Tecnica chirurgica per l&#39;impianto di ingegneria tessutale vascolari Innesti e successive<em&gt; In Vivo</em&gt; Monitoraggio

Riepilogo

Un protocollo step-by-step per il collocamento inter-posizionale di ingegneria tessutale Vessels (TEV) nella carotide di una pecora con anastomosi end-to-end e di valutazione digitale in tempo reale in vivo fino al sacrificio degli animali.

Abstract

Lo sviluppo di ingegneria tessutale Vessels (TEV) è avanzata dalla capacità di di routine ed efficace TEV impianto (4-5 mm di diametro) in un grande modello animale. Un protocollo passo-passo per il posizionamento tra posizionale della valutazione TEV digitale in tempo reale del TEV e arterie carotidi native è descritto qui. In vivo monitoraggio è reso possibile dal impiantazione di sonde di flusso, cateteri e cristalli ultrasonici (grado di registrare i cambiamenti di diametro dinamici di TEV impiantati e delle arterie carotidi native) al momento della chirurgia. Una volta impiantato, i ricercatori possono calcolare i modelli flusso di sangue arterioso, invasiva della pressione arteriosa e del diametro dell'arteria che producono parametri come la velocità dell'onda di polso, indice di aumento, le pressioni di impulsi e la conformità. L'acquisizione dei dati viene eseguita utilizzando un singolo programma per computer per l'analisi per tutta la durata dell'esperimento. Tali dati inestimabile permette di comprendere meglio TEV rimodellamento della matrice, la sua resemblanCé a controlli nativi / sham e prestazioni TEV generale in vivo.

Introduzione

L'obiettivo principale per lo sviluppo di TEV è stato quello di fornire un sostituto per la sostituzione del trapianto autologo quando vasi autologhi non sono disponibili e limitare donatori di vista morbilità. Ad esempio, il numero di interventi di bypass coronarico all'anno ha superato 350.000 negli Stati Uniti, e la fonte ideale di opportuni innesti rimane fianco arteria mammaria interna, discendente anteriore dell'arteria coronaria e safena ^1. Dal momento che molte persone che soffrono di malattie vascolari non possono avere le arterie e le vene adatte per la sostituzione del trapianto autologo, lo sviluppo di TEV è così diventato un campo di intensa ricerca da decenni ^1-6. Mentre la progettazione e l'ottimizzazione di nuovi TEV hanno subito molti progressi, relazioni sulle tecniche chirurgiche impiegate per impiantare i TEV stessi non è stato un argomento di tale discussione intensa. Piuttosto, i protocolli per quanto riguarda l'impianto di TEV in modelli animali sono in gran parte lasciatifino alla ricerca investigatori.

Il seguente manoscritto illustrato come impiantare TEV utilizzando un approccio anastomosi end-to-end. Questa procedura è stata ottimizzata utilizzando uno specifico modello di sutura anastomotica, stabilizzante tecnica di sutura, ottimizzando tensione longitudinale e l'aggiunta di monitoraggio in vivo strumentazione. Questo metodo è in contrasto con alcune delle molte varianti che sono state usate in precedenza. Inoltre, questa procedura viene descritto come acquisire i parametri come la pressione arteriosa, TEV diametro / conformità e portata attraverso il TEV dopo l'intervento fino espianto. Questa raccolta di dati fornisce un'analisi indispensabile del TEV mentre è in fase di rimodellamento.

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Protocollo

NOTA: Questo protocollo è stato approvato dalla cura e l'uso degli animali Comitato presso la State University di New York a Buffalo.

Preparazione 1. Pre-chirurgica

1. Utilizzare pecore (Dorset croce, femmina, circa 1-3 anni con un peso di 40-60 kg) per il seguente studio. Somministrare ciclosporina A (200 mg / die), aspirina (975 mg / die), e coumadin (20-30 mg / die) per via orale, iniziando 3 giorni prima chirurgia e continua per tutta la durata di tutti gli studi.
2. Assicurarsi che la pecora ha digiunato 12 ore prima dell'intervento chirurgico (alimentazione normale = 1,8 kg e 0,4 kg di fieno grano).
3. Sterilizzare tutte le forniture chirurgiche in autoclave a vapore a 121 ° C e 15 psi per 30 min.
4. Posizionare le seguenti voci di un paraformaldeide essiccatore 48 ore prima dell'intervento chirurgico: 4 mm sonde flusso Doppler, 1 millimetro cristalli ultrasuoni, cateteri arteriosi, tubi di estensione, e 42 "Tygon Tubing.
   NOTA: Una tabella di attrezzature mediche, necessarie perchirurgia e per la sterilizzazione sono elencati nella Tabella 1. Pre-posizionamento della strumentazione nel tubo Tygon in questo passaggio aiuterà risparmiare tempo durante l'intervento chirurgico.
   1. Etichettare ogni estremità delle sonde, cateteri e cristalli come destra e sinistra, se applicabile.

