Un protocollo per lentivirali trasduzione e analisi valle di intestinale organoidi

Riepilogo

In this video protocol we give a step by step explanation of lentiviral transduction in organoids of primary intestinal epithelium and of processing and downstream analysis of these cultures by quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry.

Abstract

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth factors. Since organoids are highly similar to the original tissue in terms of homeostatic stem cell differentiation, cell polarity and presence of all terminally differentiated cell types known to the adult intestinal epithelium, they serve as an essential resource in experimental research on the epithelium. The possibility to express transgenes or interfering RNA using lentiviral or retroviral vectors in organoids has increased opportunities for functional analysis of the intestinal epithelium and intestinal stem cells, surpassing traditional mouse transgenics in speed and cost. In the current video protocol we show how to utilize transduction of small intestinal organoids with lentiviral vectors illustrated by use of doxycylin inducible transgenes, or IPTG inducible short hairpin RNA for overexpression or gene knockdown. Furthermore, considering organoid culture yields minute cell counts that may even be reduced by experimental treatment, we explain how to process organoids for downstream analysis aimed at quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry. Techniques that enable transgene expression and gene knock down in intestinal organoids contribute to the research potential that these intestinal epithelial structures hold, establishing organoid culture as a new standard in cell culture.

Introduzione

L'epitelio intestinale è uno dei tessuti corporei più rapida proliferazione, che ha causato di attrarre grande interesse dalla ricerca sulle cellule tumorali e staminali. Nel 2009 una tecnica è stata pubblicata per generare culture durevoli di piccole cripte intestinali in matrigel, conservando una struttura dimensionale 3 ^1. Tali strutture, denominate organoidi intestinali, possono essere coltivate utilizzando tecniche standard, con circostante medio integrato con una serie di fattori di crescita definiti, compreso il BMP-segnalazione inibitore pathway zucca (Nog), il Wnt-via di segnalazione enhancer rspondin 1 (Rspo1) e fattore di crescita epidermico (EGF) tutto ha trovato per migliorare la proliferazione intestinale ^2-4.

Organoidi superano linee tradizionali di cellule di cancro negli aspetti che sono non-mutato, hanno mantenuto la gerarchia di cellule staminali, mostrano la polarizzazione cellulare intatta e la differenziazione mostra in tutte le linee cellulari presenti nel piccolo int nascenteepitelio estinal. Dal momento che possono essere trasdotte per trasportare transgeni o RNA interference costruisce ^5, vengono utilizzati per studiare elementi genetici specifici, compensa esperimenti con topi transgenici in aspetti di costo e di velocità. Espressione transgenica in organoidi può essere eseguita utilizzando retrovirale murino o vettori lentivirali ^6,7. A causa delle limitazioni di retrovirus murini, in grado di trasduzione cellule mitotiche esclusivamente ^8, trasduzione lentivirali viene più frequentemente utilizzata per le celle che sono difficili da infettare, come organoidi.

Viralmente trasdotte e esprimono stabilmente organoidi transgenici possono essere usati per una moltitudine di analisi a valle, tra cui RNA quantitativo analisi ed immunoistochimica. Nel loro insieme, la cultura di organoidi da cellule epiteliali intestinali primarie si è evoluto in una tecnica di routine che è facile da implementare, senza requisiti specifici di laboratorio, ed è diventato il romanzo standard cecultura ll nella ricerca sul epitelio intestinale.

Tecniche di trasduzione virale e successiva analisi a valle in organoidi sono noiosi da eseguire e per aiutare gli esperimenti organoide abbiamo generato questo protocollo video, che mostra i metodi per lentivirali trasduzione del organoidi coltivate. Mostriamo inoltre come la corretta elaborazione del organoidi può aumentare la resa e quindi migliorare le prestazioni di analisi a valle con tecniche di RNA o immunoistochimica. Nel protocollo, organoidi che sono derivati ​​da piccole cripte intestinali sono stati usati esclusivamente, sebbene le tecniche descritte possono essere applicate a organoidi colon pure.

Protocollo

1. Preparazione di polietilenimmina (PEI) come Transfection Reagent

1. Disciogliere circa 150 mg di PEI in 100 ml di H ₂ O.
2. Regolare soluzione a pH 7.4 con l'aggiunta di HCl fino soluzione diventa chiara e mescolare fino a completa dissoluzione. Questo può richiedere tra 10 e 60 min e aggiungere acqua ad una concentrazione finale di 1 mg / ml.
3. Quando chiaro, filtrare la soluzione PEI attraverso sterile filtro da 0,22 micron e conservare in un -80 ° C freezer in aliquote di 5 ml.

