Immunoistochimica e multiplo etichettatura con anticorpi delle specie ospite stessi allo Studio adulti ippocampale neurogenesi

Riepilogo

This video article illustrates a comprehensive protocol to detect and quantify all stages of adult hippocampal neurogenesis within the same tissue section. We elaborated a method to overcome the limitations of indirect multiple immunofluorescence that arise when suitable antibodies from different host species are unavailable.

Abstract

Neurogenesi adulta è altamente regolamentato, processo a più stadi, in cui nuovi neuroni sono generati da una cellula staminale neurale attivato via sempre più impegnati sottotipi progenitrici intermedi. Ciascuno di questi sottotipi esprime un insieme di marcatori molecolari specifici, nonché criteri morfologici specifici, possono essere utilizzati per la loro identificazione. In genere, vengono applicate le tecniche di immunofluorescenza coinvolge anticorpi specifici del sottotipo in combinazione con indicatori di proliferazione exo- o endogeni. Siamo qui descriviamo immunomarcatura metodi per il rilevamento e la quantificazione di tutte le fasi di adulti neurogenesi ippocampale. Questi comprendono l'applicazione di analoghi della timidina, perfusione transcardial, lavorazione dei tessuti, calore indotta recupero epitopi, ABC immunoistochimica, multiple immunofluorescenza indiretta, microscopia confocale e quantificazione delle cellule. Inoltre, vi presentiamo un protocollo di immunofluorescenza sequenziale multiplo che elude problemi usually derivanti dalla necessità di utilizzare anticorpi primari sollevati nella stessa specie ospite. Esso permette una accurata identificazione di tutti i sottotipi progenitrici ippocampali insieme con un marcatore di proliferazione all'interno di una singola sezione. Queste tecniche sono un potente strumento per studiare la regolazione di diversi sottotipi progenitrici in parallelo, il loro coinvolgimento in patologie cerebrali e il loro ruolo nelle funzioni cerebrali specifiche.

Introduzione

Due regioni cerebrali costitutivamente generare nuovi neuroni per tutta la vita, la zona subventricolare dei ventricoli laterali e la zona subgranulare (SGZ) del giro dentato dell'ippocampo (DG). I nuovi neuroni derivano da cellule progenitrici neurali e passare attraverso diverse fasi di sviluppo morfologico e fisiologico, prima di raggiungere la maturità ^1,2. Da un glia-come radiale cellule staminali lentamente dividendo (tipo 1) fasi consecutive di transito amplificare cellule progenitrici intermedie sorgono. I sottotipi più indifferenziate (tipo 2a e 2b tipo) hanno una forma irregolare con brevi, processi tangenziali. Essi generano neuroblasti (tipo 3) che uscire gradualmente il ciclo cellulare di diventare neuroni immaturi (con dendriti estese verso lo strato molecolare) e, infine, integrare nella rete ippocampale granuli maturi. Per le loro caratteristiche fisiologiche particolari queste cellule forniscono il circuito con una maggiore plasticità ³ suggeting un ruolo unico in funzione ippocampale. In realtà, gli studi degli ultimi dieci anni hanno generato una sostanziale evidenza che neurogenesi adulta contribuisce alla memoria spaziale, la separazione del modello e comportamento emotivo ^4,5.