2. Operazione Chirurgica

1. Indurre pecore per anestesia con diazepam (0,5 mg / kg) e ketamina (4 mg / kg) per via endovenosa (IV). In alternativa, utilizzare Telazol (4 mg / kg) IV.
   1. Eseguire intubazione oro-tracheale con diametro 8,5-10,0 mm interno ammanettato endotracheale tubo ^7.
   2. Somministrare anestesia inalatoria attraverso un circuito rirespirazione con un ventilatore marea di volume (7-10 ml / kg) o di un ventilatore regolata pressione (15-20 cm H ₂ O). Utilizzare un vaporizzatore di precisione per amministrare isoflurano o sevoflurano ad una quantità adeguata (3% -4% inizialmente) per raggiungere un mezzo di profonda fase anestetico chirurgico. La concentrazione alveolare minima perpecora è di 1,4% o 1,9%, rispettivamente, ^8.
   3. Valutare profondità dell'anestesia osservando risposta motoria agli stimoli, riflesso palpebrale, posizione degli occhi, e la frequenza cardiaca. Monitorare la saturazione di ossigeno nel sangue (95% -100%) con pulsossimetria, CO ₂ concentrazione (45-55 mmHg) in gas espiratorio utilizzando capnografia e mantenere la temperatura corporea durante la procedura (38,5-39,5 ° C) con un auto regolata riscaldamento coperta.
2. Shave lana tutto il collo della pecora, e più di un vena cefalica, con una lama # 40 su Clippers standard. Preparare la pelle di entrambi i siti per la chirurgia con il 70% di alcool isopropilico e il 7,5% betadine scrub garza saturi. Inizia con l'alcol garza per facilitare la rimozione di oli per la pelle. Si alternano tra betadine garza e alcol garza tre volte.
3. Posizionare pecore sul tavolo operatorio in decubito dorsale sulla cima di una coperta riscaldamento. Passare un tubo orogastrico di medie dimensioni per consentire l'espulsione passiva del contenuto dello stomaco. Estendere lacollo di pecora e utilizzare ammortizzazione di supporto secondo necessità per mantenere il posizionamento.
   1. Eseguire uno scrub asettica finale con il 7,5% betadine garza imbevuta e lasciar riposare per 5 minuti prima di un intervento chirurgico.
4. Somministrare fluidi IV (Ringer lattato o 0,9% Saline) a 10 ml / kg / ora attraverso un catetere venoso posizionato nella vena cefalica. Somministrare antibiotici intraoperatorie e analgesia: la penicillina G procaina 6.600 U / kg per via intramuscolare (IM), gentamicina 1,6 mg / kg IM, e buprenorfina 0,005-0,01 mg IV o IM.
5. Fare un cm un'incisione ~ 12 longitudinalmente sul collo linea mediana ventrale con cauterizzazione electro. Isolare sinistra e destra carotide arterie (~ 6 cm), rimuovendo il tessuto connettivo con una tecnica dissezione smussa. Legare e cauterizzare microvasi diramano dalle arterie carotidi per ridurre al minimo il sanguinamento.
6. Mantenere la sterilità utilizzando (un non-sterile) infermiera chirurgica per assistere con scavare tutto il cablaggio e tubazioni (sonda di mandata, fili di cristallo ad ultrasuonie il tubo del catetere) nello strato sottocutaneo della pelle. Utilizzare un trocar smussata, che esce attraverso l'incisione chirurgica preparata al collo dorsolaterale.
   1. Reach sotto il telo sterile e girare la testa della pecora modo che il lato del collo può essere visualizzata sotto il telo.
   2. Utilizzare un emostatico curvato da 8 cm a tunnel attraverso lo spazio sottocutaneo tra la linea mediana ventrale incisione del collo e il lato del collo. Aprire e chiudere il emostatico di sezionare senza mezzi termini uno spazio per i tubi ~ 1,5 centimetri di larghezza. Le punte della pinza emostatica dovrebbero risiedere a metà strada tra la testa e le spalle, circa 10 cm caudale verso destra o di sinistra. Girare il hemostat modo che le punte siano rivolte verso la pelle superficiale.
   3. Reach sotto il telo sterile e fare un 1,5 centimetri incisione attraverso la pelle, sulle punte del emostato con una sterile # 11 lama. Visualizza le punte della pinza emostatica per confermare una chiara uscita attraverso la pelle.
