Ad alta frequenza di Ecografia del mouse cervicali Linfonodi

Riepilogo

Questo protocollo descrive l'applicazione di ultrasuoni ad alta frequenza (HFUS) per l'imaging di topo linfonodi cervicali. Questa tecnica consente di ottimizzare la visualizzazione e la quantificazione di cervicale morfologia linfonodi, il volume e il flusso di sangue. Immagine-guidate biopsia dei linfonodi cervicali e lavorazione di tessuto linfatico per la valutazione istologica è anche dimostrato.

Abstract

Ad alta frequenza ultrasuoni (HFUS) è ​​ampiamente utilizzato come un metodo non invasivo per l'imaging strutture anatomiche interne in piccoli impianti sperimentali animali. HFUS ha la capacità di rilevare strutture piccoli come 30 micron, una proprietà che è stata utilizzata per la visualizzazione linfonodi superficiali nei roditori di luminosità (B) -mode. La combinazione di power Doppler con immagini B-mode consente di misurare circolatorio flusso di sangue all'interno dei linfonodi e altri organi. Mentre HFUS è stata utilizzata per l'imaging linfonodo in un certo numero di sistemi modello del mouse, non è stato riportato un protocollo dettagliato descrive HFUS imaging e caratterizzazione dei linfonodi cervicali in topi. Qui mostriamo che HFUS può essere adattato per rilevare e caratterizzare linfonodi cervicali in topi. Combinato B-mode e di imaging power Doppler può essere utilizzato per rilevare gli aumenti del flusso sanguigno in linfonodi cervicali immunologicamente allargata. Descriviamo anche l'uso di immagini B-mode per condurre fini biopsie di linfonodi cervicali senzades recuperare tessuto linfatico per l'analisi istologica. Infine, a pochi passi di software assistita sono descritte per calcolare variazioni di linfa di volume nodo e di visualizzare i cambiamenti in linfonodo morfologia seguenti ricostruzione delle immagini. La possibilità di monitorare visivamente cambiamenti nella cervice biologia linfonodi nel tempo fornisce una tecnica semplice e potente per il monitoraggio non invasivo della cervice alterazioni linfonodi in modelli preclinici murini di malattie del cavo orale.

Introduzione

Linfodrenaggio del liquido tessuto interstiziale è il metodo principale di diffusione per i microrganismi infettivi e tumori derivanti nella regione orale e maxillo-facciale ^1,2. La valutazione clinica dei linfonodi cervicali è una pratica comune utilizzata diagnostico per determinare la presenza o la progressione di malattie che hanno origine nella cavità orale. Ciò sottolinea l'importanza della raccolta linfonodi cervicali come preziosi siti anatomici per la diagnosi della malattia orale ^3. Diverse metodologie di imaging specializzati sono clinicamente utilizzati per identificare malate linfonodi cervicali. Questi includono la tomografia a emissione di positroni (PET), la tomografia computerizzata (TC) e la risonanza magnetica (MR). Mentre grande valore, tutti questi metodi richiedono ampie preparazione del paziente, attrezzature altamente specializzate e / o infusione chimica nella circolazione per abilitare o migliorare il processo di imaging.

L'imaging ecografico (ultrasuoni, Stati Uniti) è una tecnica comunemente applicato utilizzata per imetà linfonodi cervicali presentano linfoadenopatia a causa di infezioni o metastasi ^4-6. Stati Uniti è spesso combinato con PET-TC e RM per fornire una rappresentazione globale dello stato linfonodale paziente, contribuendo a determinare la stadiazione del tumore e la necessità di escissione chirurgica ^7. La natura non invasiva degli Stati Uniti ha anche vantaggi intrinseci rispetto ad altre modalità di imaging, tra cui la facilità di utilizzo, a basso costo, il minimo disagio per il paziente e la preparazione. La posizione sottocutaneo superficiale della maggior parte dei linfonodi cervicali permette agli Stati Uniti a guidare mini-invasive fini biopsie ago aspirazione con maggiore precisione, migliorando l'accuratezza diagnostica ^8.