Neurogenesi adulta può essere studiato con diversi approcci. Analoghi della timidina incorporano nel DNA durante la fase S del ciclo cellulare e permettono la nascita datazione, la quantificazione e il destino l'analisi delle cellule neonato ^6-8. Applicazione sequenziale di diversi analoghi della timidina (ad esempio, CldU, EdU o IDU) può essere utilizzato per studiare il turnover cellulare o popolazioni di cellule nate in diversi momenti durante il corso di un esperimento ^9. Un'alternativa, marcatore endogeno per la proliferazione cellulare è Ki67. È espressa nelle cellule in divisione durante tutte le fasi del ciclo cellulare (G1, S, G2, M), tranne la fase di riposo (G0) e l'inizio della G1 ^10,11. Per analizzare il fenotipo di popolazioni cellulari neonati nell'adulto dentate del giro diversi marcatori molecolari specifici stadio possono essere utilizzati come GFAP, nestina, DCX e NeuN ^1,6. GFAP è un marker di astrociti maturi, ma si esprime anche in cellule gliali radiali come nel prosencefalo adulti. Nestin è un filamento intermedio specifico per le cellule gliali radiali-like e cellule progenitrici intermedi precoci. DCX è una proteina associata ai microtubuli espresso in progenitori intermedi, neuroblasti e neuroni immaturi. Sulla base del (co) espressione di questi tre marcatori e le caratteristiche morfologiche delle cellule marcate quattro sottotipi di cellule progenitrici distinti possono essere identificati: tipo 1 (GFAP ^+, nestina ^+, DCX ^-), di tipo 2 bis (GFAP ^-, nestina ⁺ , DCX ^-), di tipo 2b (GFAP ^-, nestina ^+, DCX ⁺⁾ e di tipo 3 (GFAP ^-, nestina ^-, DCX ^{+) 1.} Co-etichettatura dei DCX insieme NeuN, che si esprime nei neuroni postmitotiche, consente la differenziazione di immature (DCX ^+, NeuN ⁺⁾ e maturo (DCX ^-, NeuN ⁺⁾ neuroni granulari.

I marcatori di cui sopra sono spesso utilizzati per immunofluorescenza co-etichettatura e la successiva microscopia confocale per analizzare il numero e l'identità delle cellule neonate. Ciò richiede in genere anticorpi di diverse specie ospite per evitare indesiderate anticorpi cross-reattività. Tuttavia, la maggior parte degli anticorpi primari adatti per la ricerca neurogenesi sono sollevate nei conigli o topi (ad esempio, mouse α-BrdU, topo α-NeuN, coniglio α-Ki67, α-GFAP coniglio). Questo porta a gravi limitazioni nel numero e combinazione di antigeni che possono essere valutati in una singola fetta. Questo a sua volta non solo aumenta lo sforzo di colorazione, come più colorazioni devono essere eseguite, ma potrebbe anche compromettere l'affidabilità dei risultati. Inoltre, alcuni antigeni sono suscettibili di formalina epitopo mascheratura fissaggio indotta (ad esempio, Ki67, Nestina). Siamo qui descriviamo modifiche dai protocolli immunomarcatura singola e multipla classici (ad esempio, il recupero degli epitopi, multiple immunostaining sequenziale, uso di nestina-GFP topi transgenici ¹²⁾ superare molti di questi problemi. In particolare, il protocollo di immunofluorescenza sequenziale multiplo permette colorazione contro un massimo di quattro diversi antigeni anche se parte degli anticorpi è derivato dallo stesso host. Questo consente il rilevamento simultaneo di tipo 1, tipo 2a, 2b e tipo cellule progenitrici tipo 3, nonché la loro attività proliferativa all'interno di una singola sezione.

Protocollo

NOTA: Tutte le procedure che coinvolgono gli animali viventi sono state effettuate in conformità con la direttiva comunitaria 86/609 / CEE del Consiglio le linee guida sulla cura e l'uso di animali da laboratorio e approvato dal comitato etico locale (Thüringer Landesamt für Lebensmittelsicherheit und Verbraucherschutz).

1. Iniezione intraperitoneale della timidina Analoghi

1. Pesare animali il giorno prima dell'iniezione. Calcolare la quantità di timidina analogico richiesto per tutte le iniezioni in programma il giorno successivo, così come i singoli volumi di iniezione ponderati di un / ml di soluzione di 10 mg.
2. Preparare timidina soluzione madre di 10 mg / ml. (ATTENZIONE! Analoghi della timidina sono tossici. Seguire le specifiche schede di sicurezza (MSDS) fornite dai fornitori, vale a dire, indossare camice e guanti, usare una cappa).
   1. Prendere timidina analogico dal freezer e portarlo a RT, circa. 21 ° C. Pesare 10 mg e aggiungeresalina sterile (per BrdU e CldU) o 0,04 N NaOH (in soluzione salina sterile, per IDU), vortice. Posizionare per almeno 10 - 15 minuti in un bagno d'acqua a 50 ° C e agitare ogni 2 - 3 minuti per sciogliere la polvere.
      NOTA: utilizzare soluzioni per un massimo di 24 ore se conservato a temperatura ambiente e per diverse settimane a -20 ° C. Proteggere le soluzioni dalla luce (coprire con un foglio di alluminio). Controllare sempre per precipitati e ri-sciogliere, se necessario.
3. Trattenere il mouse per la collottola e intraperitoneale iniettare una, adattata al peso appropriato volume di soluzione di riserva (a temperatura ambiente) con una siringa di dosaggio fine con un G 30 ago.
   NOTA: In caso CldU e Idu devono essere somministrati sequenzialmente all'interno dello stesso animale, ritengono iniettare concentrazioni equimolari (ad esempio, 42,5 mg / kg CldU e 57,5 mg / kg IdU, che corrispondono a 50 mg / kg BrdU). Pertanto, regolare i volumi di iniezione delle soluzioni 10 mg / ml di archivi conseguenza.

