Un chip microfluidico per ICPMS introduzione del campione

Riepilogo

Vi presentiamo un sistema di introduzione del campione goccia discreto per accoppiamento induttivo spettrometria di massa di plasma (ICPMS). Si basa su un chip microfluidico economico e getta che genera goccioline altamente monodisperse in una gamma di dimensioni di 40-60 micron a frequenze da 90 a 7.000 Hz.

Abstract

Questo protocollo discute la fabbricazione e l'utilizzo di un basso costo chip microfluidico monouso come sistema di introduzione del campione per accoppiamento induttivo spettrometria di massa di plasma (ICPMS). Il chip produce monodisperse goccioline campione acquoso a perfluoroesano (PFH). Dimensioni e frequenza delle goccioline acquose possono essere variate nel range tra 40 e 60 micron e da 90 a 7.000 Hz, rispettivamente. Le goccioline vengono espulsi dal chip con un secondo flusso di PFH e rimangono intatti durante l'espulsione. Un sistema di desolvatazione fuoriserie rimuove il PFH e trasporta le goccioline nelle ICPMS. Qui, segnali molto stabili con una stretta distribuzione di intensità possono essere misurate, mostra la monodispersity delle goccioline. Abbiamo dimostrato che il sistema d'introduzione può essere utilizzata per determinare quantitativamente ferro nei bovini singole cellule rosse del sangue. In futuro, le capacità del dispositivo di introduzione può essere facilmente esteso con l'integrazione di ulteriori moduli microfluidica.

Introduzione

Analisi elementare di campioni liquidi da accoppiamento induttivo spettrometria di massa a plasma (ICPMS) è comunemente eseguita utilizzando nebulizzatori in combinazione con camere di nebulizzazione come sistema di introduzione ^1. In questo sistema di introduzione del campione il campione viene spruzzato da un nebulizzatore per generare un aerosol polidispersa. Una camera di nebulizzazione a valle viene usato per filtrare grandi goccioline. Questo metodo è associato con un elevato consumo campione (> 0,3 ml min ^{-1) 2} e un trasporto del campione incompleta. Così, diventa impraticabile per le applicazioni in cui sono disponibili i volumi del campione soltanto microlitro, come in studi biologici, forensi, tossicologici e clinici ^3. Per ridurre il consumo di esempio, con dimensioni di ugelli nebulizzatori piccoli stati sviluppati ^3. Tuttavia, la dimensione ridotta ugello aumenta il rischio di intasamento quando campioni di fluidi biologici non digerito o soluzioni saline concentrate devono essere analizzati ^3.

Un approccio diverso per l'introduzione del campione è stato proposto da Olesik et al. ^4. Gli autori iniettato un liquido in ICPMS sotto forma di microgocce discrete monodisperse, prodotte da una micropompa azionato piezo-elettrico. Anche se questo sistema non ha trovato larga applicazione, ha avviato lo sviluppo del concetto di discreta introduzione goccia in ICPMS. Oggi, azionato elettricamente piezo-sistemi, che possono generare goccioline di dimensione di 30, 50, 70 e 100 micron e con frequenze 100-2,000 Hz erogazione, può essere acquistato. Le goccioline possono essere trasportati in ICPMS con quasi il 100% di efficienza ^5. Questi distributori microdroplet sono stati applicati per misurare quantitativamente singole nanoparticelle ^5,6 e caratterizzare cellule biologiche singole ^7. Un sistema simile basato sulla tecnologia a getto di inchiostro termico ⁸ è stato testato per l'analisi di campioni biologici ^9. Anche se l'Available singoli sistemi di introduzione gocciolina sono molto efficienti, può essere utilizzato per piccoli volumi di campione e sono promettenti per l'analisi delle nanoparticelle e cellule, hanno diverse limitazioni. Per un ugello fisso, la dimensione delle gocce può essere variata leggermente (a meno impostazioni personalizzate vengono utilizzate ^10). Variazioni delle proprietà fisiche del liquido (pH, contenuto di sale) possono alterare le caratteristiche delle gocce (dimensioni, velocità di iniezione). Inoltre, questi dispositivi sono piuttosto costosi, inclini a intasamento e sono difficili da pulire.

