Sviluppo di un Quantitative ricombinasi Polymerase Amplificazione Assay con un controllo positivo interno

Riepilogo

Provided is a protocol for developing a real-time recombinase polymerase amplification assay to quantify initial concentration of DNA samples using either a thermal cycler or a microscope and stage heater. Also described is the development of an internal positive control. Scripts are provided for processing raw real-time fluorescence data.

Abstract

It was recently demonstrated that recombinase polymerase amplification (RPA), an isothermal amplification platform for pathogen detection, may be used to quantify DNA sample concentration using a standard curve. In this manuscript, a detailed protocol for developing and implementing a real-time quantitative recombinase polymerase amplification assay (qRPA assay) is provided. Using HIV-1 DNA quantification as an example, the assembly of real-time RPA reactions, the design of an internal positive control (IPC) sequence, and co-amplification of the IPC and target of interest are all described. Instructions and data processing scripts for the construction of a standard curve using data from multiple experiments are provided, which may be used to predict the concentration of unknown samples or assess the performance of the assay. Finally, an alternative method for collecting real-time fluorescence data with a microscope and a stage heater as a step towards developing a point-of-care qRPA assay is described. The protocol and scripts provided may be used for the development of a qRPA assay for any DNA target of interest.

Introduzione

Quantitative amplificazione degli acidi nucleici è una tecnica importante per il rilevamento di ambientale, di origine alimentare, e gli agenti patogeni di origine idrica, nonché per la diagnostica clinica. Real time PCR quantitativa (qPCR) è il metodo gold standard per il rilevamento sensibile, specifico e quantitativa degli acidi nucleici, ad esempio, per l'HIV-1 test di carica virale, il rilevamento di batteri patogeni, e lo screening per molti altri organismi ^{1 - 3.} Durante tempo reale qPCR, primer amplificano patogeno DNA in cicli, e un segnale fluorescente viene generato che è proporzionale alla quantità di DNA amplificato nel campione ad ogni ciclo. Un campione contenente una concentrazione sconosciuta di DNA patogeno può essere quantificato utilizzando una curva standard che riguarda la concentrazione di DNA iniziale di campioni standard e il momento in cui il segnale fluorescente raggiunge una certa soglia (cioè, la soglia ciclo o C _T).

Perché in tempo reale qPCR richiede costose attrezzature cicli termici e diverse ore per ricevere i risultati, tecniche di amplificazione isotermica alternativi, come recombinase polimerasi amplificazione (RPA), sono stati sviluppati ^4. Queste piattaforme genere forniscono risultati più rapidi e amplificare acidi nucleici a singolo temperatura inferiore, che può essere realizzato con meno costoso, attrezzature semplici. RPA, che è particolarmente interessante per applicazioni point-of-care, amplifica il DNA in minuti, richiede una temperatura bassa di amplificazione (37 ° C), e rimane attiva in presenza di impurità ^5,6. Saggi RPA sono stati sviluppati per una vasta gamma di applicazioni, tra cui l'analisi degli alimenti, degli agenti patogeni, lo screening di farmaci antitumorali, e la rilevazione di agenti biothreat ^7-12. Tuttavia, l'uso di RPA per la quantificazione degli acidi nucleici è stata limitata ^13,14.

In lavori precedenti, è stato shown che in tempo reale RPA quantitativa (qRPA) è fattibile ^15. Qui, un protocollo più dettagliata per l'utilizzo in tempo reale quantitativa RPA quantificare campioni sconosciuti utilizzando una curva standard, un metodo che è analogo a quantificazione utilizzando qPCR. Questo protocollo descrive come eseguire una reazione RPA su un termociclatore per rilevare HIV-1 DNA come un proof-of-concept, e come sviluppare un controllo positivo interno (IPC) per garantire che il sistema funzioni correttamente. La raccolta dei dati utilizzando un termociclatore o microscopio e analisi dei dati per la costruzione di una curva standard utilizzando i dati di formazione è anche dettagliato. Infine, il metodo per quantificare i campioni sconosciuti utilizzando la curva standard con uno script personalizzato è dimostrata. Questa tecnica consente qRPA quantificazione dei campioni con concentrazioni sconosciute e ha molti vantaggi rispetto tradizionale in tempo reale qPCR.