Commercial-alta frequenza (HF) US fornisce una risoluzione dettagliata delle strutture anatomiche interne a 30 micron ^9. Utilizzando trasduttori vanno 22-70 MHz, HFUS è facilmente applicata ad una varietà di sistemi di roditori sperimentali per permettere imaging in tempo reale degli organi interni in vivo.; HFUS è stato adattato per la visualizzazione della formazione di tumori in convenzionale luminosità (B) -MODE, nonché con un numero di generale e specializzata agents9 miglioramento del contrasto. Utilizzando power Doppler con HFUS fornisce la possibilità di monitorare il flusso di sangue all'interno dei tumori del mouse, consentendo una valutazione globale di perfusione angiogenico nei topi dal vivo ^10,11. HFUS è stato usato per visualizzare malate nodi linfatici del mouse all'interno della cavità del corpo principale, dimostrando l'utilità parallelo di questa tecnologia per la pratica clinica. In particolare, infiammatorie e metastatici alterazioni linfonodi viscerale è stato osservato in modelli murini di cancro al seno nutrire ^12,13, pancreatici ^14, del colon-retto e del polmone ^{15 16} tumori, così come histocytomas fibrosi ^17, e di un modello murino di età idronefrosi acquisito ¹⁸ . Questi esempi solidificare il valore di HFUS come un potente strumento di indagine per linfoadenopatia neoplastica in un'ampia varietà di rosistemi dent.

Diversi modelli di infezione batterica ^19,20 e testa e del collo a cellule squamose (HNSCC) ^21,22 sono stati sviluppati per studiare queste malattie in ambito preclinico. In contrasto con gli esseri umani, i topi contengono tre linfonodi cervicali che un'indagine della linfa dai tessuti orali cavità (mandibolare, mandibolare sottomandibolare e parotide superficiali ^23). Recentemente, abbiamo riportato l'uso di HFUS per mappare la posizione e la morfologia di questi linfonodi, il monitoraggio dei cambiamenti nei linfonodi di volume nodo e il flusso di sangue in un modello murino cancerogena indotta HNSCC ^24. Qui, mettiamo a disposizione un protocollo dettagliato per l'utilizzo di HFUS per l'identificazione, l'imaging e l'analisi dei linfonodi cervicali in topi vivi. Questo protocollo dimostra anche la possibilità di utilizzare HFUS condurre immagine- guidata ago sottile biopsia del mouse allargata linfonodi cervicali, consentendo il monitoraggio istologico di cambiamenti nel contenuto di linfonodi cervicali e patologie oltre tIme nello stesso animale. Questo protocollo è facilmente adattabile per consentire lo studio dettagliato delle patologie cervicali linfonodali risultanti da qualsiasi malattia invasiva cavità orale in topi.

Protocollo

Tutte le procedure sugli animali hanno dimostrato in questo protocollo sono stati esaminati e approvati dalla cura e l'uso degli animali Comitato Università West Virginia secondo protocolli 11-0412 e 14-0514 e condotto in conformità con i principi e le procedure descritte nella guida NIH per la cura e l'uso degli animali.

1. Preparazione degli animali

1. Anestetizzare un singolo mouse in una camera di induzione utilizzando 3% isofluorano miscelato con 1,5 L / min 100% di ossigeno. Rimuovere l'animale dalla camera di induzione e posto in posizione supina sulla piattaforma di imaging preriscaldato a 40 ° C e mantenuta tra 37-42 ° C (Figura 2A). Conferma anestesia dalla mancanza di risposta ad una presa punta.
2. Posizionare il muso mouse all'interno dell'ogiva collegato al sistema di anestesia. Applicare l'anestesia per mantenere la sedazione stato stazionario (1,5% isofluorane miscelato con 1,5 L / min 100% di ossigeno).
3. Applicare il lubrificante occhio ogni occhio per evitare essicatoio peg. Applicare gel per elettrodi agli elettrodi e utilizzare nastro per fissare ciascuno dei quattro zampe all'elettrodo corrispondente. Gli elettrodi trasmettono ECG dell'animale per il sistema di imaging per consentire il monitoraggio della frequenza cardiaca e la frequenza respiratoria. Lubrificare ed inserire la sonda temperatura rettale per il monitoraggio continuo della temperatura corporea. La temperatura corporea del mouse normale è 36,9 ° C. 1-2 variazione ° C è normale mentre sotto anestesia.
4. Utilizzare crema depilatoria per rimuovere il pelo dal collo del mouse. Sciacquare la regione del collo con una garza imbevuta di acqua per eliminare i peli e la crema depilatoria eccesso. Facoltativamente, utilizzare ulteriore applicazione di crema depilatoria per rimuovere qualsiasi residuo corpo capelli (Figura 2B).