Un altro metodo per generare goccioline è noto nel campo della gocciolina microfluidica ^11. Negli ultimi anni goccia microfluidica ha guadagnato interesse (bio) reazioni chimiche ^12-15 e per gli studi di cella singola ^16,17. Inoltre, questa tecnica è stata applicata per l'introduzione di campioni in ionizzazione electrospray massa spettrometria ^18,19 e per la preparazione dei campioni in matrix-assisted laser desorbimento / ionization spettrometria di massa ^20,21.

Recentemente, abbiamo introdotto un sistema basato microfluidica per l'introduzione del campione in ICPMS ^22. La componente chiave del nostro sistema introduzione è il liquido assistita goccia espulsione (LADE) chip. Questo chip consiste completamente di poli (dimetilsilossano) (PDMS). Nel primo incrocio canale di flusso messa a fuoco viene utilizzato per generare goccioline monodisperse di una soluzione campione acquoso (Figura 1). A tale scopo il altamente volatile (punto di ebollizione 58-60 ° C ²³⁾ e portante immiscibile fase perfluoroesano (PFH) viene utilizzato (Figura 1). Queste proprietà PFH consentono una generazione goccia stabile e la rimozione veloce della fase portante. Le modifiche delle proprietà del influenza liquido campione questo metodo di generazione meno, rispetto ad altri generatori di gocce. La dimensione delle gocce è regolabile in un ampio intervallo variando le portate della fase acquosa e la PFH. In un secondar downstreamy giunzione, più PFH viene aggiunto per aumentare la velocità di flusso ad almeno 1 m sec ^-1. A questa velocità del liquido può essere espulso dal chip in jet stabile e diritta (Figura 1) senza distruzione gocciolina (Figura 1 riquadro). Questo design a doppia giunzione permette il controllo della stabilità del getto indipendente generazione goccia. Le goccioline vengono trasportati alle ICPMS con un sistema di trasporto personalizzato. Tale sistema comprende un tubo caduta e un desolvator membrana per rimuovere il PFH. I residui secchi delle goccioline acquose vengono successivamente ionizzati nel plasma del ICPMS e un rilevatore misura la massa degli ioni. La parte frontale della piastrina è quello di garantire un collegamento stretto con il sistema di trasporto goccia a botte. L'espulsione del campione acquoso come goccioline PFH è vantaggioso, perché il contatto con l'ugello è evitata. Questo riduce notevolmente il rischio di intasamento dell'ugello, che può essere un problema quando si lavora con sospensioni cellulari o cosoluzioni saline ncentrated. I chip LADE, fabbricati da PDMS litografia soft, sono a buon mercato (costo del materiale di circa $ 2 per chip), monouso e facile da modificare. In combinazione con la fabbricazione che richiede solo una piccola quantità di lavoro manuale ciascun esperimento può essere eseguita con un nuovo chip. Pertanto, una pulizia laboriosa non è necessario e la contaminazione crociata è minimizzato.

Qui, la fabbricazione del chip LADE da litografia morbida e la sua applicazione per ICPMS sono descritti. Esempi di misure con una soluzione acquosa ed una sospensione cellulare vengono presentati.

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Protocollo

1. SU-8 master Fabrication (Figura 2)

NOTA: Eseguire la fabbricazione dei SU-8 maestri stampi in una camera pulita per prevenire i difetti causati da particelle di polvere. Due cialde sono necessari per la fabbricazione, una schiacciata con le caratteristiche microfluidica e uno senza.

