Generazione di cellule staminali adiposo umano attraverso dedifferenziazione di adipociti maturi in Culture soffitto

Riepilogo

Mature adipocytes may represent an abundant source of stem cells through dedifferentiation, which leads to a homogenous population of fibroblast-like cells. Collagenase digestion is used to isolate mature adipocytes from human fat. The goal of our protocol is to obtain multipotent, dedifferentiated fat cells from human mature adipocytes.

Abstract

Mature adipocytes have been shown to reverse their phenotype into fibroblast-like cells in vitro through a technique called ceiling culture. Mature adipocytes can also be isolated from fresh adipose tissue for depot-specific characterization of their function and metabolic properties. Here, we describe a well-established protocol to isolate mature adipocytes from adipose tissues using collagenase digestion, and subsequent steps to perform ceiling cultures. Briefly, adipose tissues are incubated in a Krebs-Ringer-Henseleit buffer containing collagenase to disrupt tissue matrix. Floating mature adipocytes are collected on the top surface of the buffer. Mature cells are plated in a T25-flask completely filled with media and incubated upside down for a week. An alternative 6-well plate culture approach allows the characterization of adipocytes undergoing dedifferentiation. Adipocyte morphology drastically changes over time of culture. Immunofluorescence can be easily performed on slides cultivated in 6-well plates as demonstrated by FABP4 immunofluorescence staining. FABP4 protein is present in mature adipocytes but down-regulated through dedifferentiation of fat cells. Mature adipocyte dedifferentiation may represent a new avenue for cell therapy and tissue engineering.

Introduzione

In vitro dedifferentiation of mature adipocytes is achieved through a technique called ceiling culture¹. Because of their natural tendency to float in aqueous solutions, isolated mature adipocytes adhere to the surface of an inverted flask fully filled with culture medium. Over a few days, cells modify their spherical morphology and become fibroblast-like cells. The resulting cells, called dedifferentiated fat (DFAT) cells, are multipotent². Research articles on adipocyte dedifferentiation, especially on human cells, are limited. However, they have already provided interesting information regarding multipotency, cell phenotype and replicative capacity of DFAT cells². Mature adipocytes originating from various fat compartments have been successfully dedifferentiated including those originating from human visceral and subcutaneous adipose tissues^2-4. In addition to these depots, Kishimoto and collaborators sampled adipose tissue from the buccal fat pads and dedifferentiated adipocytes into DFAT cells⁵. Matsumoto and collaborators successfully generated subcutaneous DFAT cells from patients covering a wide range of ages, and the majority of cells had a high proliferative rate and less than 6% of senescence even after 10 passages in culture².

DFAT cells have been successfully re-differentiated into several lineages, including adipogenic, osteogenic, chondrogenic and neurogenic lineages^2,3,6. These cells express several embryonic stem cell markers such as Nanog and the four identified pluripotent factors Oct4, c-myc, Klf4 and Sox2³. They also express markers specific to each of the three germ layers⁷. In addition, DFAT cells are similar to Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells (BM-derived MSC) based on their epigenetic signature³. Exploiting the stem cell capacity of DFAT cells, many groups have investigated their potential to treat or improve various diseases^8,9. Improvements of pathologic conditions, such as infracted cardiac tissue, spinal cord injury and urethral sphincter dysfunction, have been observed with DFAT cell injections in rat models of disease^10-12.

In addition to the stem cell properties of DFAT cells, they may represent a new cellular model for adipocyte physiology studies. The 3T3-L1 cell line is often used for this purpose as these cells differentiate into adherent, lipid-storing adipocytes under adipogenic stimulation¹³. However, these cells originate from mouse embryo tissue¹³. Also, depot-specificity cannot be investigated with this model and it may not fully reflect human adipocyte physiology¹⁴. Other laboratories work with isolated adipose cells from murine fat depots, but fat distribution is not dimorphic in mice and anatomical configuration of the rodent's abdominal cavity prevents from extrapolating directly to humans¹⁵. In order to study adipocytes in the context of the physiopathology of human obesity, consideration of body fat distribution and fat depot-specific differences has become essential¹⁶. Some limitations of primary preadipocyte cultures, including cell quantities obtained from adipose tissue biopsy samples and their senescence after a few passages in culture, created the need for alternate models. Perrini and collaborators investigated depot-specificity in gene expression of DFAT cells originating from visceral and subcutaneous fat and compared them to adipose-derived stem cells (ASC) from the same fat depot. They demonstrated that differences in gene expression and function where mainly found between depots than between cell types, suggesting that DFAT cells are physiologically close to ASC from the same depot. DFAT cells may represent an interesting alternative to available models for studies on fat distribution in the pathophysiology of human obesity. Moreover, ceiling culture is a promising method to obtain adult stem cells for tissue engineering purposes.