2. Identificazione e Image Acquisition of Mouse cervicale linfonodi Utilizzando HFUS

1. Per iniziare, applicare uno strato di gel ultrasuoni riscaldato alla zona del collo priva di pelo. Utilizzare l'applicazione di gel per un'immagine ottimalequalità (Figura 2C). Evitare di introdurre bolle d'aria nel gel durante l'applicazione, che possono interferire con l'imaging ad ultrasuoni.
2. Regolare la piattaforma di imaging 20-30 ° in modo che il mouse si trova con la testa un po 'elevato. Questa posizione aiuta a garantire il tasso di respirazione ottimale per il mouse. Posizionare il trasduttore 40 MHz trasversalmente nel sistema di montaggio ed abbassare fino alla parte anteriore della testina di scansione trasduttore è immerso nel gel ultrasuoni (Figura 2C).
   NOTA: Assicurarsi di non esercitare un'eccessiva pressione sul collo del mouse, in quanto potrebbe causare difficoltà respiratorie eccessivo. Inoltre, è utile per l'imaging di avere un buffer di gel fra il trasduttore e il mouse.

B-Mode Imaging e rilevamento di Linfonodi:

3. Utilizzando il computer che controlla il software di acquisizione HFUS, regolare la luminosità (B-) impostazioni della modalità per i seguenti parametri: Guadagno 22 dB, profondità 10,00mm, larghezza 14,08 millimetri.
   NOTA: Queste impostazioni sono un punto di partenza suggerito, e possono richiedere lieve regolazione per l'acquisizione delle immagini ottimale tra le diverse applicazioni. Osservare le normali linfonodi cervicali come ovali strutture ipoecogene vicino alla superficie della pelle all'interno di un campo iperecogeno circostante. La comparsa di linfonodi malati può variare tra i modelli. Per sistematicamente immagine tutti i linfonodi nella regione del collo eseguire le seguenti operazioni:
   1. Utilizzare l'asse Y per la scansione del collo in un cranica caudale maniera verso la regione toracica. Utilizzare asse X per centrare l'immagine.
   2. Identificare i principali punti di riferimento: cavità orale, lingua e tiroide (Figure 3A, B e C; rispettivamente); inclinare la piattaforma di imaging per regolare in orizzontale la superficie ventrale del collo del mouse, rendendo entrambi i lati del collo appaiono anche nell'immagine B-mode. La quantità di inclinazione dipende fisiologia di ogni singolo mouse.
4. Effettuare una scansione 3D dell'intero regione del collo dalla regione cavità / linguetta buccale alla tiroide, al fine di mappare linfonodi e monumenti associati tutto il collo.
   1. Individuare il / regione di cavità orale della lingua (Figura 3A) e annotare la posizione numerica della scala Y.
   2. Individuare tiroide (Figura 3C) e annotare la posizione numerica della scala Y.
   3. Calcolare la differenza fra i valori ottenuti in (2.4.1) e (2.4.2) per determinare la lunghezza totale in mm per la regione del collo immaginata.
   4. Utilizzare la manopola Y per centrare il trasduttore sul punto medio della lunghezza totale determinata.
   5. Premere il tasto "3D". Inserire la lunghezza totale. Per ampiezza del passo 3D, utilizzare 0,076 millimetri per acquisire lo stack serie di immagini per l'intera regione del collo.
5. Una volta completata la scansione, selezionare il lato destro o sinistro del collo e centrare il trasduttore su un linfonodo individuale di interesse, quindi sollevare la 40 MHz trasduttore dal mouse. Rimuovere il trasduttore 40 MHz e sostituirlo con un trasduttore microscan 50 MHz (anche in posizione trasversale) per ottenere immagini ad alta risoluzione. Ricostituire il gel per ultrasuoni sul collo mouse e abbassare il trasduttore 50 MHz nel gel ultrasuoni.

