Concentric Sistema Gel per studiare il ruolo biofisica di Matrix Microenvironment sulla migrazione Cell 3D

Riepilogo

Le proprietà meccaniche e microstruttura della matrice extracellulare influenzano fortemente la migrazione delle cellule 3D. Un metodo in vitro per studiare il comportamento di migrazione delle cellule spazio-temporale in ambienti biofisico variabili, sia a livello della popolazione e delle singole celle, è descritto.

Abstract

La capacità delle cellule di migrare è cruciale in un'ampia varietà di funzioni cellulari per tutta la vita di sviluppo embrionale e la guarigione della ferita al tumore e metastasi. Nonostante intensi sforzi di ricerca, i principi biochimici e biofisici fondamentali della migrazione cellulare non sono ancora pienamente compresi, soprattutto nelle fisiologicamente rilevanti (3D) microambienti tridimensionali. Qui, descriviamo un test in vitro per permettere l'esame quantitativo di comportamenti di migrazione delle cellule in 3D. Il metodo sfrutta la capacità mechanosensing della cellula e propensione a migrare nella matrice extracellulare precedentemente occupato (ECM). Usiamo l'invasione delle cellule del cancro al seno altamente invasivo, MDA-MB-231, in gel di collagene come sistema modello. La diffusione della popolazione cellulare e le dinamiche di migrazione delle singole cellule nel corso di settimane della cultura possono essere monitorati tramite live-cell imaging e analizzati per estrarre i dati spatiotemporally-risolti. Inoltre, Il metodo è facilmente adattabile per diverse matrici extracellulari, offrendo così un modo semplice ma potente per studiare il ruolo dei fattori biofisici del microambiente sulla migrazione delle cellule.

Introduzione

La migrazione di cellule svolge un ruolo chiave nella varie risposte fisiologiche quali lo sviluppo embrionale, emostasi, e la risposta immunitaria, nonché in processi patologici come le malattie vascolari, infiammazione e cancro ^1. Analisi dei fattori biochimici e biofisici sottostanti migrazione delle cellule è quindi di fondamentale importanza non solo per capire i principi fondamentali di funzioni cellulari, ma anche per avanzare varie applicazioni biomediche, come in ingegneria tissutale, anti-metastasi e sviluppo anti-infiammatori droga. Poiché osservazione in vivo è tecnicamente difficile, molti sforzi si è focalizzata sulla ricapitolazione in vitro della migrazione cellulare.

Metodi in vitro per studiare la migrazione delle cellule sono state in gran parte progettato per test su due superfici bidimensionali (2D), in particolare il graffio o ferita guarigione test ^2. Tali saggi offrono semplice setup sperimentale, facile live-imaging cellulare, e fornire indicazioni utili in diversi meccanismi biochimici alla base delle migrazioni delle cellule. Tuttavia, questi test non rappresentano matrice (ECM) Architettura e rimodellamento extracellulare, che sono aspetti critici nella comprensione della migrazione vivo. Recentemente, è stato sempre più apprezzato che un modello di coltura 3D, spesso in matrici a base di collagene ^3, fornisce una piattaforma che meglio assomiglia la situazione in vivo. Infatti, le cellule presentano dinamiche migratori che sono distinti da quelli sulle superfici 2D, soprattutto a causa della diversa dimensionalità dell'ambiente ^4. Inoltre, le proprietà biofisiche e meccaniche della matrice influiscono sensibilmente migrazione cellulare ^5, anche nel contesto di invasione delle cellule tumorali ^6.

Qui vi presentiamo un metodo per studiare il comportamento di migrazione delle cellule 3D in ECM con proprietà biofisiche che possono essere facilmente variati condizioni di preparazione. Le cellule sonotesta di serie in un "gel interno" e sono autorizzati a fuggire in e invadere la "gel esterno" inizialmente acellulare. Il metodo si basa sulla capacità delle cellule di riconoscere la presenza e la propensione a migrare in regioni prive di cellule nel gel esterna, che è strettamente legato alla cella mechanosensing ^7. In questo studio, ci avvaliamo di reti di collagene come il ECMs invasi dalle cellule del cancro al seno altamente invasive, MD-MBA-231. Le proprietà meccaniche e microstruttura di entrambi i gel interno ed esterno possono essere sintonizzati ⁸ e ⁹ caratterizzato per raggiungere condizioni fisiologicamente rilevanti. Ricostruzione e analisi delle tracce cellulari consentono esame quantitativa dettagliata del comportamento di migrazione spaziotemporale sia a livello della popolazione e livello di singola cellula. È importante sottolineare che la messa a punto del sistema di gel concentrica imita il vivo topologia tessuto affrontato da migrazione delle cellule, in particolare invadere le cellule tumorali, offrendo spunti importantiai meccanismi fisici di migrazione cellulare e metastasi.