Here, we describe collagenase digestion, a widely-used technique to isolate mature adipocytes from the subcutaneous and/or visceral fat samples¹⁷, and the subsequent steps to perform ceiling culture and dedifferentiate these cells into multipotent, fibroblast-like cells.

Protocollo

Dichiarazione etica: Il progetto è stato approvato dal Comitato Etico della Research IUCPQ prima del reclutamento dei pazienti. Ai fini del presente articolo / video, abbiamo ottenuto i tessuti da 2 pazienti: 1) A 62 anni, paziente di sesso maschile con un BMI di 50,7 kg / m ² e 2) 35 anni paziente di sesso femminile con un BMI di 57 kg / m ^2. Esperimenti può essere fatto con due scomparti grasso, ma sono limitati a un compartimento grasso ai fini di questo video. Aspetti tecnici del video sono state effettuate con il paziente e 1 FABP4 immunofluorescenza è stata eseguita con le cellule dedifferenziate da paziente 2.

Elaborazione 1. Campione

1. Chiedi chirurghi a raccogliere il tessuto adiposo dal comparto grasso omentale e sottocutaneo, al momento della chirurgia bariatrica laparoscopica.
2. Portare rapidamente campioni adipose al laboratorio a temperatura ambiente ed elaborare immediatamente.
3. Eseguire la digestione in laboratorio, in un ambiente non sterile. Ilcellule saranno eventualmente trasferiti nel locale cultura e coltivati ​​in condizioni sterili. Per evitare la contaminazione, preparare tampone KRH con acqua distillata e filtrata e seguire da una filtrazione (filtro 0.22μM) prima della digestione. Tubi accuratamente puliti con etanolo prima cessione nel cofano coltura cellulare per pallone e preparazione piastra.
4. Collocare il tessuto adiposo su un piatto pre-pesate e il peso record. Fissare una piccola parte di ogni campione di tessuto (meno di 1 cm ²⁾ in 10% formalina tampone a temperatura ambiente per almeno 24 ore prima della paraffina. Utilizzare questo esempio incorporato per esperimenti di immunoistochimica (tecnica non mostrato).
5. Inserire un altro pezzo in una provetta da 50 ml e flash-congelamento in azoto liquido prima della conservazione a -80 ° C per ulteriori studi sui tessuti adiposi interi (ad esempio, l'espressione genica - tecnica non mostrati).

2. Collagenase Digestione

1. Posizionare il restante pezzo di tessuto adiposo in un ml tu 50essere per la digestione.
2. Aggiungere 4 ml di KRH-WB integrati con collagenasi (350 U / ml) per grammo di campione nel tubo di digestione.
3. Tritate tessuto adiposo con le forbici.
4. Inserire sospensione tessuto adiposo macinate in un agitatore, 37 ° C, 90 rpm massima, per una incubazione di 45 minuti (massimo 1 ora).

3. Purificazione di adipociti e preadipociti

1. Versare la soluzione traslucido con pochi pezzi di grasso attraverso un nylon 400 micron maglia in un bicchiere di plastica.
2. Con pinzette, strofinare la preparazione cellulare sulla rete di nylon e lavare con 5 ml di KRH-WB.
3. Delicatamente trasferire la sospensione cellulare filtrato in un tubo da 50 ml con il tubo di plastica in esso e una siringa 60cc attaccata all'estremità tubo.
4. Sia la sospensione con adipociti maturi riposare per circa 10 min, permettendo alle cellule di raggiungere la parte superiore del buffer galleggiamento.
5. Lentamente aspirare il tampone nella parte inferiore del tubo utilizzando 60cc Syrinaspirazione ge.
6. Aggiungere 20 ml di KRH-WB per lavare. Ripetere la procedura dal punto 3.4 per 2 lavaggi aggiuntivi.
7. Raccogliere il buffer di portare la sospensione adipociti ad un volume finale di 5 o 10 ml, a seconda della quantità di cellule. Perseguire con passaggi nella sezione 5.
8. Recupero della frazione stromale-vascolare dal buffer raccolti con la siringa 60cc mediante centrifugazione (3000 rpm, RT, 5 min) per ulteriore coltura cellulare primaria se desiderato (tecnica non mostrato).

Cell Count 4. adipociti maturi

1. Carico 10 ml di sospensione degli adipociti scosso delicatamente in una camera di conteggio (emocitometro). Eseguire conta delle cellule in quadruplicato.
2. Calcolare il numero di cellule mature isolate.