3D Power Doppler Imaging

6. Comportamento scansioni 3D con power Doppler a volume asini e la vascolarizzazione dei singoli linfonodi cervicali come segue:
   1. Premere il pulsante di accensione sulla tastiera di sistema per acquisire potere Dopper e regolare le seguenti impostazioni potere-mode: PRF 4 KHz, Doppler guadagno 34 dB, 2D guadagno 30 dB, profondità 5,00 millimetri, larghezza 4,73 millimetri. NOTA: Come prima, queste impostazioni sono un punto di partenza suggerito e può essere modificato in base alle esigenze per l'acquisizione delle immagini ottimale in vari modelli.
   2. Individuare il cranio-punto più del linfonodo di interesse e annotare la posizione sulla scala Y.
   3. Individuare il punto più caudale stesso nodo e notela posizione sulla scala Y.
   4. Calcolare la differenza di distanza per determinare la lunghezza totale del linfonodo (vedere fase 2.4.3).
   5. Centrare il trasduttore sul punto medio della lunghezza totale determinata, utilizzando la posizione Y scala.
   6. Premere il tasto "3D" e inserire la lunghezza totale dei linfonodi. Utilizzare 0,051 millimetri per il passo.
      NOTA: A causa della vicinanza del trasduttore alla regione toracica, il trasduttore 50 MHz può provocare un'immagine Doppler instabile a causa del rilevamento del movimento respiratorio normale. Ciò può essere evitato utilizzando l'opzione "Respiration gating", disponibile nella scheda "fisiologica".
   7. Circondano il linfonodo selezionato con la scatola gialla che indica la regione da analizzare dal power Doppler e selezionare "scan 3D" per acquisire le immagini. Sollevare il trasduttore off del mouse e spostarlo verso il lato opposto del collo. Abbassare il trasduttore sul mouse e ripetere i passaggi sopra descritti per image linfonodi su questo lato del collo.
7. Salva set di immagini per successive analisi.

3. cervicale biopsia del linfonodo

1. Selezionare il linfonodo desiderato per la biopsia e mantenere HFUS di imaging con il trasduttore 50 MHz. Scelto il grande linfonodi cervicali visibile in ciascun lato del collo mouse. Linfa allargamento nodo indica in genere una risposta infiammatoria, e, pertanto, questi nodi sono candidati ideali per la biopsia.
   NOTA: Abbiamo trovato che è molto difficile condurre biopsie sui nodi cervicali inferiore a 10 mm ^3.
2. Preparare l'ago e la siringa per biopsia mettendo una siringa da 1 ml con annessa 27 G, 0,5 pollici ago nel porta siringa. Regolare il supporto dell'ago per orientare l'ago 90 ° al collo mouse (Figura 4A).
3. Preparare elevando l'intera piattaforma del mouse al livello dell'ago. Raggiungere questo obiettivo rimuovendo il motore 3D e passare a un più alto piattaform, o mettendo un oggetto solido di altezza adeguata sotto la piattaforma breve disponibile. Utilizzare un rack provetta per microcentrifuga in plastica per questo scopo. Se necessario, ruotare la piattaforma 180 ° per biopsia nodi posti sul lato del collo di fronte all'apparato dell'ago.
4. Regolare le impostazioni di acquisizione selezionando "Preferenze", poi scegliendo "Max & tampone ampliato". Allargare il campo di vista per una profondità di 8,00 mm e larghezza di 9,73 millimetri. Accendere la guida ago utilizzando comporre lo schermo Keys. La guida dell'ago prevedere la traiettoria dell'ago sullo schermo e permette all'utente di allineare il linfonodo di interesse nella posizione corretta per la biopsia.
5. Assicurarsi che il linfonodo rimane costantemente in vista centrando il linfonodo in mezzo o leggermente a sinistra del centro della schermata (Figura 4B). Per ottenere l'intero ciclo cine della procedura, premere Pre-trigger della tastiera di sistema prima di iniziare la biopsia.
6. Regolare il porta-aghi fino a quando la punta dell'ago entra in vista e in contatto con la pelle (Figura 4B). Avanzare l'ago con una ditta, veloce spingere per forare la pelle. Continuare a far avanzare l'ago finché la punta perfora anche la capsula (Figura 4C) ed è visibile all'interno del midollo (Figura 4D).
7. Una volta che l'ago è posizionato correttamente all'interno del nodo, tirare delicatamente lo stantuffo della siringa schiena tra le 200-300 demarcazioni microlitri di condurre la biopsia (Figura 4D e 4E). Si noti che il materiale bioptico non è tipicamente visibile all'interno della siringa.
8. Rimuovere delicatamente l'ago dal collo del mouse. Espellere il contenuto della siringa in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. Rimuovere l'ago dalla siringa, lasciando l'ago nel tubo. Raccogliere 1 ml di supporti biopsia (da un'aliquota, separati dalla sorgente magazzino) con la stessa siringa, e quindi ricollegare l'ago alla siringa, mantenendo l'ago in the tubo.
   1. Lavare la siringa e l'ago con i media biopsia espellendo media biopsia nel tubo.
      NOTA: Non tirare indietro lo stantuffo mentre l'ago è collegato in qualsiasi momento dopo la biopsia. Questo riduce il rischio di perdere il materiale bioptico a causa delle piccole dimensioni del campione.
9. Confermare linfa contenuto del nodo mediante istologici (figura 4F) e analizzare con metodi aggiuntivi (istochimica, citometria a flusso, etc.) a seconda dei casi.
10. Una volta che la biopsia è completata, spegnere l'anestesia e rimuovere la sonda di temperatura rettale. Rimuovere gel per ultrasuoni in eccesso dal mouse con una garza e rimuovere il nastro da ciascuna zampa.
11. Rimuovere il mouse dalla piattaforma di imaging e tornare ad una gabbia. Sanguinamento minimo dal sito biopsia può verificarsi, ma questo si ferma senza l'intervento. Monitorare il mouse durante il recupero fino piena attività è ripresa.