Protocollo

1. Programmare l'apparecchio per PCR in tempo reale Reazioni qRPA

1. Creare un nuovo protocollo nel software termociclatore.
   1. Inserire una fase di pre-incubazione: 39 ° C per 1 min.
   2. Aggiungere una seconda fase: 39 ° C per 20 sec seguita da una lettura piatto.
   3. Infine, inserire un "go" che ripete il secondo passo 59 volte.
   4. Salvare il protocollo.
2. Creare una nuova piastra nella scheda "Editor piatto" del software. Selezionare pozzetti sulla piastra corrispondenti alle posizioni delle reazioni RPA (qui, l'uso di pozzi A1, A4-A8, B1 e B4-B8).
   NOTA: Non è importante se il tipo di campionamento dei pozzi (ad esempio, "Standard", "NTC") è specificato, come l'analisi dei dati viene effettuata utilizzando uno script personalizzato.
   1. Per gli esperimenti che contengono solo HIV-1 DNA, selezionare il fluoroforo "HEX" per tutti i pozzetti. Per gli esperimenti contenenti HIV-1 DNA ed un co interna positivantrol, selezionare sia "HEX" e fluorofori "FAM" per tutti i pozzetti. Salvare la piastra.

2. Preparare per gli esperimenti di HIV-1 qRPA

1. Montare reazioni RPA in uno spazio di lavoro di pre-amplificazione designato contenenti pipette designati, puntali, vortex, e mini-centrifuga, come per qPCR. Come RPA può amplificare una singola copia di DNA di ben dieci ordini di grandezza (dati non mostrati), gestire e smaltire provette contenenti prodotti DNA pubblicare amplificato in una zona post-amplificazione designato.
   1. Evitare il contatto tra tutti i reagenti pre-amplificazione e prodotti post-amplificazione. Spray aree di lavoro e le attrezzature con 50% di candeggina pre-amplificazione prima e dopo tutti gli esperimenti. Usare un tovagliolo di carta per asciugare l'eccesso di candeggina.
2. Acquisto sequenza primer forward 5'-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA AAG GAA G-3 'e invertire la sequenza di primer 5'-CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G-3 'da sintetizzatori DNA commerciali. Acquista la sequenza della sonda 5'TGC TAT TAT GTC TAC TAT TCT TTC CCC [SIMA / HEX] GC [THF] C [DT-BHQ1] GTA CCC CCC AAT CCC C -3 'da fonti commerciali. Conservare tutti primer e sonde a 4 ° C in aliquote a una concentrazione di 10 mM prima dell'uso.
   NOTA: Il test qRPA amplifica un unico HIV-1 sequenza. Per questo test proof-of-concept, utilizzare il plasmide pHIV-IRES-eYFPΔEnvΔVifΔVpr descritto da Sutton et al., Che contiene la sequenza bersaglio ^16. Per gli esperimenti qRPA, il plasmide è stato conservato a 4 ° C in aliquote contenenti 1, 10, 10 ^2, 10 ³ e 10 ⁴ copie per microlitri in un tampone contenente Tris 10 mM, EDTA 0,1 mM a pH 8,0 e 1 ng / microlitri DNA umano genomico carrier (360.486). Questa concentrazione vettore DNA è equivalente alla concentrazione DNA ottenuto dal kit di estrazione di DNA siero commerciali utilizzati per HIV-1 di diagnosi ^17. Questi HIV-1diluizioni sono stati utilizzati come modelli nelle reazioni qRPA per costruire una curva standard.

