Mosaic Zebrafish Transgenesi per analisi genomica funzionale di geni candidati cooperative in Tumor Patogenesi

Riepilogo

The goal of this study is to demonstrate how the mosaic transgenesis strategy can be used in zebrafish to rapidly and efficiently assess the relative contributions of multiple oncogenes in tumor initiation and progression in vivo.

Abstract

Comprehensive genomic analysis has uncovered surprisingly large numbers of genetic alterations in various types of cancers. To robustly and efficiently identify oncogenic “drivers” among these tumors and define their complex relationships with concurrent genetic alterations during tumor pathogenesis remains a daunting task. Recently, zebrafish have emerged as an important animal model for studying human diseases, largely because of their ease of maintenance, high fecundity, obvious advantages for in vivo imaging, high conservation of oncogenes and their molecular pathways, susceptibility to tumorigenesis and, most importantly, the availability of transgenic techniques suitable for use in the fish. Transgenic zebrafish models of cancer have been widely used to dissect oncogenic pathways in diverse tumor types. However, developing a stable transgenic fish model is both tedious and time-consuming, and it is even more difficult and more time-consuming to dissect the cooperation of multiple genes in disease pathogenesis using this approach, which requires the generation of multiple transgenic lines with overexpression of the individual genes of interest followed by complicated breeding of these stable transgenic lines. Hence, use of a mosaic transient transgenic approach in zebrafish offers unique advantages for functional genomic analysis in vivo. Briefly, candidate transgenes can be coinjected into one-cell-stage wild-type or transgenic zebrafish embryos and allowed to integrate together into each somatic cell in a mosaic pattern that leads to mixed genotypes in the same primarily injected animal. This permits one to investigate in a faster and less expensive manner whether and how the candidate genes can collaborate with each other to drive tumorigenesis. By transient overexpression of activated ALK in the transgenic fish overexpressing MYCN, we demonstrate here the cooperation of these two oncogenes in the pathogenesis of a pediatric cancer, neuroblastoma that has resisted most forms of contemporary treatment.

Introduzione

Tumori sono malattie progressive contrassegnati da un accumulo di mutazioni patologiche, delezioni cromosomiche e guadagni nel corso del tempo. Queste anomalie genetiche possono influenzare molteplici processi cellulari che vanno dal ciclo cellulare, morte cellulare, metabolismo energetico e l'assemblaggio del citoscheletro sottolineare risposte come ipossia. Quindi, tumorigenesi riflette le azioni collettive di più aberrazioni genetiche attraverso una gamma di processi biologici. I recenti sforzi integrative genomiche di ricerca, tra cui intero sequenziamento del genoma, exome sequencing, sequenziamento mirato, sequenziamento profondo e gli studi di associazione sull'intero genoma, hanno identificato un numero crescente di nuove alterazioni genetiche in essenzialmente tutti i tipi di tumori ^1-4. In molti casi, le lesioni genetiche presentano insieme in maniera non casuale ^5-8, suggerendo loro cooperazione nella patogenesi della malattia. Analisi dei ruoli oncogeniche della vasta gamma di geni espressi aberrante derivanti fROM queste lesioni genomiche È necessario elaborare nuove strategie terapeutiche e di comprendere le risposte delle cellule tumorali a questi agenti, ma questo ha dimostrato di essere un compito arduo, che richiede molto robusti sistemi modello animale per lo svolgimento di high-throughput analisi genomica funzionale vivo.