5. Coppia degli adipociti dedifferenziazione in T-25 Flask

1. Riempire a 25 cm ² tessuto pallone di coltura a ¾ del volume con il siero di vitello DMEM / F12-20%.
2. Secondo il conteggio delle cellule, versare 500.000 cellule mature nel pallone.
3. Riempire il pallone completamente utilizzando un tubo da 50 ml con il mezzo ed eliminare come bolle che possibile.
4. Avvitare il tappo non ventilate sul pallone.
5. Pulire il pallone con etanolo prima dell'incubazione per evitare la contaminazione.
6. Incubare la beuta capovolto per una settimana senza toccarlo per evitare movimenti nella cultura che potrebbero disturbare l'adesione cellulare.
7. Prima invertendo il matraccio a 7 giorni di coltura invertito, manipolare delicatamente il matraccio e rimuovere tutta medie nel pallone per aspirazione, evitando movimenti bruschi.
8. Aggiungere 12 ml di siero di vitello% DMEM-F12-20 e coltivare cellule con tecniche standard. Un filtrato, tappo ventilato può essere aggiunto al pallone.

6. maturo degli adipociti dedifferenziazione in un 6-pozzetti

1. Inserire un coprioggetto sul fondo di ciascun pozzetto di una piastra da 6 pozzetti
2. Aggiungi un ½ "boccola di plastica sulla parte superiore di ogni coprioggetto.
3. Riempire pozzetti con 8 ml di 20% di siero di vitello-DMEM.
4. Metti un coprioggetto su ogni boccola in plastica.
5. Inserire puntale tra la slitta e il tubo di iniettare le cellule sotto il vetrino (50.000 cellule per pozzetto).
6. Incubare le piastre in un incubatore standard di coltura cellulare a 37 ° C con 5% di CO ₂ per una settimana.
7. Coprioggetto Reverse con le cellule attaccate in ogni pozzetto contenente 2 ml di media integrato con siero di vitello del 20% e perseguire la cultura.
8. Utilizzare coprioggetto con cellule in fase di de-differenziazione per diversi scopi, tra cui immunofluorescenza (tecnica non mostrato).

Risultati

Importanti cambiamenti morfologici avvengono a maturare adipociti durante dedifferentiation (Figura 1). Come mostrato in Figura 2, le cellule in fase dedifferentiation state colorate con un anticorpo anti-FABP4 per analisi di fluorescenza. Le cellule con una morfologia rotonda espresso la proteina FABP4 mentre la maggior parte delle cellule di fibroblasti, come non ha fatto. Dopo dedifferentiation, cellule DFAT possono essere coltivati ​​con procedure standard per diversi passaggi. ...

Discussione

Dedifferenziazione di adipociti maturi con la tecnica di coltura soffitto è un nuovo approccio per ottenere cellule staminali adipose da un piccolo campione di tessuto adiposo nativo. Sulla base della nostra esperienza e quella di altri ^2, un grammo di tessuto è sufficiente al piatto un pallone da 25 cm ² e per ottenere una popolazione di cellule DFAT per i quali l'omogeneità è stata dimostrata da Poloni e collaboratori ^3. Adipociti dedifferentiation sembra possibile con le cellu...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine serum albumine	Sigma	A7906
Adenosine	Sigma	A4036
Ascorbic acid	Sigma	A0278
NaCl			Any brand can be used
KCl			Any brand can be used
CaCl2			Any brand can be used
MgCl2			Any brand can be used
KH2PO4			Any brand can be used
HEPES			Any brand can be used
Glucose			Any brand can be used
Type I collagenase	Worthington Biochemical Corp	LS-004196
DMEM/F-12, HEPES, no phenol red	Gibco-Life Technologies	11039-021	Add to medium : 20% calf serum, gentamicin (50 µg/ml) and fungizone (2.5 µg/ml)
Calf Serum, iron supplemented, from formula-fed calves	Sigma	C8056-500 ml
1/2 In plastic bushing	Iberville	2704-CP	SKU:1000120918 (Home Depot)
Liquid nitrogen	Linde
Formalin soluton, neutral buffered, 10%	SIGMA	HT501128
Sterile tweezers
Sterile scissors
60 cc syringes	BD Syringe
Plastic tubing
Krebs-Ringer-Henseleit stock buffer (KRH)			Prepare stock buffer as following: 25 mM HEPES pH 7.6, 125 mM NaCl, 3.73 mM KCl, 5 mM CaCl2.2H2O, 2.5 mM MgCl2.6H2O, 1 mM K2HPO4. Adjust pH to 7.4.
Krebs-Ringer-Henseleit-Working Buffer (KRH-WB)			Add the following components freshly to KRH buffer: 4% bovine serum albumin, 5 mM glucose, 0.1 µM adenosine, 560 µM ascorbic acid
KRH-WB supplemented with Type I collagenase			Add 350 U/ml of Type I collagenase
T25 unvented cap tissue culture flask	Sarsted or other brand
6-well tissue culture plate	BD Falcon or other brand
Microscope cover glass 22x22	Fisherbrand	12-542-B
Sterile beakers