3. Montare un HIV-1 qRPA Curva Standard

1. Prima di montare le reazioni qRPA, preparare l'area di lavoro di pre-amplificazione come descritto al punto 2.1.1. Posizionare un blocco a 96 pozzetti freddo in conservazione a 4 ° C.
2. Preparare i reagenti per 12 reazioni:
   1. Spostare il magnesio acetato, il buffer di reidratazione, e 12 CPT pellets di reazione al lavoro pre-amplificazione.
   2. Scongelare l'acetato di magnesio e il buffer reidratazione a temperatura ambiente.
   3. Aliquota 32,5 ml di acetato di magnesio (2,5 microlitri per reazione) in una provetta.
   4. Preparare una miscela 13x master. Aggiungere 383,5 ml di buffer di reidratazione (29,5 ml per reazione) in una provetta separata per il master mix. Aggiungere 41,6 ml di acqua priva di nucleasi (3,2 microlitri per reazione) per il master mix. Agitare il master mix.
   5. Restituire il aceta magnesiote e reidratazione buffer per la conservazione a -20 ° C.
   6. Spostare i primer e sonda aliquote dal frigorifero alla zona di pre-amplificazione, evitando l'esposizione alla luce per ridurre al minimo photobleaching.
   7. Aggiungere 27,3 ml ciascuno dei 10 micron in avanti e indietro primer (2,1 microlitri per fondo per reazione) al master mix.
   8. Aggiungere 7,8 ml di HIV-1 sonda di DNA HEX-marcato 10 micron (0,6 microlitri per reazione) per il master mix.
   9. Ritorno primer e sonda di stoccaggio.
3. Adattamento del layout di piastra descritto nella Sezione 1.2, posizionare 1 enzima pellet in ognuna delle provette estrema sinistra e 1 enzima pellet in ognuna delle 5 tubi di estrema destra di 2 a vita bassa e 8-strips tubo PCR.
4. Aggiungere con cautela 37,5 ml di master mix per ogni provetta contenente un pellet enzima, utilizzando un nuovo puntale per ogni tubo e mescolando delicatamente la master mix e pellet con la punta fino a quando il pellet sia completamente dissolto. Mescolare delicatamente per evitare Formati bollaon, e rimuovere accuratamente la punta per prevenire qualsiasi perdita di volume di reazione.
5. Dopo che tutti i pellet enzimi sono stati reidratati con il master mix, recuperare il blocco a 96 pozzetti a freddo dal 4 ° C di stoccaggio. Mettere le strisce tubo PCR nel blocco freddo per raffreddare il master mix.
6. Mentre il master mix sta raffreddando, caricare il software termociclatore con il protocollo e la piastra descritto nella Sezione 1.
7. Tagliare 2 strisce di adesivo trasparente micro-sigillo di plastica per essere leggermente più larga delle provette PCR, e recuperare 2 TV PCR coperchi striscia tubo.
8. Recupera 6 aliquote modello da stoccaggio (contenenti 0, 1, 10 ^1, 10 ^2, 10 ^{3, 4} o 10 copie del virus HIV-1 plasmide per microlitro).
9. Aggiungere 10 ml di ogni modello per i tubi designate a tale concentrazione modello. Utilizzare un nuovo puntale per ogni tubo, mescolando delicatamente la soluzione con la punta per mescolare il master mix e il modello. Assicurarsi di aggiungere il modello nella posizione corretta per mATCH il layout di piastra descritto nella Sezione 1.2.
10. Assicurarsi che una scheda striscia tubo PCR per la microcentrifuga è a posto.
11. Dispensare 2,5 ml di acetato di magnesio in ogni coperchio tubo che sarà posto su un tubo contenente una reazione qRPA.
12. Posizionare delicatamente i coperchi sopra dei tubi PCR tale che essi non sono completamente sigillate e possono essere rimossi. Il magnesio acetato aderirà alla coperchi ed essere ben visibile dall'alto.
13. Inserire ogni striscia tubo PCR con coperchi in ogni lato del supporto tubo PCR. Chiudere il coperchio del minicentrifuga per ruotare il magnesio acetato di coperchi e nella reazione RPA, iniziare la reazione RPA. Centrifugare finché tutte le bolle vengono eliminati e tutto il liquido viene raccolto sul fondo di ciascun tubo (10 sec).
14. Rimuovere rapidamente le strisce tubo PCR e restituirli al blocco freddo di fermare le reazioni qRPA.
15. Rimuovere con cautela i coperchi per evitare la formazione di aerosol e sigillare ogni striscia provetta PCR con il tagliopezzi di pellicola trasparente micro-seal.
16. Camminare velocemente al termociclatore e caricare le due strisce tubo PCR nel termociclatore nelle posizioni corrispondenti al layout di piastra (pozzetti A1-B8). Chiudere il coperchio del termociclatore, fare clic su "Start Esegui" e designa un nome di file per l'esperimento.
    NOTA: Sebbene il produttore raccomanda agitazione campione dopo 5 minuti di incubazione, questo passo non è necessario per questa particolare dosaggio e può essere omesso.
17. Dopo la corsa è stata completata, selezionare "Impostazioni", "Baseline Impostazione", "No Baseline Sottrazione" per visualizzare i dati grezzi di fluorescenza. Esportare i dati in un foglio di calcolo selezionando "Export", "Esporta tutte le schede tecniche di Excel." Un file con l'addendum "Risultati Quantificazione amplificazione verrà creata" contenente i dati grezzi di fluorescenza in tempo reale.