Anche se i mammiferi, in particolare roditori, sono modelli favorite in biologia del cancro, il pesce zebra ha iniziato ad attirare una notevole attenzione. Il pesce zebra teleosteo (Dario rerio) è stata utilizzata come organismo modello per lo studio dello sviluppo dal 1960 ed è stata applicata la prima allo studio della patogenesi del tumore nel 1982 ^9-11. Facilità di manutenzione, di piccola dimensione del corpo, e l'alta fecondità rendono il zebrafish un modello robusto per schermi genetici a termine su larga scala per identificare le mutazioni che conferiscono fenotipi anormali e patologiche ^10. La trasparenza ottica di embrioni di zebrafish è un altro elemento chiave a sostegno più ampio uso di questo modello di cancro, comepermette imaging in vivo ad essere condotti per individuare lo sviluppo del tumore in tempo reale ^9, un'applicazione che è relativamente difficile nei roditori ^12. Genomica comparativa recente analisi del genoma di riferimento zebrafish (Zv9) ha rivelato 26.206 geni codificanti proteine, il 71% ha ortologhi umani, di cui l'82% sono correlati con i geni associati alla malattia della linea mendeliana Inheritance in Man (OMIM) del database ^{13, 14.} Di conseguenza, il pesce zebra è stato utilizzato per modellare diversi tipi di tumori umani, tra cui ⁸ neuroblastoma, cellule T leucemia linfoblastica acuta (T-ALL) ^15,16, il melanoma ^17,18, sarcoma di Ewing ^19, rabdomiosarcoma ^20,21, carcinoma pancreatico ^{22, 23} e carcinoma epatocellulare mieloide neoplasie ^24,25, ed è stato selezionato come un modello di cancro per lo xenotrapianto studi ^11,26.

A transgenico stabileapproccio in zebrafish è comunemente usato per studiare l'effetto di guadagno-di-funzione dei geni nello sviluppo normale o malattia patogenesi ^27,28. Per sviluppare un tale modello (Figura 1A), si inietta un costrutto di DNA contenente il gene di interesse azionato da un promotore tessuto-specifico in una cellule wild-type embrioni. Tre o quattro mesi dopo l'iniezione, quando gli embrioni iniettati raggiungono la maturità sessuale, sono outcrossed con wild-type di pesce per lo screening per i più mostrano integrazione del DNA costruire nella loro linea germinale, che concede in licenza il pesce fondatore. Molti fattori, come il numero di copie e sito di integrazione del transgene, influenzano l'espressione del transgene in linee transgeniche stabili. Così, per sviluppare un modello di tumore transgenico, più linee transgeniche stabili sovraesprimono un singolo oncogene devono essere generati prima e screening per la linea esprimere il transgene ad un livello che potrebbe condurre a tumori indotti. Tuttavia, se la sovraespressione di un candidato oncogene è tossico per le cellule germinali, è difficile generare una linea transgenica stabile sovraespressione direttamente il transgene ^29. Pertanto, questo approccio può richiedere molto tempo, con un elevato rischio di fallimento per generare un modello di cancro adatto.

Qui illustriamo una strategia alternativa basata su mosaico transgenesi transitoria (Figura 1B), che fornisce vantaggi unici rispetto transgenesi tradizionale stabile per lo studio di genomica funzionale in vivo. In questo approccio, una o più costrutti transgenici sono iniettati nello stadio unicellulare di transgenici o wild-type embrioni. I costrutti di DNA contenenti iniettate transgeni sono poi mosaically e casualmente integrati nel pesce iniettato primario, con conseguente genotipi misti in popolazioni di cellule più in singoli pesci ^30. Inoltre, co-iniezione di DNA multiple costruisce in embrioni di una cellule porta alla co-integrazione nella stessa cella in siti casuali, permettendo di TRACe le cellule con l'espressione dei transgeni ed esplorare le interazioni dei diversi geni durante patogenesi della malattia negli animali mosaico ^31. Come prova di principio, siamo transitoriamente sovraespresso ALK mutationally attivato (F1174L) con mCherry gene reporter nel sistema nervoso simpatico periferico (PSNS) sotto il controllo del idrossilasi beta dopamina (d βh) promotore wild-type di pesce e pesce transgenico sovraespressione MYCN. ALK, che codifica un recettore tirosina chinasi, è il gene più frequentemente mutato in neuroblastoma ad alto rischio ^5-7,32,33. ALK (F1174L), come una delle mutazioni somatiche attivazione più frequenti e potenti, è sovra-rappresentata in MYCN- amplificato pazienti neuroblastoma ad alto rischio e con synergizes MYCN sovraespressione di accelerare neuroblastoma tumorigenesi sia nei topi transgenici stabili e transgenici modelli zebrafish ^8,34,35. By mosaicosovraespressione transiente di ALK (F1174L) con mCherry nel pesce transgenico MYCN, abbiamo ricapitolato l'accelerazione di insorgenza del tumore osservata nei pesci transgenici che sovraesprimono stabile sia ALK (F1174L) e MYCN, suggerendo che la strategia transgenesi mosaico può essere utilizzato per rapidamente ed efficacemente valutare i contributi relativi di più oncogeni nel tumore iniziazione in vivo.