   4. Passare il tubo Tygon contenente unll cablaggio e il tubo attraverso il tunnel sottocutaneo. Tenere i cavi e tubi sopra il telo sterile.
   5. Reach sotto il telo per rimuovere il tubo esterno Tygon dal collo, esponendo il cablaggio impiantato quando lascia il collo della pecora. Estrarre singole linee fuori per minimizzare il gioco nello spazio sottocutaneo. Lasciare una distanza sufficiente per fissare correttamente la strumentazione per l'arteria.
7. Inserire 4 millimetri sonde flusso Doppler su entrambe le arterie carotidi e ottenere una lettura iniziale (Figura 1). Somministrare 100 U / kg di eparina IV 30 min prima bloccaggio dell'arteria.
8. Continuare somministrazione di eparina a 100 U / kg / ora fino alla fine dell'intervento. Bloccare la carotide utilizzando non schiacciamento morsetti vascolari e asportare una porzione (circa 4 cm di lunghezza). La portata carotideo controlaterale aumenterà del 50% -100% per mantenere il flusso di sangue al cervello.
   NOTA: È possibile limitare tratto longitudinale rinculo del vaso nativo rimuovendosegmenti più brevi rispetto sostituiti e / o stiramento dell'arteria nativa con vascolare morsetti per accorciare gap fino procedura anastomotica completo è completato. Questo aiuterà limitare la tensione sui singoli suture holding e l'innesto impiantato.
9. Suturare la TEV in luogo utilizzando semplici punti interrotti con 7-0 prolina ethalloy doppia armato monofilamento sutura. Se necessario, applicare miorilassanti lisce vascolari quali papaverina (15 mg / ml) o nicardipina (1,25 mg / ml) per via topica alla vascolarizzazione nativa per evitare vasocostrizione che ostacolerebbe sutura anastomotica.
   NOTA: Iniziare suture con circa 1 mm di distanza. Questo può variare notevolmente da caso a caso. La composizione e lo spessore TEV influenzerà la distanza effettiva tra suture. Poiché lo spessore del tessuto nativo o TEV diminuisce, può essere necessario collocare le suture più vicini.
   1. Prima di ancoraggio quattro punti del TEV alla arteria nativa mettendo due s oppostetitches su entrambe estremità prossimale e distale (Figura 2 -Di). Tenere ogni ancoraggio insegnato usando emostatiche.
      NOTA: descrizioni prossimale e distale si riferiscono alla direzione del flusso di sangue attraverso il foglio.
   2. Aggiungere 5-6 più suture sul lato superficiale sia l'estremità prossimale e distale per iniziare l'anastomosi. (Figura 2 -Pr). Contemporaneamente ruotare vascolare morsetti 180 gradi.
   3. Ristabilire tensione sulle suture di ancoraggio. Aggiungi supplementare (5-6) interrotto suture di estremità prossimale e distale sul lato ruotato del TEV.
10. Una volta che il TEV viene suturata saldamente in posizione, ruotarlo indietro alla posizione iniziale e rimuovere vascolare morsetti uno alla volta, morsetto distale. Lieve sanguinamento nei siti anastomosi è comune. Questo può naturalmente risolvere dopo alcuni minuti di rilascio morsetto e reclamping o richiedere il posizionamento di suture supplementari. Posizionare la sonda Doppler (Figura 3-FL) Sul nativa dell'arteria prossimale al flusso di sangue che entra nel TEV e portata monitor.
    NOTA: Aspettatevi le portate della carotide sinistra e destra per equilibrare dopo circa 15 min. Se la portata sulla carotide con impiantato TEV costante gocce, è possibile che il TEV è coagulazione. Altre anomalie possibili per quanto riguarda il flusso possono essere attribuiti alla costrizione della prossimale arterie nativo o distale al TEV. In questo caso, l'uso di ulteriori rilassante della muscolatura liscia vascolare può essere applicato, e il vaso nativo deve ritornare ad un tono basale dopo 30-60 min a seguito della chiusura del tessuto sul sito dell'innesto.