2. Preparazione del tessuto

1. Prepare 4% di formaldeide in tampone fosfato 0,1 M pH 7,4, il giorno prima della perfusione. Conservare a 4 ° C.
2. Transcardially perfusione topi profondamente anestetizzati (3,5% isoflurano) attraverso il ventricolo sinistro con 10 ml PBS freddo, poi con 40 ml ghiacciata formaldeide (portata 5 ml / min). Sezionare il cervello e post-fix nello stesso fissativo per 24 ore a 4 ° C.
3. Trasferire il cervello consecutivamente in 10% (24 ore a 4 ° C) e del 30% di saccarosio (fino lavandini cerebrali, ca. 48 ore). Per il congelamento, lentamente immergere il cervello crioprotetti in -25 ° C fino a quando non isopentano bolle emergono dal tessuto. Conservare a -80 ° C.
4. Tagliare sezioni coronali di 40 micron di spessore su un microtomo congelatore (temperatura del blocco a -25 a -16 ° C). Trasferimento sequenziale sezioni in soluzione antigelo contenente pozzetti di una piastra di coltura cellulare di 24 pozzetti (vedi figura 1). Conservare a -20 ° C.

Figura 1. Schema di trasferire fette microtomo in un 24-pozzetti. Inizia a A1 e mettere le fette successive in riga A, dopo A6 passare alla riga successiva B e così via. Al raggiungimento D6, tornare a A1 e continuare. Questa disposizione consente di fette per la quantificazione di ogni n ^° sezione di un intero cervello. Per la quantificazione delle cellule neonate prendere ogni 6 ^th sezione cervello (equivalente al contenuto di una colonna), per immunofluorescenza fenotipizzazione prendere ogni sezione 12 ^th (equivalente al contenuto di 2 righe alternate di una colonna).

3. Immunostaining

NOTA: Le sezioni sono lavorate senza flottante, di solito in 6 pozzetti dotati di una piastra di supporto e inserti in mesh. In via eccezionale, il blocco, incubazioni anticorpi e reazioni ABC sono fatto in 12 o 24 e piastre senza inserti in rete (da 0,5 a 1 ml per well è sufficiente, a seconda del numero di fette che devono essere tinto). Durante queste fasi, di trasferire le sezioni con l'aiuto di un pennello sottile (risciacquare con ogni nuova soluzione). Tutte le incubazioni sono fatti con agitazione continua (max 150 rpm).

