3D organotipica Co-cultura Modello Sostenere midollare timica epiteliale proliferazione, differenziazione e promiscua genica

Riepilogo

Studying medullary thymic epithelial cells in vitro has been largely unsuccessful, as current 2D culture systems do not mimic the in vivo scenario. The 3D culture system described herein - a modified skin organotypic culture model - has proven superior in recapitulating mTEC proliferation, differentiation and maintenance of promiscuous gene expression.

Abstract

Lo sviluppo delle cellule T Intra-timico richiede un reticolo tridimensionale complessa composta da varie cellule stromali, cioè cellule non-T. Timociti attraversano questo patibolo in un ordine temporale e spaziale altamente coordinato, mentre in sequenza passa punti di controllo obbligatori, cioè, l'impegno linea cellulare T, seguita da generazione repertorio recettore delle cellule T e la selezione prima della loro esportazione nella periferia. I due principali tipi di cellule che formano residente questa impalcatura sono cellule epiteliali del timo corticali (CTEC) e midollari (mTECs). Una caratteristica fondamentale di mTECs è la cosiddetta espressione promiscua di numerosi antigeni tissutali limitato. Questi antigeni tissutali con restrizioni vengono presentati immaturi timociti direttamente o indirettamente da mTECs o cellule dendritiche del timo, causando rispettivamente in self-tolleranza.

Adatto in vitro modelli che emulano i percorsi di sviluppo e le funzioni di CTEC e mTECs sono attualmente lacre. Questa mancanza di adeguati modelli sperimentali è per esempio ostacolato l'analisi dell'espressione genica promiscua, che è ancora poco conosciuta a livello cellulare e molecolare. Abbiamo adattato una organotipica modello di co-coltura 3D per la cultura ex vivo mTECs isolati. Questo modello è stato originariamente concepita per coltivare cheratinociti in modo tale da generare un equivalente pelle in vitro. Il modello 3D conservato caratteristiche funzionali chiave di MTEC biologia: (i) la proliferazione e la differenziazione terminale di CD80 ^ecco, Aire-negativo in CD80 ^hi, Aire-positivi mTECs, (ii) la risposta a RANKL, e (iii) espressione sostenuta di FoxN1, Aire e geni tessuto-limitato a CD80 mTECs ^hi.

Introduzione

Timociti sviluppo costituiscono circa il 98% del timo, mentre il restante 2% è costituito da una varietà di cellule che compongono collettivamente stroma timico (cioè, cellule epiteliali, cellule dendritiche, macrofagi, cellule B, fibroblasti, cellule endoteliali). Le cellule epiteliali esterni corticali (CTEC) procurano immigrazione di cellule pro-T dal midollo osseo, induzione linea cellulare T in multipotenti cellule pre-T e selezione positiva di auto-MHC limitati timociti immaturi. Le cellule interne midollari timiche epiteliali (mTECs) sono coinvolti nella induzione della tolleranza di questi timociti con un alta affinità TCR per complessi auto-peptide / MHC da uno inducendo selezione negativa o loro deviazione nella linea cellulare T normativo. Nel contesto di induzione della tolleranza centrale, mTECs sono unici in quanto esprimono un ampio spettro di auto-antigeni tissutali-limitato (Tras) rispecchiando così il sé periferica. Questo fenomeno è chiamato espressione genica promiscua (PGE)^1,2.

La maggior parte degli studi in corso su questo tipo di cellule affascinante si basano su cellule isolate ex vivo, come i vari sistemi di coltura 2D a breve termine invariabilmente portato alla perdita di PGE e molecole regolatore chiave come MHC di classe II, FoxN1 e Aire entro i primi 2 giorni ^3-6 . Rimase tuttavia poco chiaro, che particolari componenti e le caratteristiche del reticolo 3D intatto del timo mancavano in modelli 2D. La riaggregazione coltura dell'organo timica (RTOC) è stato finora l'unico sistema 3D che permette lo studio dello sviluppo delle cellule T, da una parte, e la biologia cellule stromali, d'altra parte, in un microambiente timico intatta ^7. Tuttavia, RTOCs hanno alcune limitazioni, cioè, essi contengono già una miscela complessa di cellule, richiederà il contributo delle cellule stromali fetali e sopportare un periodo di coltura massima di 5 a 10 giorni.