Protocollo

NOTA: Tutti gli studi di zebrafish e manutenzione degli animali sono stati fatti in accordo con il protocollo Mayo Clinic Institute IACUC approvato # A41213.

1. DNA costrutti per Transgenesi

1. Amplifica una regione del promotore 5.2-kb beta dopamina idrossilasi (d βh) ⁸ utilizzando il clone CH211-270H11 BAC (dal BacPac Centro risorse (BPRC)) come modello di DNA. Utilizzare un sistema adeguato per PCR lungo e accurato l'amplificazione PCR di modelli di DNA lunghe e seguenti programmi ciclo di PCR: 94 ° C per 2 min, 10 cicli di (94 ° C, 15 sec, 50 ° C, 30 sec, 68 ° C, 8 min), seguita da 30 cicli di (94 ° C, 15 sec, 53 ° C, 30 sec, 68 ° C, 8 min), 68 ° C, 4 min (forward primer 5'-GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGGCGTACTCCCCCTTTTTAGG-3 ' e primer reverse 5'GGGGACTGCTTTTTTGTACAAACTTGTGTTGCTTTGTCGTCTTTTGA-3 ').
2. Creare il d βh -pDONRP4-P1R entry clone ⁸ utilizzando commercial Sistema clonazione ricombinante come gateway di multisito. Mescolare 1 ml di dβh purificato prodotto della PCR (172 ng / ml), 1 ml (150 ng / ml) pDONRP4-P1R donatore vettore (insieme ad altri vettori di gateway sono doni generosi del dottor Chi-Bin Chien, Univ. Di Utah) , 4 microlitri di tampone TE (pH 8.0) con 2 ml di BP mix clonase enzima, incubare per 1 ora a 25 ° C e poi a trasformare One Shot TOP10 competente E. coli secondo il protocollo del produttore.
3. Generare il d βh: transgenica EGFP-MYCN costruire ⁸ utilizzando il sistema di clonazione ricombinante di cui al punto 1.2. Mescolare 1 ml di ogni clone di entrata (150 ng / mL) tra cui un-kb 5.2 promoter dβh (dβh -pDONR P4-P1R costrutto), EGFP manca un codone di stop (PME-EGFP costrutto), e umano MYCN cDNA (un dono generoso Dr. Hogarty all'ospedale dei Bambini di Pennsylvania, MYCN-pDONRP2R-P3 costrutto), 1 ml (150 ng / ml) del vettore di destinazione modificato contenente siti di riconoscimento I-SCEI (un dono generoso del Dr. C. Grabher, Karlsruhe Institute of Technology, Karlsruhe, Germania), 4 pl di tampone TE ( pH 8.0) con 2 ml di LR Clonase miscela enzimatica, incubare per 1 ora a 25 ° C e poi a trasformare chimicamente competente E. coli quali One top sparato 10 e seguire il protocollo del produttore.
4. Fai MITF: transgenica MITF costruire ⁸ digerendo il vettore PNP-MITF con NotI e Sali enzimi di restrizione per 2 ore a RT, e la subcloning rilasciato 2.65-kb (un dono generoso da Dr. D. Raible, Univ of Washington.) frammento di DNA che contiene il promotore MITF e la sequenza codificante del gene MITF zebrafish nei siti NotI e MluI di un vettore pBluescript modificato contenente accompagnamento siti di riconoscimento I-SCEI (un dono generoso da Dr. Hui Feng, Boston University), utilizzando DNA ligasi T4 secondo il protocollo del produttore.
   NOTA: per aumentare l'efficienza di generare linee MYCN esprimente stabili, d βh: EGFP-MYCN e MITF:. Costrutti DNA MITF sono coinjected in una delle cellule di embrioni fase madreperla Nacre designa un tipo di pesce mutante manca un neurale derivati ​​dalla cresta melanophore durante lo sviluppo ^36. Così, la comparsa di cellule del pigmento negli embrioni iniettati suggerisce l'integrazione di MITF: DNA MITF costruisce nel genoma. È stato dimostrato che due o tre costrutti di DNA possono essere coinjected cointegrate nel genoma pesci ^31. Così, pigmentazione causata da espressione MITF può servire come marker per l'integrazione della dβh: transgene EGFP-MYCN e per una più facile individuazione di MYCN linea transgenica stabile.
5. Mescolare il d βh: EGFP-MYCN e MITF: DNA MITFcostrutti in un rapporto 3: 1 in un volume totale di una reazione di 15 microlitri di 1 ml di I-SCEI enzima e 0,75 ml di tampone. Assicurarsi che la quantità totale di DNA nella reazione non superi 750 ng.
6. Effettuare la digestione I-SCEI a temperatura ambiente per 4 ore o O / N. Il secondo giorno, la I-SceI- digerito DNA sono pronti per microiniezione o possono essere conservati a -20 ° C per l'iniezione in futuro. Conservare l'enzima I-SCEI a -80 ° C in piccole aliquote per mantenere la sua efficacia enzima.
7. Subclone la ALKF1174L umano e wild-type del gene ALK dal pcDNA3 vettore (un dono generoso del Dr. George al Dana-Farber Cancer Institute) ⁷ in EcoRI e NotI siti di un vettore pENTRY1A (un dono generoso del Dr. C. Grabher, Karlsruhe Institute of Technology, Karlsruhe, Germania) utilizzando DNA ligasi T4 secondo il protocollo del produttore.
8. Generare il d βh: ALKF1174L </ Em> o dβh: costrutti transgenici ALKWT utilizzando il sistema ricombinante di cui al protocollo 1.2. In breve, unire tre cloni di ingresso, dβh -pDONRP4-P1R, ALKF1174L- pENTRY1A (o ALKWT -pENTRY1A) e P3E-polyA, nel vettore di destinazione modificato contenente siti di riconoscimento I-SCEI (un dono generoso del Dr. C. Grabher, Karlsruhe Institute of Technology, Karlsruhe, Germania), con LR Clonase enzima Mix, secondo il protocollo del produttore.
9. Mescolare il d βh: ALKF1174L (o dβh: ALKWT) e dβh: DNA mCherry costruisce in un rapporto di 3: 1 e linearizzare con I-SCEI enzima, come descritto nel protocollo 1,5-1,6.