2. Produzione di particelle lentivirali

Giorno 1:

1. HEK293T cellule Spalato al 60% -80% di confluenza in 162 cm ² fiasco o grande Petri in linea cellulare terreno di coltura (DMEM supplementato con 10% FCS, 1% di penicillina / streptomicina e integratore di glutammina 2 mm).

2 ° giorno:

2. Preparare la soluzione trasfezione di DNA contenente 45 mg di DNA totale plasmide sommandovettori lentivirali imballaggio (7 mg di pVSVg, 5 mcg di pRSV giri; 13 mcg di pMDL) e 20 microgrammi di plasmide lentivirali codificanti del gene di interesse o shRNA di interesse. Regolare ad un volume di 1 ml utilizzando DMEM.
3. Preparare la soluzione trasfezione PEI aggiungendo 90 ml di 1 mg / ml PEI a 930 ml di DMEM e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
4. Aggiungere la soluzione trasfezione DNA soluzione PEI. Vortex o invertire un numero di volte e incubare per 5 min a temperatura ambiente per ottenere una soluzione trasfezione di DNA.
5. Drip 2 ml della soluzione di trasfezione di DNA sulle cellule HEK293T e incubare per 4 ore in un incubatore umidificato coltura cellulare da 37 ° C.
6. Dopo 4 ore, aggiornare il terreno di coltura per rimuovere PEI. Non è necessario lavare cellule prima di aggiungere nuovo mezzo.
   NOTA: PEI è citotossici e di incubazione più di 4 ore può causare danni alle cellule HEK293T.

4 ° giorno:

7. Sostituire supernatant con il nuovo terreno di coltura. Tenere surnatante (contenente virus); questo sarà usato nella fase 2.10.
8. Mettere surnatante in 15 ml pallone. Per rimuovere le cellule morte, centrifugare per 5 min a 500 x g.
9. Spingere surnatante tramite 0,45 micron filtro con una grossa siringa da 60 ml. Conservare notte a 4 ° C.

5 ° giorno:

10. Raccogliere il secondo lotto di surnatante; centrifuga e filtro come in passaggi 2,8-2,9.
11. Pool il surnatante da passi 2.9 e 2.10 in tubi ultracentrifuga e centrifugare a 50.000 xg in un'ultracentrifuga per 90 min.
12. Estrarre capsule contenenti attentamente le provette ultracentrifuga e messo in una cappa a flusso laminare, ricordando l'orientamento del tubo all'interno della centrifuga.
13. Aprire capsula tenendo il tubo un'ultracentrifuga e medie decantare attentamente in modo tale che il pellet è sul lato superiore del tubo. Dal pellet virale può essere difficile da visualizzare, ricordare su qualilato del tubo un pellet sarà formata. Prendere una micropipetta e rimuovere ultimo bit di media facendo attenzione a non agitare il pellet marrone opaco che è visibile sul lato del fondo del tubo ultracentrifuga.
14. Risospendere questo pellet in 500 ml di terreno di coltura organoide integrati con nicotinamide 10 mm, 10 micron Chir99021, 10 micron Y27632 e 8 mg / ml polibrene. Risospensione in questo mezzo è importante poiché virus titolo elevato viene utilizzato per transduct direttamente organoidi.
15. Facoltativamente: congelare il virus in questo mezzo frazionato in due lotti di 250 microlitri a -80 ° C.

3. lentivirali trasduzione di organoidi

Giorno 0:

1. Dividere una completa 0,95 centimetri ² e di organoidi due giorni prima trasduzione in un nuovo pozzo, al fine di ottenere circa 50 piccoli organoidi. Split organoidi secondo il protocollo precedentemente pubblicato ¹ (Figura 3A, B).
2. Supplemento organoide mezzo di coltura con 10 micron Chir99021 e nicotinamide 10 mm per ottenere iper cistica cripte proliferative (Figura 3C).
   NOTA: cripte cistica svilupperanno meglio quando organoidi appena divisi sono coltivati ​​in presenza di Chir99021.