1. Preparare gli stampi padrone per il chip microfluidica. Prima applicare uno strato di adesione al wafer di silicio.
   1. Disidratare un wafer di silicio per 10 minuti a 200 ° C. Raffreddare il wafer fino a RT e caricarlo su di un giro verniciatura e di spin cappotto con SU-8 2002 con il seguente protocollo.
   2. Dispensare circa 3 ml resistono sul wafer.
   3. Spin il wafer a 500 rpm per 10 sec per diffondere il resist su tutta wafer.
   4. Spin il wafer a 2.000 rpm per 30 sec per raggiungere un'altezza resistere di circa 2 micron.
2. Rimuovere l'eccesso resistere dal bordo del wafer con un tampone imbevuto di acetone, per evitareattaccare del wafer alla piastra calda nel passaggio successivo. Cuocere il wafer per 60 sec a 95 ° C su una piastra calda.
3. Esporre l'intero wafer con luce ultravioletta (80 mJ / cm ² a 365 nm). Post-cuocere il wafer per 120 secondi a 95 ° C.
4. Raffreddare il wafer giù e girare immediatamente cappotto wafer nuovamente utilizzando il seguente protocollo per SU-8 2050:
   1. Spin il wafer a 100 rpm per 20 sec (dispensare circa 3 ml SU-8 resistere durante questa fase).
   2. Spin il wafer a 500 rpm per 10 sec per diffondere il resist su tutta wafer.
   3. Spin il wafer a 3.250 rpm per 30 sec conseguente spessore resistere di circa 40 micron.
5. Ancora una volta, rimuovere l'eccesso resistono dal bordo del wafer con un tampone imbevuto di acetone e cuocere morbido wafer su una piastra calda per 180 sec a 65 ° C e 360 ​​sec a 95 ° C.
6. Preparare la fotomaschera da sticking ad un vetro soda-calce. Vedi Figura 3 per la progettazione maschera. Utilizzare una maschera allineatore per esporre il resist con luce ultravioletta (160 mJ / cm ^2, misurata a 365 nm) attraverso la maschera preparata. Cuocere il wafer esposto nuovamente su una piastra calda per 60 sec a 65 ° C e 360 ​​sec a 95 ° C.
7. Dopo il raffreddamento il wafer a RT, immergerlo in una piastra di Petri di vetro riempito di sviluppatore per 5 minuti per sviluppare il resist. Agitare delicatamente la capsula di Petri per rimuovere impressionate SU-8. Sciacquare il wafer con isopropanolo e asciugarlo con una pistola di azoto.
8. Controllare il wafer al microscopio. Nel caso in cui non sviluppata resistere resti sulle caratteristiche, sviluppare nuovamente il wafer per pochi minuti, come descritto al punto 1.7.
9. Rimuovere qualsiasi solvente residuo da cottura wafer per 2 ore a 200 ° C. Controllare l'altezza delle caratteristiche con un profiler passo. Nel caso l'altezza misurata differisce dal altezza desiderata cominciare questo protoil col nuovo e adattare la velocità di centrifuga al punto 1.1.4.
10. Per evitare che si attacchi dei PDMS al wafer silanizzata ponendolo nell'essiccatore insieme con 50 ml di 1 H, 1 H, H 2, H 2 -perfluorodecyltrichlorosilane in una piccola capsula di porcellana. Ridurre la pressione nell'essiccatore a 100 mbar e incubare il wafer per 12 ore.
    1. Per le parti vuote PDMS silanizzata altro wafer di silicio con il metodo del punto 1.10. Per risparmiare tempo silanizzata entrambi wafer contemporaneamente in un unico essiccatore.

2. LADE Chip Fabrication

NOTA: Il chip LADE è fatto di due pezzi PDMS che sono legati insieme da incollaggio ^24. La prima parte contiene le caratteristiche microfluidica. L'altra parte è piatta e usato per sigillare i canali. Bonded insieme, formano la forma rotonda necessario interfacciare il chip con il sistema di trasporto gocciolina. Qui, la fabbricazione dile due parti e il loro legame è descritto. Tutte le fasi del processo sono mostrati in Figura 4.