4. Immagine Analisi delle cervicali Linfonodi

1. Nel software ultrasuoni, selezionare l'immagine per l'analisi e passare alla scheda "Image Processing". Scegliete "Load in 3D".
2. Selezionare "3D Ricostruita Immagine" in alto a sinistra, cliccando sul pulsante "Visualizza Pane Single". Utilizzare la funzione di zoom per ingrandire l'immagine se lo si desidera. Toggle "Layout Display" per visualizzare l'immagine solo in B-mode, che elimina la sovrapposizione power Doppler alla vista. Questo rende più facile vedere i bordi del linfonodo durante la successiva analisi 3-D. Scorrere la serie di immagini per individuare l'inizio del linfonodo.
3. Per circoscrivere il linfonodo, accedere alla scheda "Impostazioni 3D". Selezionare "Volume", poi il pulsante "Start" accanto a "parallelo".
4. Disegna contorni intorno alla zona di interesse all'interno delle singole immagini scorrendo. Continuare fino a quando le immagini che comprendono l'intero linfonodo sono contrassegnati. Scegliere "Fine" percompletare l'analisi.
5. Nella parte inferiore dell'immagine, viene visualizzata automaticamente 3D volume e% vascolarizzazione.
   NOTA: 3D il volume corrisponde al volume dei linfonodi, e cento vascolarizzazione rappresenta la percentuale del linfonodo positivo per il flusso di sangue dal power Doppler.
6. Toggle "Layout Display" per visualizzare il power Doppler Imaging come una sovrapposizione dell'immagine B- modalità on. Sulla superficie vista osservare una vista netta dell'area volume di interesse. Esportare le immagini in file di immagine (TIF) in formato 3D o scansioni nella categoria film (.avi) per un ulteriore uso.

Risultati

Lo schema generale per le procedure di imaging e biopsia è mostrato in Figura 1. Le fasi principali del procedimento includono corretta preparazione del mouse per l'imaging, l'identificazione dei linfonodi cervicali, corretta preparazione e la conduzione della biopsia, e l'analisi di B immagini -mode e Doppler per misurare il volume e la quantità di vascolarizzazione all'interno di ogni nodo selezionato utilizzando il software del computer.

HFUS imaging topo linfonodi cervicali necessario applicare e mantenere l'anestesia adeguate per tutto il periodo di imaging (Figura 2A), nonché la rimozione completa dei capelli che copre l'intera zona del collo (Figura 2B). L'applicazione di gel ultrasuoni per la regione depilata garantisce un segnale HFUS chiaro durante la procedura (Figura 2C).

HFUS l'imaging della regione del collo è aiutata dalla visualizzazione dei punti di riferimento anatomici cervicali che producono caratteristici immagini ecografiche. Figura3 mostra esempi degli organi principali (figura 3A-C), linfonodi cervicali in B-mode (Figura 3D) e in modalità power Doppler (Figura 3E).

In tempo reale HFUS immagini in topi anestetizzati permette guidata ago sottile biopsia linfonodi cervicali simile a quello che è condotta nella pratica clinica. Posizionamento dell'ago bioptico e la siringa raccolta attaccata al dispositivo microinjector controllo è mostrato in Figura 4A. B-mode successiva immagini ecografiche mostrano il posizionamento ideale ago prima biopsia (figura 4B), ago entrata punta in un linfonodo cervicale (Figura 4C), e la posizione dell'ago durante la biopsia (Figura 4D). Close-up immagine mostra la punta dell'ago all'interno della midollare del linfonodo (figura 4E). L'elaborazione dei componenti biopsia di cytospin rivela abbondanti gruppi di cellule linfoidi e del tessuto connettivo associate, verificando linfonodo di successobiopsia (Fig 4F).