2 ° giorno:

3. Organoidi Harvest pipettando su e giù per il matrigel e media, interrompendo in tal modo il composto con una micropipetta p1000. Posizionare la miscela in una provetta da 15 ml.
4. Disrupt ulteriormente utilizzando Pasteur pipetta in cui l'apertura distale è stato diminuito da fusione. Organoidi centrifuga a pellet per 5 min a 100 x g.
   NOTA: A seconda della dimensione della centrifuga, utilizza una velocità di centrifuga diversa. È necessario trovare l'esatta velocità in cui interrotte organoidi sono separati dalla miscela.
5. Rimuovere il surnatante e aggiungere 500 ml di tripsina preriscaldata 1x (simile al 0,25% tripsina). Risospendere organoidi in tripsina e incubare3 min in un bagno di 37 ° C dell'acqua.
6. Inattivare tripsina aggiungendo 3,5 ml di terreno di coltura linea cellulare (DMEM supplementato con 10% FCS, 1% di penicillina / streptomicina e glutammina). Centrifugare per 5 min a 500 x g.
7. Rimuovere il surnatante di lasciare pellet in circa 20 ml di media. Trasferire i organoidi in questa ultima piccola quantità di mezzo in un pozzo in un piatto di 48 pozzi.
8. Aggiungi alto lentivirus titolo nel medio trasduzione come descritto al punto 2.14, risospendere e continuare con il passo 3.10. Quando incontra bassa efficacia di trasduzione, punto 3.9 possono essere aggiunti.
   NOTA: Per la trasduzione efficiente, tipicamente aggiungere un'aliquota di 250 microlitri di alta lentivirus titolo ad un pozzetto di organoidi. Questo rappresenta il 50% di tutti i lentivirus raccolti da una singola produzione come descritto al punto 2 di questo protocollo.
9. Facoltativamente: per migliorare l'efficacia trasduzione, effettuare spinoculation mettendo 48 pozzetti contenente organoidi in un pre-riscaldato centrifuga da 326; C e ruotare a 600 xg per 1 ora.
10. Mettere miscela organoide-virus in cultura incubatore e incubare per 1 ora a 37 ° C in un incubatore culturale per consentire trasduzione.
11. Facoltativamente: per migliorare ulteriormente l'efficacia di trasduzione, incubare organoidi Per ulteriori 3 ore a 37 ° C in un incubatore cultura.
12. Aggiungere 1 ml di terreno di coltura organoide e risospendere la miscela organoide-virus, il trasferimento in una provetta e centrifugare in una microcentrifuga per 5 minuti a 850 xg per far sedimentare organoidi.
13. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 20 ml di Matrigel ghiacciata. Poiché il materiale solidifica quando diventa caldo, utilizzare puntali che vengono refrigerati pipettando su e giù ghiacciata PBS per un numero di volte.
14. Mettere la goccia nel mezzo di un pozzetto in una piastra 48 pozzetti e incubare in coltura incubatore a 37 ° C per 15 minuti per solidificare.
15. Dopo 15 minuti, aggiungere con cautela 250 ml di terreno di coltura organoide integrato conNicotinamide 10 mM, 10 mM Chir99021 e 10 pM Y27632. Piccoli frammenti organoide perturbato formeranno in piccoli organoidi cistica entro 24 ore.

5 ° giorno:

16. Aggiorna medio e integrare con un antibiotico selezione (per puromicina, utilizzare 4 mg / ml).

7 ° giorno:

17. Sostituire mezzo per terreno di coltura organoide serie, integrato con la selezione antibiotica.
    NOTA: in erba sarà completa di 2-3 settimane dopo Chir99021 ritiro. Dopo la selezione, organoidi possono essere coltivate senza selezione antibiotica.

4. organoide RNA Preparazione quantitativa RT-PCR o Microarray

1. Per la preparazione di RNA, utilizzare un kit commerciale secondo il protocollo del produttore. Rimuovere il supporto da organoidi e aggiungere 350 ml di tampone RLT, integrati con β-mercaptoetanolo dritto sulla cupola di Matrigel contenente organoidi. Risospendere le Material in RLT pipettando utilizzando p1000 micropipetta.
2. Eseguire inoltre RNA preparazione secondo il protocollo del produttore.
3. Facoltativamente: aumentare la resa di RNA mediante amplificazione utilizzando il sistema Ovation Pico WTA, richiede input iniziale di 50 mg di RNA totale secondo il protocollo del produttore.
4. Facoltativamente: per il controllo di qualità prima di RNA microarray, campioni eseguito su un bioanalizzatore 2100 con un totale di chip eucariote RNA nano, puntando per un numero di integrità dell'RNA (RIN) di 8.5 o più (Figura 5) secondo il protocollo del produttore.