4. Sviluppare un controllo positivo interno

1. Selezionare una sequenza di DNA da una specie che è improbabile che si trovano nel campione di destinazione. La sequenza deve essere più lungo del amplicone bersaglio in modo che la generazione della sequenza bersaglio è favorita.
   NOTA: Per questa analisi, Cryptosporidium parvum, un parassita intestinale, è stato scelto per servire come modello per la generazione della sequenza di IPC, perché questo organismo è improbabile che si trovano nel sangue ed era disponibile in laboratorio da un altro progetto. Per generare la sequenza di IPC, estrarre e purificare il DNA da C. oocisti parvum come descritto altrove ^18.
2. Acquista il forward (5'-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA AAG GAA G / ATC TAA GGA AGG CAG CAG GC-3 ') e indietro (5'-CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G / TGC TGG AGT ATT CAA GGC ATA -3 ') primer da fonti commerciali. I primer PCR IPC utilizzati in questo test sono illustrati nella Figura 1 e contengono una regione che è gratuita per il modello IPC DNA (ad esempio, C. parvum, viola nella figura 1) ed una regione che è gratuita per l'organismo bersaglio (ad esempio, HIV-1, blu nella Figura 1).
3. Eseguire PCR utilizzando i primer e IPC DNA stampo.
   1. Montare 50 reazioni microlitri PCR utilizzando i reagenti del kit Phusion alta fedeltà DNA Polymerase secondo le istruzioni del produttore, escludendo la polimerasi. Utilizzare 2 ml di DNA stampo e Phusion Buffer HF.
   2. Aggiungere la polimerasi Phusion per ciascuna reazione dopo un avviamento a caldo a 98 ° C, seguita da 60 sec a 98 ° C, seguiti da 40 cicli di 15 secondi a 98 ° C, 30 sec a 62 ° C e 30 secondi a 72 ° C con una estensione finale a 72 ° C per 5 min. Dopo cicli termici, tenere i campioni a 4 ° C.
   3. Analizzare campioni di gel elettroforesi su un gel di TAE agarosio 2%, e poi estrarre e purificare DNA usando il QIAquick Gel Extraction Kit secondo il protocollo microcentrifuga inclusail kit.
4. Schermo candidati IPC per la loro capacità di amplificare con qRPA.
   1. Preparare reazioni qRPA come descritto nella Sezione 3, con HIV-1 primer, una sonda FAM marcata specifici della IPC (5'-AGG TAG TGA CAA GAA ATA ACA ATA CAG GAC [FAM] T [THF] T [DT-BHQ1 ] GGT TTT GTA ATT GGA A -3 '), e un totale di 0, 10, 10 ^2, 10 ^3, 10 ^4, o 10 ⁵ copie di ciascun candidato IPC per reazione, prova tutte le concentrazioni in duplice copia.
   2. Scegliere il candidato IPC che amplifica più costantemente e ha il limite di rilevamento più basso.
5. Co-amplificare HIV-1 e il IPC per determinare la concentrazione ottimale di DNA IPC.
   1. Simile alla Sezione 3, unire il seguente in ogni reazione 50 microlitri: 29,5 ml di tampone di reidratazione, 2,1 ml di RPA di primer forward [10 micron], 2.1 ml di RPA invertire fondo [10] micron, 0,6 ml di HIV-1 HEX Sonda -labeled [10 micron], 10 mldi HIV-1 DNA a concentrazioni variabili, 2,5 ml di acetato di magnesio e 1 enzima pellet. Invece di aggiungere 3,2 ml di acqua priva di nucleasi come è stato fatto nella fase 3.2.4, aggiungere 0,6 ml di sonda IPC FAM marcata [10 micron], e 2,6 ml di DNA IPC. Utilizzare la concentrazione IPC che è il limite di rilevazione-di-(LOD) quando qRPA viene eseguita con DNA IPC sola (LOD definita come la concentrazione minima cui la quantità di generazione del segnale di fluorescenza è maggiore di quello generato dalla fluorescenza generata dai campioni con no DNA bersaglio).
   2. Incubare i campioni utilizzando il protocollo descritto nella Sezione 1.1.
   3. Se l'IPC non amplifica in ogni campione, considerare ripetendo l'esperimento IPC concentrazione di un ordine di grandezza superiore. La concentrazione ottimale di DNA IPC per l'HIV-1 dosaggio è 10.000 copie / ml. Mentre i campioni sono considerate valide se si è o IPC o HIV-1 di amplificazione del DNA, idealmente la IPC presenta di amplificazione rilevabile perogni reazione.