1. Immunoistochimica (metodo ABC)
   1. Trasferire le sezioni di antigelo in TBS e risciacquare abbondantemente (una volta O / N a 4 ° C, 5 volte a temperatura ambiente per 10 minuti ciascuno) per rimuovere completamente l'antigelo.
   2. Incubare per 30 min a 1,5% H ₂ O ₂ in TBS-T per placare la perossidasi endogena. Prestare attenzione alla frizzante e ri-immergere le sezioni, se necessario. Lavare 3 volte in TBS per 15 min ciascuno.
   3. Optional: Nel frattempo preriscaldare un armadio di riscaldamento e 2 N HCl a 37 ° C. Incubare sezioni per 30 min a 37 ° C in 2 N HCl per denaturare il DNA. Delicatamente sezioni separate con l'aiuto di una spazzola.
   4. Optional: Neutralizzare le sezioni per 10 min a 0,1 M borato a pH8.5, RT. Durante il trasferimento, brevemente tamponare gli inserti in mesh che contengono sezioni su un tovagliolo di carta per rimuovere avanzi HCl. Lavare 2 volte in TBS per 15 min ciascuno.
   5. Incubare in TBSplus per permeabilize il tessuto e per bloccare legame anticorpo siti non specifici, 1 ora a temperatura ambiente.
   6. Incubare in anticorpo primario diluito in TBSplus, O / N a 4 ° C. Lavare 3 volte in TBS per 15 min ciascuno.
   7. Incubare in biotinilato anticorpo secondario diluito in TBSplus, 3 ore a temperatura ambiente. Lavare 3 volte in TBS per 15 min ciascuno. Nel frattempo ...
   8. Preparare complesso ABC secondo il protocollo del produttore (1% A + 1% B in TBS-T). Lasciare riposare per 30 minuti a temperatura ambiente prima dell'uso. Incubare sezioni AB reagente per 1 ora a RT. Lavare 3 volte in TBS per 15 min ciascuno.
   9. Preparare 50 ml di 0,5 mg / ml DAB in TBS-T per 6 o 12 pozzetti, diviso in due metà e pipette 4 ml o 2 ml per pozzetto rispettivamente. Trasferimento sezioni in DAB soluzione (ATTENZIONE! DAB è tossico. Seguire la specific MSDS fornite dal fornitore, vale a dire, indossare camice e guanti, utilizzano una cappa).
   10. Aggiungere 0,5 ml di 1% H ₂ O ₂ al restante soluzione DAB 25 ml, mescolare e volumi pipetta equivalenti come sopra ad ogni pozzetto per iniziare la reazione perossidasi. Incubare per 12 min. Lavare 3 volte in TBS per 15 min ciascuno.
   11. Montare le sezioni per diapositive in gelatina, aria secca O / N. Coverslip con mezzo di montaggio permanente.
   12. Optional: Controcolorare prima di mettere il vetrino (vedi paragrafo 3.5).
       NOTA: Se il rapporto segnale-rumore è basso a causa di alta sfondo, ripetere il trattamento H ₂ O ₂ dopo l'incubazione con il reagente AB (passo 3.1.8).
2. Multiple-immunofluorescenza
   1. Singolo o simultanea immunofluorescenza multipla
      1. Trasferire le sezioni di antigelo in TBS e risciacquare abbondantemente (una volta O / N a 4 ° C, 5 volte a temperatura ambiente per 10 minuti ciascuno) per rimuovere completamente unnel sistema di raffreddamento.
      2. Optional: come passi 3.1.3 - 3.1.4.
      3. Incubare in TBSplus per permeabilize il tessuto e bloccare vincolante anticorpi siti non specifici, 1 ora a temperatura ambiente.
      4. Incubare in cocktail anticorpo primario (ad esempio, ratto α-BrdU, cavia α-DCX, α-GFP capra) diluito in TBSplus, O / N a 4 ° C. Lavare 3 volte in TBS per 15 min ciascuno.
      5. Incubare in cocktail di anticorpi secondari coniugati a fluorocromi (ad esempio, Rhodamine Red α-rat, Alexa-647 α-cavia, Alexa-488 α-capra, tutti derivati ​​in asino) diluito in TBSplus, 3 ore a temperatura ambiente o O / N a 4 ° C. D'ora in poi proteggere sezioni dalla luce. Lavare 3 volte in TBS per 15 min ciascuno.
      6. Montare le sezioni per diapositive in gelatina, aria secca O / N. Coverslip con mezzo di montaggio acquoso.
   2. Sequenziale immunofluorescenza multipla con anticorpi primari di una stessa specie ospiti
      1. Come passi 3.2.1.1 - 3.2.1.3.
      2. Incubare in fiprimo anticorpo primario (ad esempio, α-antigene coniglio A), O / N a 4 ° C. Lavare 3 volte in TBS e una volta in TBS-T per 10 minuti ciascuna.
      3. Incubare in prima anticorpi coniugati a fluorocromi secondaria (ad esempio, Rhodamine Red-cong. Asino α-coniglio), 3 hr RT. D'ora in poi proteggere sezioni dalla luce. Lavare 3 volte in TBS e una volta in TBS-T per 10 minuti ciascuna.
      4. Incubare in 10% di siero normale dalla stesso host gli anticorpi primari (ad esempio siero, coniglio) per 3 ore RT per saturare paratopes aperte sul primo anticorpo secondario. Lavare 3 volte in TBS e una volta in TBS-T per 10 minuti ciascuna.