2. Microiniezione

1. Utilizzare micropipette di vetro con diametro di 1,0 mm per tutte le iniezioni ^{di 37.} Spezzare la punta delle micropipette di vetro con una lametta prima dell'iniezione. Calibrare il volume di iniezione per iniezioneing H ₂ O in una goccia di olio minerale. Misurare il diametro delle goccioline risultanti e regolare la microinjector (pressione o durata di impulso di pressione) per assicurare che il volume di iniezione è inferiore al 10% del volume cellulare totale di uno embrioni cellule stadio.
2. Aggiungere un ulteriore 0,5 l di fresco I-SCEI enzima (5 unità / ml) in 5 ml di soluzione iniettabile contenente DNA costruisce destra prima dell'iniezione per aumentare l'efficienza della transgenesi ^38. Iniettare 50-80 pg di costrutti di DNA linearizzate nel citoplasma di una cellula-embrioni stadio. Per assicurare il successo di iniezione, miscelare il campione con 0,25% di rosso fenolo per la visualizzazione. Se le cellule diventano rossi dopo l'iniezione, indica la microiniezione è riuscita. Per garantire un alto tasso di successo per la generazione di pesci transgenici, di solito iniettare fino a 500 embrioni.
3. Per generare pesci transgenici che esprimono stabilmente MYCN, coinject il linearizzato d βh: EGFP-MYCN e MITF: costrutti DNA MITF (in un rapporto di 3: 1) in embrioni di pigmentazione mutante madreperla zebrafish allo stadio unicellulare. L'espressione di Mitf serve come reporter per l'integrazione di costrutti transgenici nel genoma pesci.
4. Per sovraespressione mosaico di ALK nel wild-type o MYCN embrioni transgenici, co-iniettare il linearizzato d βh: ALK F1174L (o dβh: ALKWT) con dβh: DNA mCherry costruisce (in un rapporto di 3: 1) nella cellula uno embrioni risultanti da allevamento di F1 eterozigoti Tg (dβh: EGFP-MYCN) pesci transgenici con wild-type AB pesce. Così, la metà dei figli sono transgenici per MCYN e mezzo sono wild-type.