Analisi basata-computazionale di immagini HFUS consente di ottenere informazioni dettagliate su architettura linfonodi, il volume e il flusso vascolare. Utilizzando la modalità power Doppler e misurazioni del volume 3D, cento vascolarizzazione (PV) può essere calcolata dalla serie di immagini che comprendono interi nodi (Figura 5A). Inoltre, imaging 3D consente virtuale ricostruzione dei linfonodi, rivelando generale topografia linfonodo (Figura 5B).

Figura 1:. Presentazione schematica delle fasi del processo di HFUS diagnostico linfonodi cervicali nodo di imaging nei topi I passaggi chiave includono 1: Preparazione del mouse per l'imaging HFUS e ottenendo 40 e 50 immagini ad alta risoluzione MHz della regione del collo contenente i tre topi linfonodi cervicali . 2: ago sottile guidata dalle immagini biopsia dei linfonodi cervicali e successiva analisi istologica di biopsia materiale. 3: Computer-aided analisi dell'immagine e ricostruzione 3D di immagini linfonodali ottenuti in B-mode e Doppler per determinare rispettivo volume linfonodo e percentuale (%) del flusso vascolare.

Figura 2:. Panoramica del alta risoluzione nel sistema di micro-imaging in vivo per la valutazione dei linfonodi cervicali e la biopsia (A) Il sistema HFUS è mostrato con un mouse anestetizzato preparata per l'imaging dei linfonodi cervicali. Anche indicato è microinjector (MI), e stage 3D-motore (3D MS) apparecchiature accessorie. (B) Primo piano vista di un mouse anestetizzato preparato per HFUS l'imaging con rimosso in regione del collo capelli. (C) La stessa mouse con il trasduttore 50 MHz in posizione sul collo. Nota gel ultrasuoni supplementare utilizzato per facilitare collo regione imaging.

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Figura 3: HFUS rappresentante immagini di anatomia del collo dell'utero nella B-mode e power Doppler. (A, B) immagini B-mode della cavità orale, mostra la cavità buccale (BC) e la linguetta (T) individuate tramite tomografia vicina alla cavità nasale. I tre linfonodi cervicali trovate su ciascun lato del collo (etichettati M, mandibolare, SM, sottomandibolare, SP, parotide superficiale), appaiono come un gruppo di strutture ipoecogene in un piano di imaging singola come indicato (B). (C) La ghiandola tiroidea (Th), come visualizzato nella regione toracica superiore, che appare come una struttura a forma di farfalla ecogenica solido. (AC) sono stati visualizzati con un trasduttore 40 MHz; barra della scala = 1 mm. (D, E) Immagini rappresentative della normale (D) e allargata (E) linfonodi cervicali con B-mode e power Doppler (rosso). Le linee tratteggiate descrivono i singoli linfonodi. Barra di scala = 0,5 mm.

Figura 4: cervicale biopsia del linfonodo set-up, imaging e analisi cytospin di materiale bioptico (A) La piattaforma di imaging che mostra la micro-iniezione e il posizionamento dell'ago vicino al collo del mouse.. Una vasta cremagliera provetta (blocco arancione) è usato per sollevare leggermente la piattaforma, che consente il corretto posizionamento dell'ago pur consentendo spazio per la fase 3D del motore. Questa disposizione riduce al minimo il tempo trascorso la rimozione della fase del motore per ogni mouse. (B - D) Interi immagini HFUS collo prelevati da un video di una biopsia del linfonodo cervicale con il trasduttore 50 MHz. (B) HFUS immagine B-mode che mostra l'ago posizionato al lato del collo prima biopsia. La punta dell'ago è la struttura iperecogena appena sotto la posizione della guida dell'ago (linea tratteggiata verde) sovrapposto durante l'imaging per indicare la traiettoria dell'ago. Il linfonodo è nel centro dil'immagine. Barra di scala = 1 mm. (C) l'ingresso dell'ago nel linfonodo. (D) biopsia del linfonodo cervicale. (E) biopsia ingrandita di linfonodi cervicali. Barra di scala = 0,5 mm. Analisi (F) Cytospin del rappresentante materiale bioptico linfa conferma biopsia successo. Barra di scala = 100 micron.