La mancanza di riduzionista nei sistemi di coltura in vitro ha ostacolato lo studio didiversi aspetti di sviluppo delle cellule T e thymic organogenesi non ultima la regolazione molecolare di PGE e il suo rapporto con la biologia dello sviluppo di mTECs.

A causa del primo relazionalità dell'organizzazione strutturata delle cellule epiteliali della pelle e del timo, abbiamo optato per un sistema 3D cultura organotipica (OTC), che era stato sviluppato originariamente per emulare la differenziazione dei cheratinociti in vitro e creare un equivalente cutanea così. Il sistema OTC costituito da una matrice inerte scaffold sovrapposti con fibroblasti dermici che sono intrappolati in un gel di fibrina, su cui cheratinociti vengono seminate ^8,9. Qui, abbiamo sostituito con cheratinociti mTECs purificati. Pur mantenendo le caratteristiche di base di questo modello, abbiamo ottimizzato alcuni parametri.

Nel modello OTC adottato mTECs proliferato, ha subito la differenziazione terminale e mantenuto l'identità MTEC e PGE, quindi mimando in vivo sviluppo mTECs ^{10. Questa nota tecnica fornisce un protocollo dettagliato che permette la graduale messa a punto di OTC timo.}

Protocollo

Questo studio è stato approvato dal comitato etico del Regierungspräsidium Karlsruhe. Tutti gli animali sono stati alloggiati in condizioni esenti da organismi patogeni specifici presso il Cancer Research Center tedesco (DKFZ). Per tutti i cuccioli di esperimenti di coltura del mouse che vanno da 1 a 7 giorni di età sono stati utilizzati.

1. Isolamento di mTECs da Timo

NOTA: Le seguenti operazioni di digestione sono state eseguite come descritto in precedenza ¹ in condizioni sterili con alcune modifiche come segue.

1. Decapitare i cuccioli di topo e rimuovere il timo. Posizionare il thymi su ghiaccio in una piastra di Petri contenenti terreno RPMI 1640 (contenente 5% FCS).
2. Tagliare il thymi in sottili, piccoli pezzi e posto in una provetta a fondo tondo con ~ 5-30 ml RPMI media e mescolate delicatamente con un magnete per 10 minuti a temperatura ambiente.
3. In seguito, decantare il surnatante contenente principalmente timociti e digerire la sequenza tessuto rimanente con un giro di collagenasé di tipo IV (0,2 mg / ml e 57 U / ml concentartion finale) per 15 minuti ciascuno a 37 ° C, seguita da collagenasi / dispasi (0,2 mg / ml e la concentrazione finale 1,2 U / ml) per 25 min a 37 ° ciascun C in un bagno d'acqua con agitazione magnetica fino alla thymi sono completamente digerito. Usare 1 ml enzimatica per 2-3 thymi.
4. Agitare il tessuto volta ogni 7-10 minuti con una pipetta Pasteur. Si riuniscono gli collagenasi / frazioni dispasi e filtrare attraverso una garza di 70 micron.
5. Arricchire i mTECs da cellule magnetico ordinamento (MACS). Eseguire la purificazione di mTECs da cellule magnetico classificare come descritto in precedenza ^11, e mostrato in Figura 1.
   NOTA: Per l'ordinamento magnetico di mTECs abbiamo usato i seguenti anticorpi: anti-CD80-PE (16-10A1, uso a diluizione 1: 100) e anti-EpCAM-bio (G8.8, uso a diluizione 1: 100) ^12. MTECs immaturi e maturi con MACS sono stati definiti come: CD45 ^- EpCAM ⁺ CD80 ^- e CD45 ^- CD80 ⁺ respectively.
6. Dopo MACS purificazione (purezza del mTECs immaturi = 83,1 ± 6,3% e mTECs maturi = 79.23 ± 3,42%), seminare i mTECs sulle colture organotipiche come descritto di seguito (punto 2.3).
7. In alternativa, ordinare mTECs di FACS (utilizzando 100 ugelli micron) dopo CD45 MACS esaurimento utilizzando i seguenti anticorpi: anti-CD45-PerCP (30-F11, l'uso in diluizione 1: 100), anti-Ly51-FITC (6C3, utilizzare a 1 : 100 diluizione), anti-EpCAM-Alexa647 (G8.8, uso in diluizione 1: 500) e l'uso anti-CD80-PE (16-10A1, a diluizione 1: 100). Escludere le cellule morte con ioduro di propidio (1: 5.000) (4 ° giorno). MTECs immaturi e maturi utilizzando FACS sono stati definiti come: PI ^- CD45 ^- Ly51 ^- EpCAM ⁺ CD80 ^- e PI ^- CD45 ^- Ly51 ^- EpCAM ⁺ CD80 ^+, rispettivamente.