5. Costruire una curva standard da più esperimenti

1. Assicurarsi che i dati di ogni esperimento è stato esportato in un programma di foglio di calcolo come descritto nella Sezione 3.13.
2. Aprire ed eseguire lo script "JoVE_qRPA_standard_curve.m". Tutti gli ingressi sono richiesto automaticamente nella finestra di comando. Dopo aver avviato lo script, all'utente viene richiesto automaticamente a designare la "Numero di file di dati" utilizzati per costruire la curva standard.
3. Nella finestra di comando, digitare il numero di file da utilizzare per costruire la curva standard e premere invio.
4. Digitare nella finestra di comando il numero di campioni e il numero di repliche per ogni file di allenamento (premendo INVIO dopo ciascuna voce).
   NOTA: Nel layout piatto descritto nella Sezione 1.2, ci sono stati 6 campioni con diverse concentrazioni e 2 repliche di ogni campione).
5. Digitare nella finestra di comando il più basso DNUna concentrazione utilizzata per costruire la curva standard (in log10 copie) e premere invio (per il layout di piastra descritto nella Sezione 1.2, la concentrazione più bassa template è '1' log10 copie).
6. Digitare nella finestra di comando la differenza di concentrazione tra ogni standard (in log10 copie), quindi premere invio (per il layout di piastra descritto nella Sezione 1.2, l'intervallo di concentrazione è '1' log10 copie).
7. Dopo essere stato richiesto, digitare la "soglia Slope" nella finestra di comando e premere invio.
8. Nella finestra di comando, digitare il "Number (z) deviazioni standard sopra lo sfondo per la soglia positiva", quindi premere invio. Valori tipici per la gamma z da 1 a 5.
9. Specificare se i dati sono stati raccolti utilizzando il termociclatore ('1'), * .tiff immagini al microscopio ('2'), o * .jpg immagini al microscopio ('3') digitando il numero '1', '2,' o '3,' e pressing entrare.
10. Scegliere di impostare una nuova soglia IPC o per utilizzare un valore predefinito per la soglia digitando 'y' o 'n', rispettivamente, quando richiesto.
11. Quindi, selezionare tutti i file di foglio di calcolo utilizzati per costruire la curva standard.
    NOTA: Lo script quindi importare automaticamente i dati HEX e FAM fluorescenza; determinare se ogni reazione era valido (cioè, se i segnali di fluorescenza superato le soglie per la HEX o canali FAM); determinare il coefficiente r ² per un esponenziale, lineare e secondo ordine polinomiale; trama "log10 copie rispetto alla soglia del ciclo" per ogni campione usato per costruire la curva standard; e creare un foglio di calcolo contenente variabili essenziali per ricostruire la curva standard per gli esperimenti di convalida senza richiedere all'utente di immettere nuovamente tutti i parametri di input di nuovo.

6. Assay Validazione e quantificazione dei campioni sconosciuti Utilizzola curva standard

1. Utilizzare lo script "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m" per stimare la precisione e l'accuratezza del test utilizzando campioni con concentrazioni note o usarlo per quantificare i campioni con concentrazioni sconosciute.
   NOTA: Perché la ricerca precedentemente pubblicato ha dimostrato che una misura esponenziale ha prodotto il miglior coefficiente R-squared ^18, questo script utilizza un fit esponenziale per la curva standard. Se si desidera un diverso tipo di forma, lo script può essere modificata di conseguenza.
   1. Aprire ed eseguire lo script "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m". Dopo aver avviato lo script, all'utente viene richiesto per entrare in tutti gli ingressi nella finestra di comando.
   2. Inserire '1' per convalidare un test usando una curva standard con concentrazioni del campione conosciuti o digitare '2' per quantificare i campioni sconosciuti.
   3. Quando richiesto, selezionare un curva standard salvato o costruirne uno nuovo inserendo the le informazioni che viene sollecitato automaticamente nella finestra di comando (le stesse informazioni che è necessario per lo script "JoVE_qRPA_standard_curve.m" dalla Sezione 5).
   4. Digitare il numero di esperimenti (ad esempio, fogli elettronici) per analizzare per la convalida / quantificazione.