3. Schermo per Pesce stabile o Mosaic transgenici

1. Per aumentare l'efficienza di identificazione delle linee MYCN esprimente stabili, anestetizzare gli embrioni madreperla principalmente iniettati con tricaine (0,02%) at giorni 3-5 di postfertilization e schermo per la pigmentazione. Trasferire gli embrioni con pigmentazione ad una nuova capsula di Petri con acqua fresca all'uovo ed aumentare loro di maturità sessuale per ulteriori controlli per il pesce fondatore, che portano il d βh: transgene EGFP-MYCN nelle cellule germinali.
2. Per identificare il fondatore con la trasmissione germinale di EGFP-MYCN, outcross pigmentato pesce F0 adulto con wild-type AB pesci e dello schermo per embrioni EGFP-positivi a 1-2 giorni dopo la fecondazione per ulteriori genotipizzazione. Posizionare un singolo embrione F1 EGFP-positivi in ​​un tubo di PCR e rimuovere tutto il liquido. Aggiungere 50 ml di tampone di estrazione gDNA che contiene 12,5 ml di tampone di lisi 4x, 35 ml di H ₂ O e 2,5 ml proteinasi K (10 mg / ml) per singolo embrione. Incubare la reazione per 2-3 ore a 55 ° C, seguita da 10 minuti di incubazione a 98 º C per inattivare proteinasi K. Per 50 ml di tampone di lisi 4x, aggiungere 500 ml di 1M Tris (pH 8,4), 2,5 ml di 1M KCl to 47 ml di H ₂ O. NOTA: Dopo F0 MYCN stabile pesci transgenici sono allevati con wild-type AB pesce, tutti i figli sono pigmentate. Così, la pigmentazione non può servire come marcatore per l'identificazione di MYCN- pesci positive. Mentre nel pesce transgenico MYCN, la proteina di fusione EGFP-MYCN è espresso nella PSNS, compresi i neuroni simpatici del ganglio cervicale superiore e sequenziale segmentale gangli della catena simpatica ei PSNs non neuroni dopaminergici, come il midollo allungato e gangli cranica ^8. Così, l'espressione di EGFP può servire come marker per l'identificazione degli embrioni transgenici stabili MYCN.
3. Utilizzare 2 ml di gDNA estratte dall'embrione F1 pigmentata come modello, primer MYCN-test F1: 5'-CTG CTT GAG AAC GAG CTG TG-3 '; MYCN R3: 5'-AGG CAT CGT TTG AGG ATC AG-3 ', e la seguente ingegno programmah GC-RICH PCR: 1 ciclo di 95 ° C per 3 minuti, 25 cicli di 95 ° C per 30 sec, 58 ° C per 30 sec e 72 ° C per 3 min. Noi di solito genotipo 14-16 embrioni pigmentati da un unico accoppiamento per confermare la presenza di transgene MYCN integrati negli embrioni pigmentati, più di 6 fondatore pesce iperespressione MITF e MYCN sono stati individuati con questo metodo.
4. Sollevare il resto degli embrioni F1 EGFP-positivi. Clip Fin e genotipo a 2-3 mesi di età utilizzando il protocollo di cui sopra per confermare ulteriormente l'integrazione di MYCN transgene nel pesce. Razza F1 MYCN pesci transgenici stabile con wild-type AB pesce. Co-iniettare il linearizzato d βh: ALK F1174L (o dβh: ALKWT) con dβh: DNA mCherry costruisce in embrioni uno cellule, come descritto nel protocollo 2.4.
5. Ordina la MYCN esprimente embrioni nell'esperimento descritto nel protocollo 2.4 utilizzando un fluoro stereoscopicaMicroscopio escence e schermare gli embrioni principalmente iniettati a giorni 1-3 del postfertilization per l'espressione di EGFP-MYCN nella PSNS. Poi, nei giorni 2-5 di postfertilization, anestetizzare gli embrioni con tricaine (0,02%) e ordinare quegli embrioni MYCN- positivi o negativi di nuovo in base all'espressione dei mCherry nelle PSNS utilizzando un microscopio a fluorescenza stereoscopico. L'espressione di mCherry serve come un marcatore per la coespressione di ALK nei tessuti degli animali primaria mosaico iniettati.
   NOTA: ~ 600 prole derivante dall'allevamento di MYCN stabile pesci transgenici con wild-type di pesce sono stati iniettati per gruppo con i costrutti di DNA linearizzate, tra cui d βh: ALK F1174L e dβh: mCherry, dβh: ALKWT e dβh: mCherry, o dβh : mCherry solo, rispettivamente. Espressione Mosaico di mCherry può essere osservato nel 70-90% dei pesci principalmente iniettato. La metà di One-terzo del pesce iniettato sopravvissuto attraverso la fase di larve per la vigilanza del tumore.
6. Sollevare tutto il mCherry + MYCN + e mCherry + MYCN - embrioni secondo i protocolli standard del libro zebrafish ³⁹ e monitorare tumore insorgenza inizio alle cinque settimane postfertilization.