1. Preparare 44 g di PDMS miscelando 40 g di prepolimero con 4 g di PDMS agente di indurimento (questo si tradurrà in un massimo di 6 chip). Degassarla PDMS in un essiccatore fino a quando non è bolla liberamente (questo richiederà circa 20 minuti).
2. Replica stampaggio delle metà strutturati.
   1. Inserire il modulo colata sopra il wafer e farlo scattare in posizione utilizzando le strutture di guida intorno al disegno (vedi Figura 5). Salta l'aggancio in posizione per il PDMS dimezzare piatta.
   2. Versare circa 3 a 4 g di PDMS degassificata sotto forma di colata e posizionarlo per 6 minuti su una piastra calda a 150 ° C. Raffreddare i PDMS curati nella forma di fusione e sollevare con cautela il wafer forma di colata con una spatola.
   3. Per evitare qualsiasi contaminazione dei canali microfluidici coprire il lato del chip che era precedentemente in contatto with il wafer con nastro adesivo. Tagliare con cautela il nastro lungo il bordo della parte PDMS per rimuovere PDMS eccesso.
3. Per realizzare i piatti PDMS metà ripetere i passaggi di cui sopra da 2.2.1 a 2.2.3 con la cialda silanizzata vuoto.
4. Peel del nastro e perforare collegamento fluido nella metà strutturati con un perforatore biopsia. Proteggere le strutture con nastro adesivo durante la conservazione.
5. Incollare i pezzi PDMS insieme da incollaggio utilizzando i PDMS agente ²⁴ di polimerizzazione.
   1. Prendete un wafer di silicio non trattato e spin cappotto con PDMS agente indurente per 30 sec a 6.000 giri. Prendere la cialda fuori il verniciatore di spin.
   2. Rimuovere il nastro dalle metà strutturati e metterli con le strutture rivolti verso il basso sul wafer. Spingere delicatamente sopra le PDMS per rimuovere le bolle d'aria.
   3. Rimuovere il nastro dalle PDMS vuote metà. Dai dimezzare strutturato dal wafer e allineare manualmente sulla parte superiore del PDMS dimezzare piatta. Premere delicatamente ilsepararsi insieme per eliminare le bolle d'aria e lasciare la cura di chip montato per 24 ore a temperatura ambiente. Non spingere le due parti con la forza come questo può causare i canali al collasso.
6. Tagliare la punta del chip lungo la linea dell'indicatore ortogonale al canale ugello con un taglierino per aprire l'ugello di uscita. Utilizzare un dispositivo di allineamento per garantire un taglio dritto, che è necessario per una espulsione di liquido diritta. Ispezionare il chip sotto un microscopio per difetti dei canali microfluidica e particelle di polvere. Mettere un nastro sulle prese per proteggere i trucioli durante la conservazione.
7. Collegare una bottiglia Woulff con tubo ad una fonte di azoto secco e per tutti gli ingressi del chip LADE. Cassetta 50 ml di 1 H, 1 H, H 2, H 2 -perfluorodecyltrichlorosilane sul fondo della bottiglia Woulff e chiuderla.
8. Silanizzare i canali microfluidica svuotando tutti i canali per 20 minuti con il flusso di azoto che trasportano 1 H, 1 H , 2 H, 2 H -perfluorodecyltrichlorosilane ad una portata di circa 1 ml / sec. I chip sono pronti per esperimenti e possono essere conservati per almeno alcune settimane a temperatura ambiente.

3. Preparazione del sistema di misurazione / Droplet Trasporti

NOTA: costruire l'intero sistema di trasporto gocciolina sopra un tavolo ottica, dato che è necessario costruire una struttura di supporto stabile per l'installazione. Uno schema dell'intero sistema di trasporto gocciolina è illustrato in Figura 6.

1. Installare un poli ciclonico personalizzato (metilmetacrilato) (PMMA) adattatore con un 50 centimetri allegate tubo in acciaio inossidabile verticalmente. Collegare l'adattatore a una fonte di elio con un controllore di flusso di massa. Collegare un (ad alta velocità), macchina fotografica e una lampada all'adattatore sui siti opposte per la visualizzazione delle gocce.
2. Inserire un riscaldatore a cartuccia nel mezzo del tubo di acciaio e utilizzando poli (cloruro di vinile) (PVC) tubo e un tubo Legrisconnettore per collegare l'estremità del tubo di acciaio con l'ingresso del desolvator membrana.
3. Collegare l'uscita del desolvator con un altro tubo in PVC a un adattatore di flusso laminare, che è direttamente collegata all'ingresso ICPMS. Collegare l'adattatore flusso laminare ad una sorgente argon con un controllore di flusso di massa e successivamente utilizzarlo per admix Argon per raggiungere una condizione stabile funzionamento.
4. Allineare l'adattatore e il tubo verticale in acciaio con una livella. Se l'allineamento non è preciso, si può portare a notevoli perdite di goccioline. Inserire una spina nel adattatore per evitare che i gas fuoriuscita durante il sistema di tempo di riscaldamento.
5. Inizia flussi di gas tutto sopra citate e dispositivi che utilizzano le impostazioni da tabella 1. Lasciare che il sistema per riscaldare per 15 min. Il riscaldatore cartuccia deve 2 ore per stabilizzare la temperatura, accenderlo in anticipo.
6. Posizionare le pompe siringa su un rack all'altezza di adattatore dell'elio ciclonica. Mantenere la distanza tra lapompe a siringa e l'adattatore più breve possibile.