7. Preparazione per la raccolta dati utilizzando un microscopio a fluorescenza e un chip riscaldata

1. Assicurarsi che il microscopio a fluorescenza ha un riscaldatore palcoscenico e regolatore di temperatura 1-Channel di precisione ad alta stabilità in luogo.
2. Assicurarsi che il microscopio a fluorescenza è un cubo di filtro per eccitare la fluorescenza e raccogliere da ogni fluoroforo. Excite e raccogliere la fluorescenza FAM generato durante l'amplificazione del DNA IPC attraverso un filtro GFP (eccitazione BP 470/40 nm, emissione BP 520/50 nm). Excite e raccogliere la fluorescenza HEX generato durante HIV-1 amplificazione del DNA attraverso un filtro HEX (eccitazione BP 530/30 nm, emissione BP 575/40 nm).
3. Utilizzare il software di editing di script microscopio per creare un algoritmo automatico di replicare di raccolta dati sul termociclatore.
   1. Prima inserire una "Impostazioni" passo per chiudere l'otturatore. Successivamente aggiungere un "Exposure" passo per impostare l'esposizione a 60 sec. Inserire una "Snap" per eseguire il ritardo di 60 secondi, che implementa il 1 min periodo di pre-incubazione. Aggiungi un "Setting" passo per cambiare il gruppo di lavoro per il filtro GFP. Inserire un'altra "Exposure" passo per regolare l'esposizione a 200 msec. Tutte le esposizioni con la GFP oi cubetti di filtro HEX verranno impostate a 200 msec.
   2. Dopo la fase di "Exposure", aggiungere un "Snap" e specificare la macchina fotografica con la quale sarà presa l'immagine. Utilizzare un altro passo "Setting" per chiudere l'otturatore e un passo "Salva Immagine" per salvare l'immagine in una cartella temporanea definita dall'utente.
   3. Avanti interruttore al cubo filtro HEX usando un altro "Impostazioni" step e then aggiungere una "esposizione" a 200 msec, un "Snap" e "Salva immagine" step.
   4. Ripetere questo processo 59 volte con un ritardo iniziale di 20 secondi invece di 60 (vicino dell'otturatore, attendere 20 secondi, l'interruttore di filtro GFP cubo, l'esposizione impostato a 200 msec, scatto, scatto vicino, salvare, passare a filtrare HEX cubo, esposizione impostata a 200 msec, scatto).
4. Creare un chip che conterrà le reazioni qRPA.
   1. Per esperimenti utilizzando il microscopio, utilizzare il file JoVE_qRPA_base.ai per tagliare una base rettangolare 40 x 15 mm da una lastra di 1/8 "acrilico nero di spessore con un cutter laser impostato a 100% di potenza, velocità 10%.
   2. Utilizzare il file JoVE_qRPA_well.ai tagliare pozzetto di reazione costituito da un quadrato di 10 x 10 mm con un diametro di 5 mm foro circolare tagliato da un foglio di 1,5 mm di spessore acrilico trasparente.
   3. Collegare fino a tre pozzi a una singola base con gel supercolla.
   4. Durante la notte a secco.