4. Tumore Orologio in Mosaic Transgenic Pesce

1. Monitorare mCherry- positivo pesci principalmente iniettata ogni 2 settimane a partire da 5 settimane postfertilization per l'evidenza di tumore insorgenza.
2. Anestetizzare pesce con tricaine (0,02%) e lo schermo per la presenza di mCherry - e EGFP esprimente tumori nei PSNS sotto la Nikon SMZ-1500 microscopio a fluorescenza stereoscopico dotato di una vista fotocamera digitale DS-U1.
3. Per verificare se i tumori esprimono il transgene ALK, isolare il mCherry- e masse EGFP-positivi per ALK genotipizzazione PCR.
4. Usando PCR, amplificare DNA genomicoestratto da tumori sviluppati con i seguenti primer: ALK P7: 5'-AGG CCA GGT GTC CGG AAT GC-3 'e ALK P18: 5'-TGT CTT CAG GCT GAT GTT GC-3' e la seguente reazione PCR: 1 ciclo di 94 ° C per 5 minuti, 30 cicli di (94 ° C per 30 sec, 55 ° C per 30 sec e 72 ° C per 60 sec). Quindi, la sequenza del prodotto PCR con ALK P7 fondo per confermare ulteriormente l'esistenza di mutante o wild-type ALK nei tumori mCherry-positivi.

Risultati

Per verificare se la sovraespressione di mutationally attivato F1174L ALK o wild-type ALK potrebbe collaborare con MYCN in induzione neuroblastoma, abbiamo sovraespresso o ALK umano attivo o wild-type ALK umana sotto il controllo del promotore d βh nel PSNS di pesci transgenici iperespressione MYCN. Uno dei seguenti costrutti, dβh - ALKF1174L o dβh - ALKWT, sono stati coinjected con dβh - mCherry in u...

Discussione

In questo studio rappresentativo, abbiamo utilizzato coiniezione transitoria e coexpression di ALK attivato con il gene reporter mCherry in MYCN esprimente il pesce transgenico per dimostrare che questi geni cooperano per accelerare notevolmente l'insorgenza di neuroblastoma, in linea con la nostra scoperta precedente composto stabile transgenici coexpressing pesce sia attivato ALK e MYCN ^8. Questo approccio transgenico mosaico possiede diversi vantaggi rispett...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Expand Long Template PCR System	Roche Applied Science, IN	11681834001
pCR-TOPO vector	Invitrogen, CA	451641
T4 DNA ligase	New England Biolabs, MA	M0202M
Gateway LR Clonase II enzyme Mix	Invitrogen, CA	11791-100
Gateway® BP Clonase® II enzyme mix	Invitrogen, CA	11789-020
GC-RICH PCR System	Roche Applied Science, IN	12 140 306 001
Meganuclease I-SceI	New England Biolabs, MA	R0694S
Nikon SMZ-1500 stereoscopic fluorescence microscope	Nikon, NY
Nikon digital sight DS-U1 camera	Nikon, NY