Figura 5:. L'analisi al computer di immagini 3D linfonodali cervicali (A) screenshot Rappresentante di un linfonodo analizzati utilizzando software per computer. Il nodo è circoscritto in blu; risultati dell'analisi mostrano volume 3D e cento vascolarizzazione (PV) come indicato. (B) Una vista immagine superficie dello stesso nodo dopo l'analisi 3D. Rende intero volume di linfonodo sulla base di misurazioni effettuate in A.

Discussione

Il protocollo descritto permette la visualizzazione e la valutazione in situ di murine linfonodi cervicali utilizzando non invasiva di imaging HFUS. L'uso di B-mode e potenza Doppler per visualizzare cervicale morfologia linfonodi, volume e linfonodo flusso sanguigno prevede una analisi sperimentale preclinici sistemi modello topo simile a quello utilizzato per la caratterizzazione dei nodi cervicali paziente nella pratica clinica. La possibilità di monitorare i linfonodi cervial tramite biopsia con ago sottile offre anche una tecnica utile per rilevare le alterazioni delle cellule immunitarie e la presenza di tipi cellulari stranieri o batteri durante cavità orale malattia indotta linfadenopatie nei topi. La facilità di utilizzo e basso costo associato con HFUS permette lo screening rapido di stato dei linfonodi cervicali in un'ampia varietà di modelli animali.

Un passo fondamentale in questo protocollo è l'identificazione successo iniziale dei linfonodi cervicali nelle immagini HFUS. La nostra struttura ha un assortimento di HFUS transducers come descritto, così li abbiamo utilizzati per ottenere immagini di altissima qualità. Tuttavia, se i trasduttori descriviamo non sono disponibili, è possibile adattare l'immagine che utilizzano altri trasduttori. A questo scopo, regolando la profondità e la larghezza dell'immagine per ottenere un'immagine adeguata è tutto ciò che è richiesto. Risoluzione di tali immagini può variare, ma dovrebbe essere ancora possibile ottenere immagini di alta qualità usando HFUS. Monumenti Imaging della cavità orale e la ghiandola tiroidea notevolmente aiuto nell'orientare l'utente alla regione appropriata in cui sono localizzati i linfonodi. La caratteristica, natura ipoecogena ovale e la posizione superficiale vicino alla superficie della pelle consente di identificazione rapida conferma dei linfonodi cervicali all'interno della regione corretta collo. Mentre tutti e tre i nodi possono essere visibili in un unico piano di imaging (figura 3B), tipicamente uno o due nodi vengono catturati durante l'imaging. Aggiustamenti minori del trasduttore di posizione possono essere condotte a squarciareer di imaging diversi piani visibile, consentendo la visualizzazione di tutti i nodi su un unico lato del collo.

Mentre abbiamo trovato la tecnica descritta affidabile per l'identificazione di linfonodi cervicali, ci sono limitazioni specifiche per la tecnica di imaging e biopsia. La natura superficiale del topo linfonodi cervicali conferisce mobilità eccessiva quando anche una leggera pressione viene applicata alla pelle attraverso la testa trasduttore. Questo può essere neutralizzata lentamente applicazione della testina trasduttore nel gel ultrasuoni sul collo mouse finché sono state identificate le immagini di riferimento. Mobilità linfonodale può anche complicare la biopsia con ago sottile, soprattutto quando si utilizza trasduttori nella risoluzione più alta (50 MHz) gamma. Immagini centrate di linfonodi per biopsia sono tipicamente spinti fuori dal campo visivo dovuto alla forza della biopsia necessario per perforare la pelle sovrastante e capsule. Questo può essere risolto dal posizionamento fuori centro del linfonodo verso la direzione di entrata dell'ago,fornire spazio per il linfonodo da spingere attraverso ma rimangono ancora all'interno del campo di visualizzazione durante biopsia. Nella nostra esperienza, i linfonodi> 10 mm ³ sono molto difficili da biopsia, e sono spesso spinti dalla ago piuttosto che penetrare durante ago avanzamento. Così, la biopsia andrebbe riservato ai linfonodi ingrossati in cui la dimensione è> 10 mm ³ per garantire una sufficiente dimensione di destinazione del nodo e la stabilità nella regione cervicale. Inoltre, materiale bioptico non può contenere il numero di cellule sufficiente per le procedure che richiedono il numero di cellule grandi (ad esempio, citometria a flusso).