    1. Se lo si desidera, asportare la carotide controlaterale e suturare nuovamente in sede come controllo "Sham". Questo è più clinicamente rilevante che lasciare la carotide destra solo e soltanto di collegare la sonda flusso, cristalli ultrasonici, e il catetere. Se un controllo sham è voluto, fare questo prima di passare al punto 2.11.
11. Suturare 1 millimetro cristalli ultrasuoni (Figura 3 -cr1 CR2) a lati opposti del TEV con 7-0 Proline. Filo di sutura attraverso la testa cristallo ultrasuoni e cucite solo allo strato superficiale del TEV.
12. Cateterizzare l'arteria con una versione modificata 18 G catetere con una abbottonatura Teflon tessuto (Figura 3- Ca & Figure 4A). Posizionare il distale del catetere per il TEV in tessuto arterioso nativo.
    1. Suturare la abbottonatura alla parete arteriosa con 5/0 Ethibond per controllare qualsiasi emorragia. Utilizzare cicloesanone aderire il tubo microbore al catetere che è stata lavata con soluzione salina. Utilizzare il tubo come una linea di estensione.
    2. Utilizzare un G Luer stub adattatore 20 con una spina iniezione Surflo per sigillare l'estremità del tubo esteriorizzato (Figura 4B). Per mantenere la pervietà del catetere, ottenere il volume di adescamento della linea e lavare con 10 ml di soluzione salina e poi 5.000 U / ml di eparina sodica iniettabile ogni 2-3 giorni.
13. Registrare la distanza tra la sonda di flusso ei cristalli ultrasonici, così come la distanza tra la sonda di flusso e il catetere. Questa velocità dell'onda di polso permetterà di calcolare in combinazione con il software. Se non sono necessari calcoli, non impiantare un catetere.
14. Ottenere una lettura intraoperatoria se lo si desidera per garantire tutto l'hardware è impiantato funzionale (vedi sezione 3).
15. Fissare le linee impiantati e fili alla vicina muscolatura con 2/0 seta e un ago cono (Figura 3).
    1. Posizionare la sonda di flusso vascolare filo parallelamente alla nave, con la caudale sonda e il filo che si estende cranialmente, e poi fare una "U-Turn" verso la muscolatura laterale. Fissare il filo muscolatura adiacente, utilizzando 2-0 seta su un ago conico a due posizioni, in modo che la sonda filo o flusso non è in grado di provocare sollecitazioni sulla nave. Assicurarsi suture sono aderente ma non stringere troppo e strangulate musculature (Figura 3).
    2. Suturare la linea di fili di cristallo e arteriosa catetere alla muscolatura laterale, consentendo ~ 1,5 cm slack, simile a passaggi precedenti per il fissaggio della sonda di flusso (Figura 3).
    3. Gruppo tutti i cavi e le linee insieme e ancorare al muscolatura poco prima di uscire fuori attraverso tunnel sottocutaneo, simile a fasi precedenti.
16. Chiudere il sito chirurgico con un Vicryl sutura 2-0 in livelli utilizzando un modello di sutura in esecuzione su plancia e sottocutaneo, in esecuzione materasso punto sulla pelle (plancia, ago non tagliare, la pelle, il taglio ago). Chiudere l'1,5 centimetri un'incisione al collo dorsale attorno i fili esteriorizzato e le linee con 2/0 Vicryl e un ago di taglio.
17. Inserire fili sonda flusso, linee, cateteri e fili di cristallo ultrasuoni in un sacchetto (10 cm x 10 cm) che viene suturata saldamente alla pelle della pecora (Figura 5 - dopo il recupero).
18. Gradualmente svezzare anestesia pecore offe il volume del ventilatore di marea quindi estubare le pecore quando respiro spontaneo è ripreso. Rimuovere il catetere venoso inserito nella vena cefalica e benda, se necessario.
19. Fasciatura al collo con tripla pomata antibiotica sulle incisioni, un pad Telfa, tratto rotolo di garza, e elasticon.
20. Amministrare analgesia postoperatoria: meglumina flunixin 2,2 mg / kg IM una volta durante il recupero, poi 1,1 mg / kg IM una volta al giorno per due giorni, buprenorfina 0,005-0,01 mg IV o IM due volte al giorno per un giorno.