      5. Incubare in TBSplus con 50 mg / ml monovalenti non coniugata Fab frammenti diretti contro l'ospite degli anticorpi primari (ad esempio, IgG α-rabbit (H + L)) per coprire epitopi che potrebbero essere riconosciuti dal secondo anticorpo secondario, O / N a 4 ° C.
      6. Lavare almeno 3 volte in TBS e una volta in TBS-T per 10 minuti ciascuna. Durante il trasferimento, brevemente swab agli inserti in mesh che contengono sezioni su un tovagliolo di carta per rimuovere eventuali avanzi Fab.
      7. Incubare in secondo anticorpo primario (ad esempio, coniglio α-antigene B), O / N a 4 ° C. Lavare 3 volte in TBS e una volta in TBS-T per 10 minuti ciascuna.
      8. Incubare in secondo anticorpi coniugati a fluorocromi secondaria (ad esempio, Alexa-488-cong. Asino α-coniglio), 3 hr RT. Lavare 3 volte in TBS per 15 minuti ciascuno, montare e applicare il coprioggetto come sopra.
         NOTA: Per etichettare antigeni con anticorpi da diverse specie ospite aggiungerli al punto 3.2.2.2 e rispettivi anticorpi secondari al punto 3.2.2.3.
   3. Uno degli anticorpi secondari da specie come uno degli anticorpi primari
      NOTA: Questo protocollo è adatto a quadrupla-colorazione contro BrdU o Ki67 insieme GFAP, nestina-GFP e DCX.
      1. Seguire rigorosamente protocollo passi 3.2.1.1 - 3.2.1.5. Fino a questo punto usare solo siero asino in TBSplus.
      2. Incubare in TBSplus contenente siero di capra 3% per 1 ora a RT. Questo copre paratopes aperte sul anticorpo secondario α-caprino. Lavare 3 volte in TBS e una volta in TBS-T per 10 minuti ciascuna.
      3. Incubare in AMCA-cong. capra α-coniglio diluito in TBSplus, 3 hr RT o O / N 4 ° C. Risciacquare tre volte in TBS per 15 min ciascuno, montare e applicare il coprioggetto come sopra.
   4. CldU, Idu co-colorazione
      1. Sciacquare, denaturare e neutralizzare le sezioni come descritto nella sezione 3.2.1 (punti 3.2.1.1 - 3.2.1.2).
      2. Incubare con 20 mg / ml non coniugati frammenti Fab α-topo IgG (H + L) in TBSplus, 1 ora a temperatura ambiente. Lavare 4 volte in TBS e una volta in TBS-T per 10 minuti ciascuno.
      3. Incubare in cocktail anticorpo primario contenente ratto α-BrdU (1: 400; purificato IgG2) e α-BrdU del mouse (1: 350) diluito in TBSplus, O / N a 4 ° C. Lavare 3 volte in TBS e una volta in TBS-T per 10 minuti ciascuna.
      4. Incubare in cocktail anticorpo secondario contenente asino biotinilate α-rat (1: 500) e FITC-conj. asino α-topo frammenti Fab (1: 100). Lavare 3 volte in TBS e una volta in TBS-T per 10 minuti ciascuna.
      5. Incubare in Rhodamine Red-cong. Streptavidin, 2 ore a RT. Lavare 3 volte in TBS per 15 minuti ciascuno, montare e applicare il coprioggetto come sopra.
   5. L'amplificazione del segnale di fluorescenza nei topi nestina-GFP
      1. Aggiungi capra α-GFP per il cocktail anticorpo primario.
      2. Aggiungi un anticorpo secondario coniugato con fluorocromo proprietà spettrali simili a GFP (come Alexa 488 cong. Asino α-capra) per il cocktail anticorpo secondario.
3. Recupero Epitope
   1. Effettuare smascheramento dopo risciacquo antigelo. Piroscafo Preriscaldare con 6 o 12 e piastre contenenti 0,1 M citrato a pH 6,0-95 - 99 ° C (circa 25 min).
   2. Trasferire le sezioni nel tampone citrato calda e vapore per 30 minuti (coprire i piatti con un foglio di alluminio come plastica lID non sono resistenti al calore).
   3. Posizionare immediatamente le piastre in un bagno di ghiaccio per raffreddare. Questo aiuta a proteggere morfologia tissutale, che è di particolare importanza quando si lavora con sezioni di cervello di animali postnatale.
   4. Lavare 3 volte in TBS per 10 minuti ciascuno per sciacquare e neutralizzare il citrato e continuare colorazione.
4. Mouse anticorpi sul tessuto del mouse
   1. Aggiungere 20 mg / ml monovalenti frammenti Fab α-topo IgG (H + L; stessa specie ospiti di anticorpo secondario) per la prima fase di blocco (ad esempio, step 3.1.5 o 3.2.1.3).
   2. Lavare 4 volte in TBS e una volta in TBS-T per 10 minuti ciascuno, e procedere con rispettivo protocollo.
5. Violetto cresolo di contrasto
   1. Soluzione Preriscaldare violetto cresolo a 60 ° C (in vaso di vetro). Incubare i vetrini nella soluzione calda per 3 minuti.
   2. Sciacquare in aq. dest. e disidratare 2 volte per 1 min ogni a 70%, 96% e 100% di isopropanolo.
   3. Chiaro per 5-6 min in xilene o sostituto xilene e coprioggetto con un mezzo di montaggio permanente compatibile.