8. Data Collection e Analysis Utilizzando un microscopio a fluorescenza

1. Preparare il microscopio per la raccolta dati caricando script automatico di raccolta dati JoVE_AxioVision_Script.ziscript.
   1. Impostare il riscaldatore fase a 48 ° C e preriscaldare il chip di reazione sul riscaldatore palco per circa 20 min. Un'impostazione temperatura di 48 ° C mantiene una temperatura di 39 ° C nel pozzetto di reazione (dati non mostrati).
   2. Utilizzando un obiettivo 10X, 0,45 NA, concentrarsi sulla parte superiore del bordo interno del pozzetto di reazione con il filtro in posizione GFP. I bordi di acrilico sono autofluorescenti dopo il taglio laser e possono essere facilmente visualizzati. Dopo la messa a fuoco, non regolare l'altezza del palco microscopio fino a quando tutti i dati sono raccolti.
2. Montare il master mix qRPA in uno spazio di lavoro di pre-amplificazione designato come descritto al punto 4.5.1. Per ogni campione, mescolare un pellet enzima, master mix, e HIV-1 DNA stampo in una provetta. Aggiungere 2,5 ml di acetato di magnesio al primo reaction e brevemente vortex.
3. Trasportare rapidamente la provetta contenente il campione qRPA al microscopio a fluorescenza.
   1. Pipettare attentamente 30 microlitri della reazione RPA nel pozzetto di reazione senza creare bolle. Mettere una goccia di olio minerale PCR-grade sulla reazione RPA per evitare l'evaporazione.
   2. Posizionare il pozzo direttamente sotto l'obiettivo microscopio, avendo cura di immagine solo il centro del pozzo, alcun dei bordi acrilici auto-fluorescente. Dopo che il pozzo è posizionato, eseguire lo script automatizzato 7. Lo script genera un'immagine JPEG utilizzando un'immagine JPEG utilizzando il cubo filtro HEX ogni 20 sec filtro cubo FAM e.
4. Dopo che lo script è completato, trasferire queste immagini dalla cartella di archiviazione temporanea prima di eseguire altri campioni.
   1. Crea 2 cartelle: 1 per ciascun fluoroforo (cioè, 'HEX' e 'FAM'). Conservare entrambe le cartelle nella stessa cartella principale. In ogni fluoroforocartella, crea una cartella corrispondente al numero di copie di DNA presenti nel campione (ad esempio, 0, 10, ecc).
   2. Trasferire tutti i file con il prefisso 'HEX' nella corrispondente sottocartella nella cartella 'HEX'. Trasferire tutti i file con il prefisso 'GFP' nella corrispondente sottocartella nella cartella 'FAM'.
5. Ripetere Sezioni 8.2-8.4 per reazioni qRPA con 0, 10, 10 ^2, 10 ^3, 10 ^4, 10 ⁵ e HIV-1 esemplari DNA.
6. Dopo aver raccolto i dati di tutti i campioni qRPA in un esperimento, caricare lo script "JoVE_real_time_intensity_to_excel.m." Quando richiesto dallo script, selezionare la cartella principale che contiene le 2 cartelle fluoroforo, che a loro volta contengono le immagini per ciascuna concentrazione in sottocartelle.
   NOTA: Lo script genererà automaticamente un file foglio di calcolo nella directory principale in cui i dati HEX fluorescenza verranno salvati in un foglio di named 'HEX', e i dati FAM fluorescenza verranno salvati in un foglio denominato 'FAM'. In ogni foglio, il numero di cicli è elencato nella colonna B, ei dati di fluorescenza in tempo reale per concentrazioni crescenti di modello sono riportati nelle colonne C, D, ecc. Ogni fluorescenza datum tempo reale è l'intensità media di fluorescenza dell'immagine catturata in quel punto di tempo.
7. Utilizzare la funzione di diagramma a dispersione di default nel programma foglio di calcolo per tracciare celle B2: H61 del 'HEX' e lenzuola 'fam' di visualizzare in tempo reale la fluorescenza e generare grafici simili a quelli nelle figure 2A, 2B, 3A, 3B e.
   NOTA: Il foglio generato nel passaggio 8.6 può essere utilizzato anche in script "JoVE_qRPA_standard_curve.m" e "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m".

Risultati

Prima di selezionare una sequenza di servire come IPC negli esperimenti qRPA con l'obiettivo (HIV-1) DNA, controllo interno positivo (IPC) i candidati sono generati e screening per la loro capacità di amplificare in reazioni qRPA senza HIV-1 DNA presente. Candidati IPC sono più lunghi rispetto al target (HIV-1) DNA per prevenire la formazione IPC da fuori competizione HIV-1 formazione amplicon. Come mostrato in Figura 2A, la generazione di due C. candidati parvum IPC sono stati v...