3. In Vivo Monitoring

1. Mettere le pecore nel carrello mobile per garantire una corretta moderazione. In questo modo le pecore a mantenere la calma e consapevole, senza compromettere l'hardware. Potrebbe essere necessario per ambientarsi pecore al carrello 2 o 3 volte per 30 minuti prima di ottenere registrazioni di strumentazione.
2. Rimuovere tutti i cavi e le linee dalla busta e la connessione a dispositivi di monitoraggio. Collegare la sonda del flusso di un misuratore di portata, cristalli 1 millimetro ultrasuoni collegato a TRBBox -USB, e cateteri linee a trasduttori di pressione. Un diagramma di flusso di questa configurazione è fornito (Figura 6).
3. Calibrare le sonde di flusso e trasduttori di pressione prima di acquisizione dati.
   NOTA: A causa della variabilità potenziale tra le versioni del software e le differenze nelle apparecchiature utilizzate, le tarature e le impostazioni varieranno da caso a caso.
4. Utilizzare un oscilloscopio per mettere a punto la misura di cristallo Sonometrics, secondo il protocollo del produttore.
5. Registrare i dati utilizzando il software del computer (Figura 7). Tracce nella metà superiore della figura 7 in colore bianco corrisponde al TEV impiantato, mentre tracce nella metà inferiore di colore rosso corrisponde al Sham / nativo. Sia per il TEV e Sham la portata (ml / min), la pressione sanguigna arteriosa (mmHg) e il diametro (mm) vengono registrate vivo.
6. Record per almeno 1 minuto, senza disturbi. Esportare questi dati per un'analisi più dettagliata. Dopo la registrazione, disconnect tutti i cavi e posto nuovamente dentro il sacchetto suturato sul collo della pecora.

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Risultati

Più di 30 pecore sono stati sottoposti alla tecnica chirurgica descritta nella presente relazione per l'impianto di TEV (in corso di stampa) ^9. Una tabella che riassume le più recenti operazioni di ovini dopo l'ottimizzazione del protocollo sono riportati nella tabella 2. Tutte le pecore recuperati dopo TEV l'impianto senza pericolo di vita complicazioni. In alcuni animali, la fibrosi è stata osservata in arteria nativa vicino alla punta del catetere arterioso. Non è stato oss...

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Discussione

Lo scopo di questo rapporto è quello di fornire una procedura affidabile e riproducibile di TEV impianto di interesse nella carotide ovine. Le arterie carotidi native degli animali utilizzati in questo modello sono stati 0,5-0,75 mm di spessore e 4,5-5 mm di diametro esterno. La tecnica chirurgica qui descritta ha avuto successo per l'impianto di TEV di varie geometrie di misura 0,25-1 mm di spessore, 4-5 mm di diametro esterno e 4 cm di lunghezza con grande successo dimostrando efficace fino a 3 mesi di durata, il...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pressure Transducer	Becton Dickinson	P23XL-1	Quantity: 1+ (1 for each artery). Used with water-filled diaphragm domes.
Amplifier and transducer box	Gould	5900 Signal Conditioner Cage	Quantity: 1. Two transducers and amplifiers should be included in cage. While this specific unit may be discontinued, other commercially available pressure transducers with a BNC/analog output will communicate with the Sonometrics equipment.
T403 Console with TS420 perivascular flowmeter module (x2)	Transonic Systems	T403 module and TS420 (x2)	Quantity: 1. Flow probes measuring flow through each of the carotid arteries will connect to each of the TS420 units.
Digital ultrasonic measurement unit	Sonometrics	TR-USB	Quantity: 1
Flow Probe Precision S-Series 4 mm	Transonic Systems Inc.	MC4PSS-LS-WC100-CM4B-GA	Quantity: 2
1 mm Sonometrics Crystals	Sonometrics Systems	1R-38S-20-NC-SH	Quantity: 2-4 (2 for each artery)
Catheter for implantation	BD (Becton Dickinson)	381447	Quantity: 1+ (1 for each artery). Catheter is cut and secured to microbore tubing, stylette is utilized for insertion.
Tygon Microbore Tubing	Norton Performance Plastics	(AAQ04127) Formulation S-54-HL	Cut to length for an extension set
Luer Stub Adapter	BD (Becton Dickinson)	427564 (20 gauge)	Quantity: 1+ (1 for each arterial catheter)
Surflo Injection Plug	Terumo	SR-IP2	Quantity: 1+ (1 for each arterial catheter)
Meadox	PTFE (Teflon) Felt	19306	Cut to size. The PTFE felt used in our studies was discontinued. However, comparable companies such as “Surgical Mesh” offer products which are equivalent.