Ultrasuoni Imaging per la valutazione di Spinal Cord Blood Flow in Sperimentale midollo spinale Lesioni

Riepilogo

Contrast Enhanced Ultrasound imaging is a reliable in-vivo tool for quantifying spinal cord blood flow in an experimental rat spinal cord injury model. This paper contains a comprehensive protocol for application of this technique in association with a contusion model of thoracic spinal cord injury.

Abstract

Riduzione del midollo spinale del flusso sanguigno (SCBF) (cioè, ischemia) svolge un ruolo chiave nel traumatico lesioni del midollo spinale (SCI), fisiopatologia e di conseguenza è un obiettivo importante per le terapie neuroprotettive. Anche se diverse tecniche sono state descritte per valutare SCBF, tutti hanno limitazioni significative. Per superare questi ultimi, si propone l'uso di immagini in tempo reale di contrasto ecografia (CEU). Qui si descrive l'applicazione di questa tecnica in un modello di ratto contusione SCI. Un catetere giugulare viene prima impiantato per l'iniezione ripetuta di mezzo di contrasto, una soluzione di cloruro di sodio di esafluoruro di zolfo microbolle incapsulate. La colonna vertebrale viene poi stabilizzato con un 3D-telaio su misura e il midollo spinale dura madre è esposta da una laminectomia a Thix-ThXII. La sonda ecografica viene quindi posizionato nel lato posteriore della dura madre (rivestito con gel ultrasuoni). Per valutare SCBF linea di base, una singola iniezione per via endovenosa (400 ml) di contraagente st viene applicato per registrare il suo passaggio attraverso l'intatto microcircolo del midollo spinale. Un dispositivo di peso-drop viene successivamente utilizzato per generare un modello riproducibile contusione sperimentale di SCI. Agente di contrasto è ri-iniettato 15 min dopo l'infortunio per valutare i cambiamenti post-SCI SCBF. CEU permette in tempo reale e in-vivo valutazione delle variazioni SCBF seguito SCI. Nel animale indenne, ecografia mostrava irregolare flusso di sangue lungo il midollo spinale intatto. Inoltre, 15 min post-SCI, c'era ischemia critica al livello dell'epicentro mentre SCBF rimasta conservata nelle zone più remote intatto. Nelle regioni adiacenti all'epicentro (sia rostrale e caudale), SCBF è stato notevolmente ridotto. Ciò corrisponde a quella precedentemente descritta "zona penombra ischemica". Questo strumento è di grande interesse per la valutazione degli effetti di terapie volte a limitare l'ischemia e la necrosi dei tessuti risultante a seguito SCI.

Introduzione

Lesioni traumatiche del midollo spinale (SCI) è una condizione devastante che causa una forte compromissione motoria, sensoriale e funzioni autonome. Finora, nessuna terapia ha dimostrato la sua efficacia in pazienti. Per tale motivo, è importante individuare nuove tecniche in grado di migliorare la valutazione dei potenziali trattamenti e può chiarire ulteriormente lesioni pathiophysiology ^1.

SCI è diviso in due fasi sequenziali, denominato lesioni primari e secondari. La lesione primaria corrisponde l'insulto meccanico iniziale. Considerando che i gruppi di lesioni secondarie una cascata di vari eventi biologici (come l'infiammazione, lo stress ossidativo e l'ipossia) che contribuiscono a seguito della progressiva espansione della lesione iniziale, danni ai tessuti e quindi neurologico deficit ^2,3.

Nella fase acuta della SCI, terapie neuroprotettive hanno lo scopo di ridurre la patologia danno secondario e should di conseguenza migliorare i risultati neurologici. Tra i tanti eventi di lesioni secondarie, ischemia svolge un ruolo cruciale ^{di 4,5.} A livello dell'epicentro SCI, i microvasi parenchimali danneggiate ostacolano efficace midollo flusso ematico ombelicale (SCBF). Inoltre, SCBF è significativamente ridotta nella regione circostante l'epicentro lesioni, un'area particolare nota come "zona penombra ischemica". Se SCBF non può essere rapidamente ripristinata entro queste regioni, l'ischemia può portare alla necrosi parenchimale supplementare e danni ai tessuti ulteriormente nervoso. Come anche il mantenimento del tessuto minima può avere effetti sostanziali della funzione, è di grande interesse per sviluppare farmaci e terapie che possono ridurre l'ischemia post-SCI. Per evidenziare questo fenomeno, lavoro precedente ha dimostrato che la conservazione di solo il 10% degli assoni mielinizzati è stato sufficiente per consentire a piedi nei gatti post-SCI ^6.