Discussione

Al fine di ottenere dati di quantificazione significativi utilizzando l'algoritmo di MATLAB, l'utente deve selezionare i valori di input appropriati quando richiesto. Dopo l'avvio ogni script ai punti 5 e 6, tutte le variabili di input sono sollecitati automaticamente nella finestra di comando e le uscite sono generati automaticamente. Nella Sezione 5.7 all'utente viene richiesto di selezionare una soglia pista. Il valore della soglia pista colpisce il quadrato del coefficiente di correlazione (r ^2)...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
qRPA Assay
HIV-1 forward primer	Integrated DNA Technologies	custom DNA oligos	5’-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G-3’
HIV-1 reverse primer	Integrated DNA Technologies	custom DNA oligos	5’-CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G-3’
HIV-1 probe	BioSearch Technologies	custom DNA oligos	5’- TGC TAT TAT GTC TAC TAT TCT TTC CCC [SIMA/HEX] GC [THF] C [dT-BHQ1] GTA CCC CCC AAT CCC C -3’
IPC probe	BioSearch Technologies	custom DNA oligos	5’-AGG TAG TGA CAA GAA ATA ACA ATA CAG GAC [FAM] T [THF] T [dT-BHQ1] GGT TTT GTA ATT GGA A -3’
RPA exo reagents (pellets, rehydration buffer, magnesium acetate	TwistDx	TwistAmp exo
PCR tube strips	BioRad	TLS0801
PCR flat cap tube strips	BioRad	TCS0803
Micro-seal adhesive	BioRad	558/MJ
HIV-1 target (pHIV-IRES- eYFPΔEnvΔVifΔVpr)			custom plasmid, see: Segall, H. I., Yoo, E. & Sutton, R. E. Characterization and detection of artificial replication-competent lentivirus of altered host range. Molecular Therapy 8, 118–129, doi:10.1016/S1525-0016(03)00134-5 (2003).
Human male genomic DNA	Applied Biosystems	360486
96 well cold-block	Cole Parmer	EW-36700-48
Thermal cycler	BioRad	CFX96
MiniFuge	VWR	93000-196
Vortex	VWR	58816-121
Tris buffer 1.0 M, pH 8.0	EMD Millipore	648314
EDTA 0.5 M, pH 8.0	Promega	V4321
Nuclease free water	Ambion	AM9937
IPC Development
Cryptosporidium parvum IPC template	Waterborne Inc	P102C	It is also possible to order a double stranded synthetic target from IDT if the user is unequipped to work with C. parvum (a BSL-2 infectious agent). PCR and RPA primers for C. parvum were designed using GenBank accession number AF115377.1
PCR long forward primer	Integrated DNA Technologies	custom DNA oligos	5’-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G/ ATC TAA GGA AGG CAG CAG GC-3’
PCR long reverse primer	Integrated DNA Technologies	custom DNA oligos	5’- CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G/ TGC TGG AGT ATT CAA GGC ATA -3’
Phusion High-Fidelty DNA Polymerase	New England Biolabs	M0530S
Qiaquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704
TAE 10X buffer	EMD Millipore	574797
Agarose	Sigma Aldrich	A9539
Microscope Experiments
Upright fluorescence microscope	Zeiss	Zeiss Imager.J1
Stage heater	Bioscience Tools	TC-GSH
1-Channel Precision High Stability Temperature Controller	Bioscience Tools	TC-1100S
FAM/GFP filter cube	Zeiss	filter set 38 (000000-1031-346)	excitation BP 470/40 nm, emission BP 520/50 nm
HEX filter cube	Chroma	49014	excitation BP 530/30 nm, emission BP 575/40 nm
Laser cutter	Engraver's Network	VLS3.60
1/8" black acrylic	McMaster Carr	8505K113
1.5 mm clear acrylic	McMaster Carr	PD-72268940
Super glue	Office Depot	Duro super glue
PCR grade mineral oil	Sigma Aldrich	M8662-5VL
Data Analysis
Microsoft Excel	Microsoft
MATLAB	MATLAB
MATLAB script: "JoVE_qRPA_standard_curve.m”	Included in SI
MATLAB script: "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m”	Included in SI
MATLAB script: "JoVE_real_time_intensity_to_excel.m”	Included in SI
Adobe Illustrator	Adobe
JoVE_qRPA_well.ai	Included in SI
JoVE_qRPA_base.ai	Included in SI
AxioVision software	Zeiss
JoVE_AxioVision_Script.ziscript	Included in SI