Analisi 4. Dati

1. Contare le cellule neonate perossidasi colorate in ogni 6 ^° sezione lungo l'intera estensione rostrocaudale del giro dentato. Utilizzare un microscopio ottico con ingrandimento 400X.
2. Moltiplicare i numeri di cellule risultanti con l'intervallo di intersezione per ottenere una stima del numero totale di cellule neonato.
3. Immagine la fluorescenza etichettato sezioni con un microscopio laser confocale laser dotato di adeguati e sistemi di filtraggio. Prendere pile di immagini in posizioni casuali lungo l'intera estensione del giro dentato a 400X ingrandimenti e analizzare almeno 50 celle selezionate a caso di interesse per emisfero per co-marcatura con altri marcatori.
4. Moltiplicare le percentuali risultanti di cellule co-marcati (% / 100), con il numero totale di cellule neonate per calcolare assolutanumero di specifiche popolazioni cellulari neonati.

Risultati

Abbiamo applicato i metodi sopra descritti per quantificare e caratterizzare cellule neonate nei postnatale e adulta ippocampo. Pertanto, abbiamo utilizzato di tipo selvatico e neurogenesi-carente ciclina D2 knock out (KO) CCND2 topi alloggiati in condizioni note per influenzare il tasso di neurogenesi (cioè, ambiente arricchito, EE) ^13,14. La colorazione immunoistochimica DAB contro uno Ki67, BrdU, CldU o Idu costantemente rivelato differenze di numero di cellule neonati tra tipo selvatico...

Discussione

Quantificazione e identificazione di sottopopolazioni di cellule neonato è un tema centrale nella ricerca neurogenesi adulta. Combinando i marcatori di proliferazione e di anticorpi contro le proteine ​​espresse durante le fasi specifiche di neurogenesi adulta permette la rilevazione immunoistochimica di queste sottopopolazioni. Alcuni degli anticorpi o combinazioni di anticorpi richiedono condizioni di colorazione specifiche.