Sebbene diverse tecniche sono state descritte per valutare SCBF, lay tutti hanno limitazioni significative. Ad esempio, l'uso di microsfere radioattive ^7,8 e C14-iodopyrine autoradiografia ⁹ richiede una successiva sacrificio di animali e non può essere ripetuta in successivi punti temporali. La tecnica di depurazione idrogeno ¹⁰ dipende l'inserimento di elettrodi intraspinali, che potrebbero danneggiare ulteriormente il midollo spinale. Mentre Doppler laser, fotopletismografia ^14,15 e in vivo luce microscopia ¹⁶ hanno una molto limitata profondità / superficie di misura ^11-13.

La nostra squadra ha già dimostrato che un contrasto migliori ultrasuoni (CEU) di immagini può essere utilizzato per valutare in tempo reale e in vivo i cambiamenti SCBF nel parenchima midollo spinale di ratto ^17. E 'importante notare che una tecnica simile è stata applicata da Huang et al. In un modello suino di SCI ^18. CEU applica una specifica modalità di imaging ad ultrasuoni che permette di associare in scala di grigi im morfologicaetà (ottenuti per B-mode convenzionale) con distribuzione spaziale del flusso di sangue ^19. Imaging SCBF e la quantificazione si basa su iniezione intravascolare di agenti di eco-contrasto. L'agente di contrasto è costituito da microbolle di esafluoruro di zolfo (diametro di media circa 2,5 micron e il 90% ha un diametro inferiore a 6 micron) stabilizzata da fosfolipidi. Le microbolle riflettono il fascio di ultrasuoni emesso dalla sonda migliorando così ecogenicità sangue ed il contrasto dei tessuti secondo il loro flusso sanguigno. È quindi possibile valutare il flusso di sangue in una data regione di interesse secondo l'intensità del segnale riflesso. Le microbolle sono anche sicuro e sono stati applicati clinicamente nell'uomo. L'esafluoruro di zolfo è rapidamente cancellata (media emivita terminale è di 12 min) e più del 80% del esafluoruro di zolfo somministrato viene recuperato nell'aria espirata entro 2 minuti dopo l'iniezione. Questo protocollo fornisce un modo semplice per utilizzare CEU iminvecchiamento per valutare i cambiamenti SCBF nel ratto.

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Protocollo

NOTA: I metodi descritti in questo manoscritto sono stati approvati dal Comitato di Bioetica della Facoltà di Medicina Lariboisière, Parigi, Francia (CEEALV / 2011-08-01).

1. Strumento Preparazione

1. Preparare e pulire i seguenti strumenti per l'inserimento del catetere: micro pinze, micro-forbici, pinza micro-vascolare, grandi forbici, filo chirurgico (intrecciata nero di seta 4-0) e un catetere 14 G. Eparinizzare il catetere con una soluzione di eparina (5.000 U / ml).
2. Preparare e pulire i seguenti strumenti per la laminectomia: grandi forbici, bisturi e un cutter osso. Eseguire laminectomia con un cutter osso misura progettato per ridurre il rischio di danneggiare il midollo spinale durante la laminectomia (Figura 1).
3. Set-up 3D-telaio utilizzato per il posizionamento e la stabilizzazione dell'animale. Il telaio su misura è costruito con gli elementi di un fissatore esterno Hoffman 3 in collaborazione con pinze, which è stato curvato in modo da adattarsi alla colonna lombare dell'animale.
4. Preparare il dispositivo peso-drop (urto) utilizzato per lesioni del midollo spinale biomeccanico.
   NOTA: Il dispositivo di occlusione su misura è stato progettato con un software 3D e stampata in 3D.
5. Accendere la macchina ad ultrasuoni.
6. Preparare il kit per la ricostituzione del mezzo di contrasto.
   NOTA: Il kit comprende 1 flaconcino contenente 25 mg di polvere liofilizzata, siringa 1 pre-riempita contenente 5 ml di cloruro di sodio e un sistema di trasferimento mini-spike (Figura 2). I passi per la ricostituzione del mezzo di contrasto sono riportate di seguito (nella sezione 5).

