pH a 5,5 con NaOH in seguito); 0.1 M _ZnSO4; 15% mannitolo; e 0,92 mg / ml SDF-1α (memorizzati in aliquote a 80 ° C, e conservato a 4 ° C una volta scongelati).
2. Sterilizzare soluzioni madre attraverso 0,22 micron membrane filtranti. Valutare i livelli di endotossine nella soluzione preparata con dosaggio limulus lisato di amebociti (LAL) gel coagulo. Assicurarsi che i livelli sono <0,06 EU / ml.
3. Aggiungere 0,18 ml UltraPure acqua per un flaconcino di vetro da 1,5 ml contenente un bastoncino magnetico. Impostare la velocità scalpore a 800 giri al minuto. Aggiungere 0,1 ml 1%solfato destrano e mescolare per 2 minuti. Aggiungere 0,08 mg SDF-1α (0,087 ml di 0,92 mg / ml SDF-1α soluzione) e mescolare per 20 min.
4. Aggiungere 0,33 ml 0,1% chitosano, goccia a goccia e mescolare per 5 min. Cambio di velocità mescolare al massimo e aggiungere 0,1 ml 0,1 M _ZnSO4 lentamente con una siringa da 0,1 ml (oltre 1 min).
5. Ritorna velocità mescolare a 800 giri al minuto e mescolare per 30 min. Aggiungere 0,4 ml 15% mannitolo e mescolare per 5 min. Trasferire la miscela di reazione in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. Centrifugare a 16.000 xga 4 ° C per 10 min.
   Nota: La presenza di mannitolo facilita la risospensione delle particelle dopo centrifugazione. A seconda della compattezza del pellet, la concentrazione mannitolo può essere variata da 0% al 5%. La completa risospensione delle particelle dopo ogni centrifugazione è fondamentale per evitare aggregati nella sospensione finale.
6. Aspirare il surnatante e utilizzare una pipetta per rimuovere l'ultima goccia di liquido lentamente. Aggiungere 0,2 ml 5% mannitolo. Sospendere il pellet con 0,5 ml, 29 G neesiringa dle. Aggiungere 1 ml 5% mannitolo. Centrifugare a 16.000 xg per 15 min.
7. Ripetere il punto 1.6.
8. Aspirare il surnatante. Risospendere il pellet in 0,2 ml 5% mannitolo. Conservare la sospensione di particelle a 4 ° C.
   Nota: La sospensione di particelle può anche essere congelati a -80 ° C o liofilizzato. Compresi 5% mannitolo nella sospensione è essenziale per prevenire l'aggregazione delle particelle dopo il congelamento e scongelamento o dopo liofilizzazione e reidratazione. Mannitolo può essere rimosso mediante centrifugazione della sospensione dopo lo stoccaggio.

2. Determinazione della dimensione delle particelle e Zeta Potenziale

La dimensione delle particelle e il potenziale zeta sono analizzati mediante dynamic light scattering e light scattering elettroforetico, rispettivamente, con un analizzatore di particelle indicato nella Lista dei Materiali.

1. Impostare i seguenti parametri per la misurazione delle dimensioni delle particelle: i tempi di accumulazione: 70; Tempi di ripetizione: 4; Temperatura: 25 ° C;Diluente: acqua; Regolazione Intensità: auto.
2. Diluire il campione di SDF-1α-DS-CS con acqua (diluizione 10 volte). Caricare 100 microlitri del campione ad una cuvetta UV monouso come una cuvetta Eppendorf. Inserire la cuvetta nel supporto cella. Attendere che la regolazione dell'intensità di raggiungere "Optimum" (~ 10.000 cps). Avviare acquisizione dati.
3. Dopo la misurazione è completata, registrare i risultati cumulanti di diametro (nm) e l'indice di polidispersità. Media dei risultati ottenuti da ciascuna delle 4 letture ripetute e calcolare la deviazione standard.
4. Carico 500 ml di 10 volte diluito campione di particelle ad una cella di flusso per la misura potenziale zeta. Impostare i seguenti parametri per la misurazione: i tempi di accumulazione: 10; Ripetere volte: 5; Temperatura: 25 ° C; Diluente: acqua; Regolazione Intensità: auto. Registrare i risultati del potenziale zeta (mV). Media la risultato di ciascuna delle 5 letture ripetute, e calcolare la deviatio serien.

3. Quantificazione di SDF-1α nelle particelle

1. Diluire forma libera SDF-1α a concentrazioni di 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, e 0,05 mg / ml in tampone 1.3x Laemmli. Diluire 6 microlitri campioni SDF-1α-DS-CS con 40 microlitri 1.3x tampone Laemmli. (Preparare 4x Laemmli scorta contenente 0,25 M Tris-HCl, pH 7.5, 8% SDS, 40% glicerolo, 0,05 mg / ml bromofenolo blu, e l'8% 2-mercaptoetanolo. Dividere la soluzione di riserva in piccole aliquote e tenere a -20 ° C per uso singolo.)
2. Riscaldare i campioni a 100 ° C per 10 min. Vortex campioni due volte (ciascuno per 10 sec a velocità massima) durante il tempo di riscaldamento 10 min per dissociare completamente le particelle. Raffreddare i campioni a RT per 2 min. Centrifugare a 10.000 xg per 0,5-1 minuti per abbattere la condensa dell'acqua. Nuovo Vortex per mescolare bene.
   Nota: A questo punto, la soluzione del campione deve essere chiaro senza alcun precipitato visibile presente.
3. Load 10 &# 181; l campione / bene ad un gel SDS 4-20%. Eseguire elettroforesi a 200 V per 20 min. Colorare il gel con Coomassie macchia proteine ​​blu.
4. Esaminare la densità di banda della proteina di SDF-1α con un imager e analisi densitometria software molecolare. Calcolare la quantità di SDF-1α nelle particelle contro una curva standard costruita con connessione standard SDF-1α.