2. 3D organotipiche co-culture (OTC)

NOTA: I costrutti 3D-cutanea per la coltivazione organotipica di keratinocytes state preparate come descritto in precedenza ^9,13. In tutte le fasi cellule sono state incubate a 37 ° C e 5% CO _2. I farmaci da banco che utilizzano mTECs sono stati preparati con lievi modifiche nel modo seguente.

1. Preparazione di fibroblasti umani
   NOTA: i fibroblasti dermici umani sono stati ottenuti da colture espianto di de-epidermised derma come descritto in precedenza ^9.
   1. In breve, tagliare le strisce di pelle umana (~ 5 cm di lunghezza) e trattare con termolisina (0,5 mg / ml in soluzione salina con 10 mM Hepes pH 7,4) O / N a 4 ° C.
   2. Successivamente, separare l'epidermide dal derma con pinze.
   3. Tagliare finemente il derma in piccoli pezzi, posto in un piatto 10 centimetri Petri e lasciare asciugare per 1-2 ore sotto un flusso d'aria sterile. Supplemento espianti regolarmente con DMEM contenente 20% FBS.
   4. Dividere i fibroblasti crescita fuori quando confluenti (di solito circa 3 settimane) con 0,1% tripsina fare in modo che gli espianti continuano ad aderire alla piastra per ulteriori conturni consecutivi di conseguenza.
   5. Espandere i fibroblasti dalle stesse espianti per un massimo di 3 volte in DMEM con 10% FBS e crio-conservare le ^14. Utilizzare lo stesso lotto di fibroblasti per ogni serie sperimentale.
      NOTA: I fibroblasti non sono stati irradiati per il set-up degli equivalenti dermici.
2. Preparazione del impalcatura
   1. Tagliare i 0,4-0,6 mm viscosa spessore, materiale fibroso non tessuto (dati del prodotto a sostegno foglio Excel) in ambienti ben delimitate con un netto 11 millimetri di diametro puncher metallo per adattarsi esattamente in 12 inserti bene col filtro. Poi inserirla nel pozzo 12 inserto del filtro (poliestere membrana capillare pori, 3 micron dimensione dei pori) da impalcatura. Posizionare la configurazione filtro completo in un 12-pozzetti sterili.
   2. Preparare il gel di fibrina utilizzando una colla di fibrina-kit per la chirurgia costituito da una combinazione di fibrinogeno e trombina. Pre-diluire il fibrinogeno e la trombina-componente del kit a 8 mg / ml e 10Unità / ml, rispettivamente. Per un singolo pozzetto di una piastra 12 pozzetti procedere come segue.
      1. Diluire 100 microlitri fibrinogeno (8 mg / ml) con 100 ml di tampone fosfato salino (PBS) senza Ca ₂ ⁺ e Mg ₂ ^+, pH 7,0. Diluire 100 ml di trombina (10 unità / ml) con 100 microlitri FCS contenenti 270.000 fibroblasti.
      2. Dispensare 200 microlitri della trombina contenente fibroblasti cellule preconfezionato sul ponteggio, a cui si aggiungono 200 pl fibrinogeno (miscela 1: 1), ottenendo una concentrazione finale di fibrinogeno di 2 mg / ml e di trombina di 2,5 unità / ml. Mescolare bene e distribuire in modo uniforme su tutta l'area del ponteggio pipettando dolce (giorno 1).
         NOTA: Dopo 30 minuti a 37 ° C un coagulo che racchiude i fibroblasti sarà formata, riempiendo completamente gli spazi interni del ponteggio e formando una superficie superiore liscia.
3. Co-coltura con mTECs
   1. Per la pre-cultura, immergere le colture d'organo aDMEM con 10% FBS, 50 mg / ml di acido L-ascorbico e 1 ng / ml di TGF-β1 con una variazione media ogni altro giorno per 4-5 giorni.
   2. Il giorno della MTEC semina, sostituire il mezzo attraverso RFAD media (1: 1 DMEM + DMEM / F12) con 10% FBS, 10 ^-10 M tossina colerica, 0,4 mg / ml idrocortisone, 50 mg / ml di acido L-ascorbico, RANK ligando (0,1 mcg / ml) e 500 unità / ml di aprotinina, impedendo così fibrinolisi precoce da serina proteasi secrete da fibroblasti.