2. Vena giugulare cateterizzazione (Figura 3)

1. Anestetizzare l'animale con il 4% isoflurano. Posto l'animale in posizione supina. Verificare il corretto anestesia facendo in modo che l'animale non risponde quando le zampe sono schiacciati con una pinza. Applicare veterinario pomata sugli occhi per prevenire la secchezza mentre under anestesia.
2. Radere al collo e pulire la pelle. Fare un'incisione sulla linea mediana del collo. Ritrarre il muscolo sternocleidomastoidian al fine di trovare la vena giugulare interna. Stringere una legatura nella parte rostrale della vena.
3. Applicare un morsetto microvascolare sulla vena, 1 cm sotto la legatura. Far passare un altro filo intorno alla vena, appena sotto la fascetta con il nodo pronto per essere stringere quando il morsetto viene rilasciato.
4. Aprire la parete della vena (venotomia) tra il morsetto e la legatura rostrale. Introdurre un catetere 14 G nel lume della vena e spingerlo verso il cuore.
5. Quando si tratta contro il morsetto, rilasciare quest'ultimo e spingere il catetere. Fissare il catetere nella vena, stringendo troppo il nodo sulla vena con il catetere all'interno.
6. Valutare pervietà del catetere prelevando una piccola quantità di sangue venoso nel catetere e successivamente poi risciacquo con soluzione salina eparinizzata. Questo impedisce l'ostruzione del catheter da un potenziale coagulo di sangue.
7. Collegare il tubo flessibile per il catetere per l'ulteriore iniezione di mezzo di contrasto (microbolle). Keep it chiuso (sigillato) fino al momento dell'uso.

3. Accesso alla colonna vertebrale, Laminectomy e Rat Posizionamento (in 3D-frame)

1. Posto l'animale in posizione orizzontale prona piatta. Shave e pulire la parte posteriore (regione toracica) dell'animale.
2. Identificare l'ultima costola (XIII nel ratto) mediante palpazione (Figura 4). Questo permette di stimare la posizione della vertebra toracica XIII (ThXIII).
3. Effettuare una incisione cutanea 4 centimetri sulla linea mediana, centrata sulla ThXIII. Aprire l'incisione cutanea, nonché la borsa sottostante. Osservare il aponeurosi dei muscoli della schiena, così come le punte dei processi colonna vertebrale vertebrali.
4. Localizzare con attenzione il processo di colonna vertebrale ThXIII palpando le costole XIII.
   NOTA: La nervatura XIII è collegato a ThXIII e rappresenta quindi un facile da locate punto di riferimento anatomico per l'identificazione di ThXIII. Questa fase consente la localizzazione del ThXII per Thix processo spinoso e L1 e L2 (primo e secondo vertebre lombari).
5. Tagliare il aponeurosi muscolare e staccare i muscoli su entrambi i lati per esporre i processi spinosi, le lamine e le faccette articolari da Thix a L2. Esporre gli aspetti laterali di L1 e L2 staccando muscoli dai processi trasversali.
6. Agganciare incisivi dell'animale sul 3D-frame per fissare la posizione (figura 5). Bloccare le vertebre L1 e L2 con le pinze modificati. Collegare la pinza modificati al 3D-frame al fine di stabilizzare l'animale.
7. Tirare delicatamente caudale le pinze che tengono la colonna lombare al fine di rafforzare l'intera colonna vertebrale e di elevare il torace dalla panchina.
   NOTA: Con la disposizione descritta l'animale deve essere in grado di respirare. Inoltre, nonostante i movimenti respiratori della gabbia toracica, la colonna vertebrale e il midollocavo deve anche rimanere immobile.
8. Rimuovere il processess spinoso da Thix a ThXII. Inserire delicatamente la lama inferiore della taglierina osso sotto la lamina di sinistra ThXII e chiudere la taglierina osso al fine di tagliare la lamina (figura 6).
9. Ripetere la stessa manovra per la lamina destra e successivamente rimuovere l'arco posteriore. Ripetere i passaggi precedenti per la ThXI vertebre a Thix al fine di ottenere una laminectomia a quattro livelli. Rimuovere entrambi faccette articolari per ogni vertebra.
   NOTA: Nel corso della procedura, pulire il campo operatorio per emorragia locale. Per questo, utilizzare tamponi di cotone e di irrigazione con soluzione salina tiepida. Emostasi avviene sistematicamente in pochi minuti.

4. CEU Probe Posizionamento

1. Coprire la dura madre con gel per ultrasuoni. Ciò permette la trasmissione effettiva degli ultrasuoni tra la sonda e il midollo spinale (Figura 7).
2. Stabilizzare l'arguzia sonda ecograficamorsetto ha che può essere successivamente collegata al 3D-frame da un braccio articolato. Posizionare manualmente la sonda. Assicurarsi che la sonda è orientata ad ottenere un obliquo longitudinale fetta sagittale. In una posizione corretta, il midollo spinale è strettamente orizzontale sull'immagine e il canale centrale del midollo spinale è visibile lungo l'intero segmento del midollo spinale.
   NOTA: posizionamento deve essere guidata dal immagine B-mode in tempo reale visualizzato sullo schermo della macchina ad ultrasuoni. La distanza focale della sonda ecografica deve essere allineato con il canale centrale del midollo spinale. A questo punto, la faccia posteriore del midollo spinale è accessibile che alla fine permettere il posizionamento del dispositivo di simulazione.
3. Quando ottimale, bloccare il braccio snodato per stabilizzare la posizione.