5. TRATTAMENTO organoidi per paraffina e immunoistochimica

1. Prima di iniziare organoide incorporamento pre-riscaldare un blocco di alluminio con fori 12 millimetri tubi di vetro di diametro montaggio in incubatore a 70 ° C per mantenere la paraffina liquida.
2. Prendete un singolo bene con organoidi pienamente sviluppati e rimuovere il supporto, lasciando intatte le organoidi incorporati.
3. Aggiungere 1 mldel 4% paraformaldeide in PBS dritto al bene e fissare a 4 ° C ovunque da 1 ora a notte.
4. Sostituire paraformaldeide con 1 ml di ghiaccio freddo PBS.
   Facoltativamente: mantenere organoidi fissi in PBS fino a 1 settimana a 4 ° C dopo questo passaggio.
5. Risospendere organoidi fissi in 1 ml di PBS e riporre in flacone di vetro.
6. Let organoidi depositano inferiore per 1 min, decantare PBS e sostituire con il 70% di etanolo in cui una coppia di goccioline di soluzione eosina vengono sciolti per consentire la visualizzazione del organoidi tutto il processo di incorporazione.
7. Lasciare organoidi in etanolo al 70% a temperatura ambiente. Dopo 30 minuti, rimuovere il 70% di etanolo con attenzione decantazione, essendo in grado di visualizzare i organoidi occhio a causa del leggero colore rosato eosina. Sostituire soluzione incasso con 96% di etanolo.
8. Ripetere passaggio 5.7, ogni volta sostituendo la soluzione incorporamento con la successiva. Passare organoidi attraverso le seguenti soluzioni successivamente: il 70% etanolo, 90% etanolo, 96% etanolo, 100% ethanol, 100% etanolo, xilene, xilene.
9. Decantare l'ultimo lavaggio xilene e versare la paraffina nel tubo. Inserire il tubo immediatamente nel blocco di alluminio pre riscaldato a 70 ° C per 30 min e sostituire paraffina con paraffina nuova pulita.
10. Versare la paraffina off e pipette organoidi nello stampo blocco di paraffina con una pipetta Pasteur preriscaldata con grande apertura. Mantenere Pasteur pipetta calda usando un becco Bunsen. Mettere tutti organoidi nello stampo blocco di paraffina in un piccolo strato di paraffina liquida.
11. Per quanto possibile, cercare di manipolare tutti organoidi verso il centro dello stampo blocco di paraffina utilizzando un ago dissezione riscaldato. Mantenere dissezione ago calda usando becco Bunsen.
12. Quando localizzazione organoidi nello stampo è soddisfacente, conchiglia leggermente a solidificare lo strato di paraffina.
13. Termina il blocco versando più di paraffina sulla parte superiore e aggiungere una cassetta embedding istologico standard.

Risultati

Organoide trasduzione lentivirali

La tecnica di trasduzione organoide utilizzando particelle lentivirali dipende corretta gestione dei organoidi prima e durante la trasduzione. Organoidi (Figura 3A) sono state coltivate e furono interrotto in cripte singoli (Figura 3B). Come riportato in precedenza, queste singole cripte, quando coltivate in presenza dell'inibitore GSK3 Chir99021 divennero cripte cistiche ⁹ (Figura 3C).

Discussione

Il protocollo video corrente descrive trasduzione lentivirale di organoidi da epitelio intestinale primaria e l'analisi a valle di queste organoidi utilizzando tecniche RNA quantitative e immunoistochimica.

Trasduzione lentivirali è spesso eseguita in cellule aderenti o galleggianti in piastre di coltura. Poiché la struttura tridimensionale di organoidi li rende difficile da penetrare da particelle virali, sono utilizzati diversi metodi per aumentare l'efficacia. Pretrattamento di ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polyethylene imine	Polysciences	23966-2
DMEM medium	Lonza	BE12-614F
Fetal calf serum	Lonza	DE14-801F
Penicillin-streptomycin	Invitrogen	15140-122
Glutamin	Invitrogen	25030-024
matrigel	BD	BD 356231
Advanced DMEM-F12	Gibco	12634-010
N2	Invitrogen	17502-048
B27	Invitrogen	17504-044
N-acetyl cysteine	Sigma	A9165-1G
mouse Egf	Invitrogen	PMG8045
Hepes 1 M	Invitrogen	15630-056
glutamax 100x	Invitrogen	35050-038
Chir 99021	Axon	1386
Y27632	Sigma	Y0503-5MG
polybrene	Sigma	107689
nicotinamide	Sigma	N0636
Trypsin	Lonza	BE02-007E
puromycin	Sigma	P 7255
Rneasy mini kit	Qiagen	74106
β-mercaptoethanol	Merck	8,057,400,250
Ovation Pico WTA system	NuGen	3300-12
paraformaldehyde	Sigma	252549-1L
glass vial conical 12 mm x 75 mm 5 ml	VWR	LSUKM12
Eosin Yellowish	VWR	1,159,350,025