4. In Vitro saggio di rilascio

1. Mescolare particelle glycan SDF-1α con tampone fosfato di Dulbecco senza calcio e magnesio (D-PBS) in un rapporto 1: 1 (v / v).
2. Dividere la sospensione di particelle in 0,05 ml aliquote in provette da 1,5 ml. Caricare i campioni al fondo delle provette. Evitare l'introduzione di bolle d'aria o disturbare la superficie del liquido. Sigillare la parte superiore dei tubi con Parafilm.
   NOTA: In tal modo, il liquido rimane sul fondo durante la successiva rotazione top-to-bottom del mixer tubo.
3. Ruotare i tubi a 37 &# 176; C su un rotante Mixer Micro-Tube. Rimuovere aliquote dai tubi ai tempi indicati e centrifugare immediatamente i campioni a 16.000 xg per 10 min a 4 ° C.
4. Separare i supernatanti e pellet, e ricostituire il pellet con 0,05 ml di D-PBS. Conservare i campioni a -20 ° C. Dopo che tutti i campioni sono raccolti, esaminare i supernatanti e pellet su un gel SDS come descritto sopra.

5. Migration Assay

Questo test misura l'attività chemiotattica di SDF-1α. Interazione di SDF-1α con il suo recettore (CXCR4) sulla superficie cellulare provoca la migrazione della cellula verso il gradiente SDF-1α. In questo test, le cellule vengono caricati in un pozzo superiore (separati da una membrana semipermeabile da una minore ben) Soluzione e SDF-1α in un minor bene.

1. Diluire SDF-1α (libero o di particelle-bound form) con tampone di migrazione (media RPMI-1640 contenente 0,5% di albumina sierica bovina) in un 3-fodiluizione in serie ld a concentrazioni finali di 100, 33, 11, 3,7, 1,2, 0,41, 0,14, e 0,05 ng / ml.
2. Aggiungere 0,6 ml della soluzione di SDF-1α diluito o tampone di migrazione solo (controllo negativo) per un pozzo nella piastra a 24 pozzetti. Aggiungere 0,57 ml di tampone di migrazione a un pozzo (controllo cella di input). Incubare a 37 ° C per 30 min. Inserire un permeabile inserto coltura cellulare come Transwell (dimensione dei pori 5 micron, Ø 6,5 mm) sulla parte superiore del pozzo inferiore. Carico 0,1 ml cellule Jurkat (5 × 10 ⁵⁾ nella Transwell inserire. Caricare 0,03 ml cellule direttamente al controllo cella di input bene. Incubare la piastra a 37 ° C per 2 ore in un incubatore CO ₂ 5%.
3. Rimuovere gli inserti Transwell. Trasferire le cellule che sono emigrati ai pozzetti inferiori ad una provetta di polistirene 4 ml. Contare le cellule migrate con citometro di flusso.
4. Calcolare la migrazione come percentuale del numero di cella di input (numero di cellule nel controllo cella di input ben x 100/30) dopo la sottrazione dei numeri in negative controlli (cellule migrate nei pozzetti contenenti solo buffer di migrazione).

Risultati

La dimensione e il potenziale zeta delle particelle preparate SDF-1α-DS-CS sono determinate con un analizzatore di particelle. La Figura 1 mostra l'analisi della misura di formato. Dai risultati ottenuti cumulanti quattro misurazioni ripetute, il diametro medio delle particelle idrodinamico SDF-1α-DS-CS è 661 ± 8.2 (nm) e la polidispersità è 0.23 ± 0.02. Il risultato della misurazione potenziale zeta è mostrato in Figura 2. Dalle cinque misurazioni ripetute, il potenziale ze...

Discussione

Come accennato in precedenza, le nanoparticelle DS-CS sono formati attraverso la neutralizzazione di carica tra polianione (DS) e policatione (CS) molecole. Poiché l'interazione di carica avviene facilmente durante la collisione molecolare, la concentrazione delle soluzioni polimeriche e la velocità di agitazione durante la miscelazione è critica per la dimensione delle particelle risultanti. Una tendenza generale è che più diluita DS e CS soluzioni ¹⁵ e superiori risultato velocità di agitazione in...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dextran sulfate	Fisher	BP1585-100
Chitosan, low molecular weight	Sigma	448869
Zinc sulfate heptahydrate	Sigma	204986
D-Mannitol	Sigma	M9546
UltraPure water	Invitrogen	10977-023
SDF-1α	Prepared according to reference 8.
Syringe filter, PES membrane 0.22 μm	Millipore	SLGP033RS
Magnetic Micro Stirring Bars (2 x 7 mm)	Fisher	14-513-63
Glass vial Kit; SUN-SRi	Fisher	14-823-182
Delsa Nano C Particle Analyzer	Backman Coulter
Eppendorf UVette Cuvets	Eppendorf	952010069
4–20% Mini-PROTEAN TGX Gel	Bio-Rad	456-1096
GelCode Blue Safe Protein Stain	Fisher	PI-24592
Molecular Imager VersaDoc MP 4000 System	BioRad	170-8640
Corning Transwell Permeable Supports	Corning	3421
Accuri C6 Flow Cytometer	BD Biosciences
Dulbecco’s phosphate buffered saline	Sigma	D8537
Pyrogent plus kit	Fisher	NC9753738