5. Preparazione di contrasto Agent - microbolle Ricostituzione

1. Utilizzando il contenuto di un kit commerciale ricostituzione e collegare lo stantuffo fissandolo tightly nella siringa (in senso orario). Aprire la confezione del sistema di trasferimento e rimuovere il tappo dell'ago della siringa. Aprire il tappo del sistema di trasferimento e connettere la siringa al sistema di trasferimento (serrare ermeticamente).
2. Rimuovere il disco protettivo dal flaconcino. Inserire il flaconcino nel manicotto trasparente del
3. sistema di trasferimento e premere con decisione per bloccare il flaconcino nella sua sede.
4. Svuotare il contenuto della siringa nel flaconcino spingendo lo stantuffo. Agitare energicamente per 20 secondi per miscelare tutto il contenuto nel flacone di ottenere un latte liquido omogeneo bianco.
5. Capovolgere il sistema ed estrarre con attenzione l'agente di contrasto nella siringa. Svitare la siringa dal sistema di trasferimento. Dopo ricostituzione (come indicato), 1 ml della dispersione prodotta contiene 8 microlitri di esafluoruro di zolfo nelle microbolle. Tracciare la sospensione di microbolle in una siringa 100 ml. Inserire la siringa 100 ml nella pompa elettrica. Chiudere il coperchio.
6. Avviare costante agitazione del remicrobolle costituite. Ottenuto agitazione costante per lenta rotazione della siringa, che mantiene la sospensione di microbolle. Collegare la pompa al catetere giugulare attraverso il tubo flessibile. Impostare la macchina ad ultrasuoni "Modo Armonico".
   NOTA: Quest'ultimo corrisponde al modo in cui le microbolle possono essere specificamente rilevati e visualizzati. Questa modalità ha un basso indice meccanico, che non distrugge le microbolle in contrapposizione alla B-mode.
7. Eliminare il catetere infondendo una prima dose (400 ml) di mezzo di contrasto. Durante questa prima infusione, controllare che le microbolle appaiono sullo schermo ultrasuoni. Questo conferma che l'intero circuito (dalla siringa al sangue del ratto) è intatto e aperta.
8. Impostare la macchina ultrasuoni per "B-mode" per visualizzare il parenchima del midollo spinale e la distruzione dei pochi microbolle rimanenti nel flusso sanguigno. L'alta frequenza del "B-Mode" tranalta energia smits alle microbolle, che permette loro di ripartizione.
9. Lasciate che l'animale rimase immobile per circa 30 min. Questo periodo permette la stabilizzazione dei parametri emodinamici.

6. Valutazione SCBF nel midollo spinale Intact

1. Impostare la macchina ad ultrasuoni per il "Modo Armonico". Avviare simultaneamente (1) infusione di mezzo di contrasto (400 microlitri) e (2) il cronometro.
   NOTA: Durante l'infusione, la concentrazione di microbolle nel sangue aumenta, consentendo l'immaginazione contrasto del midollo spinale (Figura 8). Poiché le microbolle sono rapidamente distrutti, la concentrazione nel sangue di microbolle inizia a diminuire dopo l'iniezione è terminata che genera una progressiva diminuzione visualizzazione contrasto del midollo spinale.
2. Dopo 1 minuto, selezionare (premere) il pulsante "Store Clip" sulla macchina ad ultrasuoni. Ciò consentirà uno per salvare 1 min di raw dati ultrasuoni e la registrazione del video immagini (che precedentemente era visualizzata sullo schermo ultrasuoni).
3. Impostare la macchina ad ultrasuoni di "B-Mode". Ciò elimina i rimanenti microbolle.

7. SCI sperimentale

1. Utilizzando il micromanipolatore collegata al 3D-frame, posizionare il dispositivo peso goccia impaction modo che la punta del dispositivo di simulazione viene a contatto con la dura madre (sulla linea mediana del midollo spinale), alla giunzione tra THX e ThXI (Figura 9) .
   NOTA: Questo livello dovrebbe corrispondere al centro del segmento del midollo spinale osservato con dispositivo ad ultrasuoni. L'attaccante e il corpo del dispositivo d'urto sono 8 mm di diametro. La punta del dispositivo di simulazione, che genererà la ferita, è di 3 mm di diametro.
2. Posizionare l'attaccante del dispositivo compressione in una posizione 10 centimetri alto. Indurre il SIC sperimentale rilasciando l'attaccante del dispositivo impatto. L'attaccante cade e rilascia the di simulazione, ferendo il midollo spinale. L'occlusione misura fornisce un effetto equivalente ad un peso di 10 g lasciata cadere da un'altezza di 10 cm.