   3. 7-8 ore più tardi, set-up co-culture seminando 250.000 mTECs (sia mTECs completi, o CD80 e CD80 ^lo sottoinsiemi ^hi), in un volume di 100 ml per pozzetto in cima al ponteggio fibroblasti. Contare le cellule utilizzando una camera di Neubauer (4 ° giorno).
      NOTA: In ogni momento le timo colture organotipiche 3D sono sommerse dai media a differenza OTC della pelle, che sono dotate di aria sollevato.
   4. Dopo 24 ore di incubazione, di fornire le culture con medio (totale medio di cambio), come detto sopra (punto 2.3.2) ora containing ridotta quantità di Aprotinina, 250 unità / ml (Giorno 5).
   5. Per valutare l'attività proliferativa delle mTECs, aggiungere EdU (6,7 mM / ml, cioè, 10 mM / pozzetto) per OTCs per 4 ore prima della cessazione delle culture. Eseguire la colorazione di OTC crio-sezioni come descritto nel Kit EdU Imaging combinata con la co-colorazione di cheratina 14. Determinare gli indici proliferative mTECs, da una delle contando cellule K14 ⁺ EdU ⁺ in due sezioni di ogni esemplare la cultura o di flusso citometria (EdU citometria a flusso, Sezione 1.7 ma invece di Ly51-FITC utilizzano CDR1-PB ¹⁵ ad una diluizione 1: 100 e 2.3.6.4).
   6. Dopo 4-7 giorni di co-coltura, terminare i farmaci da banco e il processo per l'isolamento di RNA, crio-sezionamento o FACS analisi (giorno 8-11).
      1. Terminate le culture utilizzando una pinza, separando l'equivalente scaffold / cutanea dal filtro dell'inserto bene.
      2. Per crio-sezionamento, incorporare l'intero OTC in OCT e congelare in liquid vapori di azoto prima crio-sezionamento. Preparare 5-7 micron di spessore sezioni OTC utilizzando un criostato e conservare a -20 ° C fino al momento dell'uso. Per immunoistochimica di OTC crio-sezione usare anti-cheratina 14 (AF64, uso a 1: 1.000 diluizione), e anti-vimentina (GP53, uso a 1: 100 diluizione) anticorpi. Eseguire la colorazione immunoistochimica indiretta utilizzando i rispettivi anticorpi secondari.
      3. Per l'isolamento di RNA, aggiungere 1 ml di denaturazione soluzione (contenente fenolo e guanidina tiocianato) in un tappo a vite di un tubo libero 2 ml RNasi. Tagliare l'intera OTC in pezzi con un bisturi e aggiungere nella provetta contenente soluzione denaturazione. Meccanicamente sminuzzare i OTCs con strumento FastPrep due volte per 30 secondi a una velocità di 6,0, inserire tra il ghiaccio per 2 min (il campione può essere conservato a -80 ° C dopo questo punto). Se congelato a -80 ° C, scongelare su ghiaccio. Centrifugare le provette a 11,500-13,000 rpm per 10 minuti a 4 ° C. Trasferire il surnatante in una nuova provetta, incubare per 5 minuti a temperatura ambiente e fprotocolli di isolamento RNA susseguirsi utilizzando guanidinio estrazione tiocianato-fenolo-cloroformio acido come descritto dal produttore.
      4. Per l'analisi FACS, rimuovere l'impalcatura e separare la membrana della fibrina / fibroblasti / gel MTEC. Finemente tagliare il gel con un bisturi e digerire in un tubo FACS per ~ 20 minuti o fino a quando completamente digerito con 2 ml di collagenasi / dispasi a 37 ° C in un bagno d'acqua con agitazione magnetica. Agitare la soluzione enzimatica con una pipetta Pasteur volta ogni 5 min. Dopo completa digestione, filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro 70 micron; macchiare la sospensione singola cella utilizzando gli anticorpi come descritto in 1.7 e analizzare mediante citometria a flusso.