Etichettatura di divisione delle cellule con analoghi della ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name	Company	Catalog Number	Comments & Dilutions
Thymidine analog administration
5-Bromo-2′-deoxyuridine, BrdU	Sigma-Aldrich	B9285	toxic (mutagenic, teratogenic)
5-Chloro-2′-deoxyuridine, CldU	Sigma-Aldrich	C6891
5-Chloro-2′-deoxyuridine, CldU	MP Biomedicals	2105478
5-Iodo-2′-deoxyuridine, IdU	MP Biomedicals	2100357
Tissue preparation
Isoflurane-Actavis	Piramal Healthcare	700211
Paraformaldehyde powder (PFA)	Riedel-De Häen	16005	toxic, flammable
Perfusion pump PD5206	Heidolph Instruments	523-52060-00
Masterflex Tygon lab tubing, Ø 0.8 mm	Thermo Fischer Scientific	06409-13
Feeding needle, straight, 21G, 1.75mm olive tip, 40mm	Agnthos	1036
Freezing microtome Microm HM 400	Thermo Fischer Scientific
24 Well Cell Culture Multiwell Plates	Greiner Bio-One	662160
Immunohistochemistry
Tefal Vitacuisine Steamer	Tefal	VS 4001
Netwell 24mm Polyester Mesh Membrane Inserts Pre-Loaded in 6-Well Culture Plates	Corning	3479
Netwell 15mm Polyester Mesh Membrane Inserts Pre-Loaded in 12-Well Culture Plates	Corning	3477
Netwell Plastic 6-Well Carrier Kit for 24mm Polyester Mesh Membrane Inserts	Corning	3521
Netwell Plastic 12-Well Carrier Kit for 15mm Polyester Mesh Membrane Inserts	Corning	3520
Vectastain Elite ABC Kit	Vector Laboratories	PK-6100
DAB (3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate)	Sigma-Aldrich	D-5637	carcinogenic, light sensitive
Fluoromount-G	SouthernBiotech	0100-01
Primary antibodies
rabbit IgG1 α-Ki67	Novocastra/ Leica Biosystems	NCL-L-Ki67MM1	DAB 1:400/IF 1:100; requires epitope retrieval
rabbit α-GFAP, AS-3-GF	Synaptic Systems	173 002	1:500
goat IgG (H+L) α-GFP	Acris Antibodies	R1091P	1:300
mouse IgG1 α-nestin	Abcam	ab6142	1:200; requires epitope retrieval
guinea pig IgG (H+L) α-Doublecortin	Merck Millipore	AB2253	1:500
rat IgG2a α-BrdU (ascites)	AbD Serotec/ Bio-Rad	OBT0030CX	for detection of BrdU; DAB 1:500/IF 1:400
rat IgG2a α-BrdU (purified)	AbD Serotec/ Bio-Rad	OBT0030	for detection of CldU; DAB 1:500/IF 1:250-400
mouse IgG1ĸ α-BrdU	BD Biosciences	347580	for detection of IdU; DAB 1:500/IF 1:350
mouse IgG1 α-NeuN	Merck Millipore	MAB377	1:500
Secondary antibodies
donkey α-guinea pig IgG (H+L)-Biotin	Dianova	711-065-152	1:500
donkey α-rat IgG (H+L)-Biotin	Dianova	712-065-150	1:500
donkey α-mouse IgG (H+L)-Biotin	Dianova	715-065-151	1:500
goat α-rat IgG (H+L)-Alexa Fluor 488	Molecular Probes	A11006	1:250
donkey α-goat IgG (H+L)-Alexa Fluor 488	Molecular Probes	A11055	1:250
donkey α-mouse IgG (H+L)-FITC, Fab-Fragment	Dianova	715-097-003	1:100
donkey α-mouse IgG (H+L)-Alexa Fluor 647	Dianova	715-605-151	1:250
donkey α-guinea pig IgG (H+L)-Alexa Fluor 647	Dianova	706-605-148	1:250
donkey α-rat IgG (H+L)-Rhodamine Red-X	Dianova	712-295-150	1:250
donkey α-rabbit IgG (H+L)-Rhodamine Red-X	Dianova	711-295-152	1:250
donkey α-guinea pig IgG (H+L)-Rhodamine Red-X	Dianova	706-296-148	1:250
Streptavidin-Rhodamine Red-X	Dianova	016-290-084	1:500
goat α-rabbit IgG (H+L)-AMCA	Dianova	111-155-144	1:250, works only with rabbit α-GFAP
Hoechst 33342	Molecular Probes	H3570	1:1000
DAPI	Molecular Probes	D1306	1:1000
Blocking
Fab-fragment donkey α-mouse IgG (H+L)	Dianova	715-007-003	1:20
Fab-fragment donkey α-rabbit IgG (H+L)	Dianova	711-007-003	1:20
Normal donkey serum	Merck Millipore	S30
Normal rabbit serum	Dianova	011-000-010
Normal goat serum	Dianova	005-000-001
Bovine Serum Albumine	Sigma-Aldrich	A7906
Histology
Cresyl violett	Sigma-Aldrich	C5042
Neo-Clear	Merck Millipore	109843	non-toxic xylene substitute
Neo-Mount	Merck Millipore	109016	permanent mounting medium
Microscopy
Axioskop 2	Carl Zeiss Microscopy
LSM 710	Carl Zeiss Microscopy