8. Valutazione della SCBF 5 min post-SCI

1. Ripetere i passaggi descritti nella sezione 6 (Valutazione della SCBF). Le microbolle saranno in grado di passare attraverso il microcircolo danneggiata e l'epicentro ferita rimarrà scuro (Figura 10).

9. sacrificio animale

1. Euthanize l'animale con iniezione letale intraperitoneale di pentobarbital (100 mg).

10. La quantificazione di SCBF da Analysis Offline

1. Avviare il software Ultra-Extend impiegati per la quantificazione (in macchina ad ultrasuoni). Selezionare "file" e quindi selezionare i dati grezzi precedentemente salvati e aprire i file associati. Attivare la "modalità di quantificazione" premendo (selezione) il tasto "Chi Q". Select "Set ROI" (pulsante) e scegliere la forma circolare.
2. Selezionare "Draw ROI" (pulsante) e disegnare sette regioni circolari adiacenti di interesse (ROI) sul midollo spinale (Figura 11). Aprire il menu "Montaggio" e scegliere la funzione "Valore Curve". Osservare il software visualizzando diverse curve, ciascuna corrispondente alle variazioni di concentrazione microbolle all'interno di una ROI.
   NOTA: Ogni curva ha un profilo "perfusione-deperfusion". La prima fase della curva è piatta e corrisponde al periodo prima dell'arrivo di microbolle. Nella seconda fase, la concentrazione di microbolle aumenta rapidamente a causa della infusione. Nella terza fase, che inizia quando l'infusione è completo, la concentrazione di microbolle diminuisce progressivamente quando queste disintegratse nel sangue.
3. Posizionare la prima linea verticale all'inizio della seconda fase del cUrve e selezionare "SET". Questo informa il software da dove cominciare l'analisi.
4. Posizionare la seconda linea verticale alla fine della registrazione e selezionare nuovamente "SET". Questo informa il software dove fermarsi analisi.
5. Guarda il menu "CV" e registrare il valore "AUC", che corrisponde al "Area sotto la Curva" analizzata. Questo valore è proporzionale alla SCBF all'interno della corrispondente ROI.

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Risultati

Con il protocollo descritto sopra, è possibile mappare la SCBF lungo longitudinale midollo spinale segmento sagittale.

Nel midollo spinale intatto, sembra esserci irregolarità SCBF all'interno del parenchima (Figura 12). Questo può essere spiegato con la ripartizione variabile delle arterie radiculo midollare (RMA) da un animale all'altro. RMA si riferisce a segmentale arterie che raggiungono l'arteria spinale anteriore (ASA) e quindi fornire apporto di sangue...

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Discussione

Anche se abbiamo descritto come utilizzare CEU in un ratto SCI modello di contusione, questo protocollo può essere modificato per adattarsi altri obiettivi sperimentali o modelli SCI. Abbiamo scelto di misurare SCBF a soli due punti di tempo (prima della ferita e 15 min post-SCI), tuttavia il numero di punti di tempo e il ritardo tra le misurazioni SCBF possono essere adattati per soddisfare le esigenze di altri studi. Ad esempio, nel nostro precedente lavoro ^17, abbiamo misurato SCBF in cinque punti tempora...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
External Fixator Hoffman 3	Stryker, Kalamazoo, USA		Modular system used to build the custom made 3D frame and the jointed arm holding the ultrasound probe
Toshiba Applio	Toshiba, Tokyo, Japan		Ultrasound machine
Sonovue	Bracco, Milan, Italy		Contrast agent : microbubbles
Vueject pump	Bracco, Milan, Italy		Electric pump for infusion of microbubbles bolus
Aquasonic Ultrasound Gel	Parker Laboratories, Fairfield, NJ, USA		Ultrasound gel used to transmit the ultrasound waves
Isovet	Piramal Healthcare, Mumbai, India		Isoflurane used for anesthesia
Ultra Extend	Toshiba, Tokyo, Japan		Software used for quantification of spinal cord blood flow
Mastercraft Five-piece Mini-pliers Set, Product #58-4788-6	Canadian Tire, Toronto, Canada		Set of pliers for Do-it-yourself job