Risultati

Abbiamo adottato un organotipica co-coltura modello 3D (3D OTC) che era stato originariamente sviluppato per la cultura a lungo termine in vitro dei cheratinociti ^9. MTECs MACS-arricchiti (vedi MACS arricchimento schema Figura 1) sono state seminate su un ponteggio composto da un gel di fibrina e fibroblasti intrappolati. I fibroblasti forniscono la matrice extracellulare essenziale (ECM) sostegno mTECs in vitro. MTECs sono state coltivate in OTC per 4-14 giorni, in presenza...

Discussione

Accanto RTOCs, l'OTC 3D sono stati di gran lunga superiore in termini di differenziazione TEC e PGE manutenzione / induzione (Tabella 1) rispetto ad altri (i) 'culture 3D semplificati' utilizzando - fibroblasti da solo senza il patibolo; (Ii) i sistemi 2D utilizzando - cellule fibroblasti / alimentatore co-coltura con TEC ^10, (iii) le cellule 3T3-J2 cui cloni TEC sviluppano, ma PGE è perso, (iv) matrigel o (v) componenti ECM (dati non pubblicati). PGE è stato mantenuto fino a 7 ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pregnant C57BL/6 mice	Charles River WIGA
LS columns	Miltenyi Biotec	130-042-401
MS columns	Miltenyi Biotec	130-042-201
CD45 Microbeads, mouse	Miltenyi Biotec	130-052-301
Anti-PE Microbeads	Miltenyi Biotec	130-048-801
Streptavidin Microbeads	Miltenyi Biotec	130-048-101
EpCAM (G8.8 -Alexa 647 and -biotin)	Ref. 12
CD80-PE antibody	BD Pharmingen	553769
CD45-PerCP antibody	BD Pharmingen	557235
Ly51-FITC antibody	BD Pharmingen	553160
CDR1-Pacific Blue	Ref. 15
Keratin 14 antibody	Covance	PRB-155P
Vimentin antibody	Progen	GP58
Cy3-conjugated AffiniPure Goat anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	111-165-003
Alexa 488-conjugated AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	106-546-003
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate	Molecular Probes (Invitrogen GmbH)	A-11008
Click-iT EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit	Invitrogen	C10339
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Flow Cytometry Assay Kit	Invitrogen	C10425
12-well filter inserts (thincerts)	Greiner bio-one	657631
12-well plate	Greiner	665180-01
Jettex 2005/45	ORSA, Giorla Minore, Italy
Fibrinogen TISSUECOL-Kit Immuno	Baxter
Thrombin TISSUECOL-Kit Immuno	Baxter
PBS	Serva	47302.03
DMEM	Lonza	BE12-604F
DMEM/F12	Lonza	BE12-719F
HEPES	Gibco	15630-049
FBS Gold	GE Healthcare	A11-151
Aprotinin (Trasylol)	Bayer	4032037
Cholera toxin	Biomol	G117
Hydrocortisone	Seromed (Biochrom)	K3520
L-ascorbic acid	Sigma	A4034
TGF-ß1	Invitrogen	PHG9214
RANKL	R&D systems	462-TR-010
Thermolysin	Sigma Aldrich	T-7902
OCT Compound	TissueTek	4583
Trizol (aka. Denaturing solution - Acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction)	Invitrogen	10296028
FastPrep FP120	Thermo Scientific
Collagenase Type IV	CellSystems	LS004189	0.2 mg/ml and 57U/ml final conc.
Neutrale Protease (Dispase)	CellSystems	LS002104	0.2 mg/ml and 1.2U/ml final conc.
DNase I	Roche	11 284 932 001	25 µg/ml final conc.