HFUS è stato utilizzato con successo per visualizzare HNSCC ortotopica tumori ^25, e ha il potenziale per controllare le metastasi nodo cervicale nei topi con tumori orali ^24. Oltre a ultrasuoni, l'imaging bioluminescenza è stato utilizzato anche per visualizzare la formazione del tumore orale ortotopica e metastasi linfonodali cervicali in topi vivi ^26,27. Come un Alternapproccio ative, imaging bioluminescenza ha un netto vantaggio rispetto HFUS di essere in grado di quantificare direttamente la progressione del tumore e l'onere metastatico nel tempo nello stesso animale. Mentre innegabilmente utile, l'imaging bioluminescenza è in grado di misurare molti dei parametri visualizzati da HFUS, inclusa la linfa morfologia nodo, volumi nodali o il flusso di sangue. L'imaging bioluminescenza richiede anche scatole scure specializzati per mantenere i topi durante l'imaging, rendendo questa tecnica non adatto per l'adattamento per biopsia con ago sottile.

Inoltre, l'imaging bioluminescenza richiede la produzione di cellule tumorali che esprimono stabilmente l'enzima luciferasi, permettendo a questa tecnica deve essere utilizzato solo in casi di xenotrapianti ortotopici con le cellule tumorali luciferasi transfettate in topi immunocompromessi, o con sistemi di transgenici tessuto-specifici inducibili che limitano l'espressione luciferasi in modo spazio-temporale specifico tessuto di origine tumorale. Al contrario, HFUS può essere used in combinazione con le immagini bioluminescenza in questi modelli, oltre ad essere in grado di immaginare linfonodi cervicali in modelli di tumori orali cancerogeno-indotta in topi con sistemi immunitari completi ^28,29. Mentre HFUS può essere più adattabile alla maggior parte dei modelli murini di cancro orale, i dati combinata che può essere ottenuto da bioluminescenza e HFUS immagini in sistemi in cui le cellule tumorali esprimono luciferasi in grado di fornire un quadro più completo di coinvolgimento linfonodale cervicale rispetto sia di imaging modalità solo.

La capacità di identificare e rilevare topo linfonodi cervicali in tempo reale consente questa tecnica per essere utilizzato nella maggior parte dei modelli di malattia orale che provocano linfoadenopatia infiammatoria dove l'animale può essere mantenuto in posizione invertita in anestesia breve termine. Il rilevamento di metastasi ai linfonodi o infezioni batteriche e l'impatto sulla concomitante linfonodo morfologia in animali vivi presenta un vantaggio significativo rispetto ai metodi tradizionaliche richiedono i linfonodi per essere rimosso da animali morti per l'elaborazione istologica. Combinando HFUS con biopsia con ago sottile permette un mezzo per condurre l'analisi patologica di routine dei linfonodi cervicali, simile a quello che viene condotto in clinica, che fornisce un metodo migliore per monitorare la progressione della malattia nella maggior parte dei modelli attuali murini di patologie del cavo orale.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vevo2100 High Resolution Micro-ultrasound Imaging System, with integrated software Version 1.6.0	VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada	VS-11945
Power Dopper Mode and 3D Mode	VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada	VS-11952; VS-11484
Vevo compact anesthesia system	VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada
Vevo integrated rail system including 3D motor and micromanipulator for injections	VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada	SA-11983
Thermasonic Gel Warmer	VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada		Optional
Transducers – MS-550D (Broadband frequency: 22 MHz - 55 MHz)	VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada	VS-11960	Referred to as 40 MHz Transducer
Transducers – MS-700 (Broadband frequency: 30 MHz - 70 MHz)	VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada	VS-12026	Referred to as 50 MHz Transducer
Ophthalmic Ointment	Patterson Veterinary	07-888-1663
Electrode gel	Parker Laboratories	174-1525
Tape	Medical Arts Press	174-153000
Depilatory Cream	Carter Products
Cotton swabs	General Supply
Gauze	Fisher Scientific	22-037-907
Water	General Supply
Lubricating gel	Parker Laboratories	57-05
Ultrasound gel	Parker Laboratories	01-50
Microcentrifuge tube rack	General Supply		Used to raise mouse platform for optimal biopsy position
27 G ½ inch needle with 1 ml syringe	Fisher Scientific	14-826-87
ThinPrep PreservCyt Solution	Hologic	70097-002	Refered to as biopsy media
Microcentrifuge tubes	General Supply
Thinprep 2000 processor	Cytyc, Marlborough, MA		Blue Filter
Olympus AX70 Provis Microscope	Olympus, Center Valley, PA