4. Misure

NOTA: Il seguente protocollo è scritta in termini generali a causa della varietà di soluzioni e sospensioni che può essere utilizzato. Tuttavia, sospensioni cellulari devono essere diluite a una concentrazione di <1 x 10 ⁷ cellule / ml, quando viene eseguita l'analisi singola cellula, per assicurare che la maggior parte delle goccioline trasportare una sola cella. Per misure con celle posizionare le pompe a siringa con un angolo in modo che l'uscita delle siringhe punto verso il basso e installare il tubo in modo che puntano verso il basso.

1. Collegare il tubo per le siringhe. Carico due 5 ml siringhe con perfluoroesano e una siringa da 1 ml con una soluzione campione o sospensione. Rimuovere tutte le bolle intrappolate nelle siringhe e tubi.
2. Installare le siringhe in una pompa a siringa e collegarli agli ingressi del chip. Avviare le pompe siringa utilizzando le impostazioni iniziali diTabella 1 (o portate maggiori). Dare i flussi da 3 a 5 minuti per stabilizzare.
   1. Rimuovere il liquido in eccesso dalla punta del chip con un tessuto. I liquidi dovrebbero ora espellere dal chip in un getto rettilineo. Se una espulsione retta non può essere realizzato strofinando con un tessuto sostituire il chip e ricominciare con questo passo.
3. Togliere la spina dalla scheda e inserire con attenzione il chip nella scheda. Lubrificare il chip con FC-40, se necessario. Un chip può essere utilizzato per almeno 2 ore di esperimenti.
4. Cambiare la portata ad essere entro le impostazioni di misura consigliate dalla Tabella 1. Portata inferiore del PFH non solo salva PFH ma riduce anche il segnale di fondo, causato da interferenze isobariche.
5. Dare sistema 2-5 min per stabilizzare (a seconda delle portate scelte). Ottimizzare le ICPMS per l'intensità del segnale più alto degli analiti di interesse.
   1. Successivamente regolare i flussi di tutti gli gAses sui regolatori di flusso di massa (vedi i valori consigliati in tabella 1), fino l'intensità massima del segnale degli analiti di interesse si ottiene. Tune il potere plasma e le tensioni lente di focalizzazione (secondo intervalli raccomandate dal produttore) sulle ICPMS nello stesso modo.
6. Impostare le ICPMS ad un tempo di permanenza di 10 msec (richiesto le ICPMS molto utilizzati, ma può essere regolata con altri strumenti per garantire un'acquisizione risolta nel tempo). Avviare la registrazione del segnale di un particolare m / z usando il protocollo del produttore.
7. Dopo la misurazione, trasferire i dati grezzi al programma di analisi dei dati per la valutazione. Bin i dati, riportati nella conta per 10 msec, con un built-in funzione, e la trama risulta valori centrali bin contro conteggi. Montare ogni picco nell'istogramma distribuzione di frequenza tracciata con una funzione di Gauss. La media e sigma del fit rappresentano l'intensità del segnale medio e la sua deviazione standard, rispettivamente.

5. Calibrazione Concetto

1. Misurare una soluzione unica o standard di multi-elemento che contiene l'elemento o gli elementi di interesse alle stesse portate come il campione.
2. Inserire un chip LADE in una capsula di Petri su un microscopio. Per una migliore qualità dell'immagine utilizzare un chip non-round. Realizzare questo chip come descritto al punto 2, ma con una forma semplice fusione rettangolare al posto di quello a forma parzialmente round.
3. Seguire i passaggi da 4.1 a 4.2.1 per avviare la generazione goccia. Impostare le portate per le portate utilizzate nella fase 5.1.
4. Registrare le immagini di goccioline acquose con una fotocamera ad alta velocità collegato ad un microscopio (obiettivo 20X). Utilizzare un software di analisi di immagine come la morfometria goccia e software velocimetria da Basu ²⁵ per ottenere il diametro medio goccia dalle registrazioni.
5. Utilizzare diametro medio delle gocce per calcolare il volume di goccia, assumendo la goccia è un oggetto sferico.
   1. Da questo volume e la knpropria concentrazione di un analita nel gocciolina calcolare il numero di atomi corrispondenti. Dividere il numero di ioni misurati per gocciolina per il numero di atomi di ottenere l'efficienza di rivelazione. Utilizzare questa efficienza di rivelazione per calcolare il numero di atomi in un campione sconosciuto.
      NOTA: Poiché le variazioni tra singoli chip sono piccole ^22, non è necessario ripetere la misura della dimensione delle gocce per ogni circuito integrato o soluzione se le portate rimangono le stesse. Un elenco delle dimensioni delle gocce e le frequenze in base alle portate specifiche è pubblicato da Verboket et al. ^22.

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Risultati

Il sistema presentato può essere impiegato per misurare piccoli volumi di soluzioni o sospensioni contenenti cellule o nanoparticelle. Esempi di una misurazione di una soluzione standard e caratterizzazione di singole cellule sono mostrati qui. Altri esempi si possono trovare in Verboket et al. ^22.

Tipicamente il segnale di una singola goccia di una soluzione è molto breve evento. Di solito dura per pochi 100 msec ^26. Con i ICPMS utilizzati qui (tempo di sost...

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Discussione

Sebbene la fabbricazione dei circuiti integrati è molto affidabile ci sono alcuni punti critici durante la fabbricazione che richiedono una particolare attenzione. Innanzitutto, pulizia durante l'assemblaggio è molto importante per evitare la contaminazione del chip dalla polvere. La polvere può bloccare i canali ed evitare una generazione goccia stabile. In secondo luogo, è particolarmente importante che la punta è tagliato ortogonalmente al canale ugello. L'angolo del taglio influenza fortemente l'ang...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Silicon wafer 100 mm	Si-Mat (Kaufering, Germany)
SU-8 2002	Microchem Corp. (Massachusetts, U.S.A.)
SU-8 2050	Microchem Corp. (Massachusetts, U.S.A.)
Acetone	Merk VWR (Darmstadt, Germany)	100014
MR-developer 600	Microresist Technology GmbH (Berlin, Germany)
Isopropanol	Merk VWR (Darmstadt, Germany)	109634
1H,1H,2H,2H-perfluorodecyltrichlorosilane	ABCR-Chemicals (Karlsruhe, Germany)	AB111155
Sylgard 184 silicone elastomer kit (PDMS)	Dow Corning (Michigan, U.S.A.)	39100000
Perfluorohexane 99%	Sigma-Aldrich (Missouri, U.S.A.)	281042
FC-40	ABCR-Chemicals (Karlsruhe, Germany)	AB103511
Phosphate-buffered saline	Life Technologies (Paisley, U.K.)	10010-015
Red blood cells in phosphate-buffered saline	Rockland Immunochemicals Inc. (Pennsylvania, U.S.A.)	R400-0100
Single-element standard solutions Na, Fe	Inorganic Ventures (Virginia, U.S.A.)
Multielement standard solution	Merck Millipore (Massachusetts, U.S.A.)	IV
Nitric acid	Sub-boiled
Ultrahigh-purity water	Merck Millipore (Massachusetts, U.S.A.)
Hot plate HP 160 III BM	Sawatec (Sax, Switzerland)		used for wafer preparation
Spin modules SM 180 BM	Sawatec (Sax, Switzerland)		used for wafer preparation
High resolution film photomask	Microlitho (Essex, U.K.)
Step profiler Dektak XT advanced	Bruker  (Massachusetts, U.S.A.)
Hot plate MR 3002	Heidolph (Schwabach, Germany)		used for replica molding
1.5 mm biopsy puncher	Miltex (Pennsylvania, U.S.A.)	33-31AA/33-31A
Spin coater  WS-400 BZ-6NPP/LITE	Laurell (Pennsylvania, U.S.A.)		used for adhesive bonding
Syringe pump neMESYS	Cetoni (Korbussen, Germany)
1 ml syringe	Codan (Lensahn, Germany)	62.1002
5 ml syringe	B. Braun (Melsungen, Germany)	4606051V
PTFE tubing	PKM SA (Lyss, Switzerland)	PTFE-AWG-TFT20.N
Quadrupole-based ICPMS ELAN6000	PerkinElmer (Massachusetts, U.S.A.)
Membrane desolvator CETAC6000AT+	CETAC Technologies (Nebraska, U.S.A.)		only the desolvator unit is used
High speed camera Miro M110	Vision Research (New Jersey, U.S.A.)
Data analysis program Origin pro	OriginLab Corp. (Massachusetts, U.S.A.)	version 8.6
Microscope	Olympus (Tokyo, Japan)	IX71