Protocollo

Raccolta 1. Cella

1. Ottenere MD-MBA-231 cellule dal 37 ° C, 5% CO ₂ incubatore. Staccare le cellule dal tessuto piastra di coltura con 0,5% di soluzione di tripsina-EDTA. Usare 1 ml di soluzione di tripsina-EDTA per cellule coltivate in un pallone T25.
2. Cellule pellet in un tubo da 15 ml per centrifugazione a 200 g per 4 minuti, aspirare il supernatante e risospendere le cellule in 5 ml di coltura.
3. Conte densità cellulare, ρ, utilizzando un emocitometro.
   Nota: Per preparare il gel interno delle cellule testa di serie, la sospensione cellulare viene successivamente diluito 10 × per raggiungere la finale densità di semina delle cellule. Pertanto, è necessario 10 × sospensione cellulare concentrata.
4. Calcolare il volume di terreno richiesta per ottenere una concentrazione di 10 × cellulare:
   
   Nota: Un finale densità di semina delle cellule, c _finale, di circa 215; 10 ⁶ cellule / ml è consigliato per MD-MBA-231 cellule ed è utilizzato in questo protocollo. Altri densità di semina possono essere esplorate anche per altri tipi di cellule.
5. Cellule pellet ancora una volta in un tubo da 15 ml per centrifugazione a 200 g per 4 minuti, e aspirare il surnatante.
6. Risospendere le cellule in quantità necessaria _(V calcolati in fase di 1.3) di terreno privo di siero di coltura cellulare a fondo per ridurre al minimo aggregazione delle cellule.
   Nota: Il rosso fenolo è auto-fluorescente, e può interferire con l'imaging di fluorescenza / riflessione. Uso di mezzo privo di rosso fenolo può essere considerato per ottenere la migliore qualità dell'immagine.

2. Preparazione di collagene Solutions

1. Ottenere la soluzione di riserva di collagene, 10 × tampone PBS, Milli-Q H ₂ O, 0.1 M NaOH, e diversi microprovette. Tenere tutti sul ghiaccio per evitare premature collagene polimerizzazione, e mantenere condizioni sterili.
2. Equilibrare un vetro- sterilepiatto fondo di pre-riscaldamento nella C incubatore 37 °.
   Nota: Tutti i volumi di questo protocollo sono stati ottimizzati per un piatto fondo di vetro con 12 millimetri pure. Se si utilizza un altro tipo piatto, regolare i volumi di conseguenza.
3. Calcolare il volume richiesto di preparazione di 50 ml di 2,4 mg / ml soluzione di collagene per il gel interno (soluzione I) basata sulla concentrazione collagene magazzino.
   Nota: altre concentrazioni di collagene per il gel interno possono anche essere utilizzati.
4. In un ambiente sterile (tipicamente una cappa di biosicurezza), aggiungere lentamente 5 ml di 10 × tampone PBS alla quantità necessaria di collagene soluzione madre (calcolata al punto 2.3) con dolce vorticoso. Fare attenzione ad evitare la formazione di bolle d'aria.
5. Regolare il pH della miscela a 7,4 usando NaOH 0,1 M utilizzando calibrato pH-metro. Indicativamente, utilizzare circa 5 microlitri per portare il pH vicino a 7,4 (la quantità varia a seconda della concentrazione di magazzino e pH).
   Nota: Si noti che i volumi coinvolti in questopasso è troppo piccolo per l'uso normale pH metro. Utilizzare uno dei seguenti trucchi:
   1. Preparare le soluzioni di collagene per più campioni. Regolare il pH in massa con pH normale metro e distribuire le soluzioni di collagene attraverso i campioni.
   2. In alternativa, regolare il pH di una soluzione di collagene in volume più grande (i. E., Il volume che consente l'utilizzo di pH normale metro). Notare la quantità di NaOH necessaria per portare il pH a pH finale. Scale giù i volumi e utilizzare la quantità appropriata di NaOH per l'esperimento. Confermare il valore del pH utilizzando carta tornasole.
   3. Altrimenti, utilizzare un elettrodo di pH micro per regolare più accuratamente il pH di piccole quantità.
6. Portare la soluzione ad un volume di 45 microlitri con H ₂ O. Eseguire tutti i passi sul ghiaccio per evitare premature collagene polimerizzazione.

3. La formazione di Concentric Gel Cultura

1. Prendete il piatto fondo di vetro pre-riscaldato (vedi punto 2.2) da the incubatore.
2. Aggiungere 5 ml di sospensione cellulare concentrata 10 × (preparata al punto 1.5) di soluzione I. Risospendere accuratamente. Fare attenzione ad evitare la formazione di bolle d'aria. La miscela ha ora un volume di 50 microlitri e contiene la concentrazione finale collagene (2,4 mg / ml) e la densità delle cellule (c _finale = 2 x 10 ⁶ cellule / ml).
3. Aggiungere 20 ml della soluzione di cellule contenenti lentamente al centro del pozzo, in modo da formare una cupola a forma di goccia (Figura 1A). Fare attenzione ad evitare la formazione di bolle in questa fase. Se si forma un bolla, con attenzione ma rapidamente cercare di rottura sia o aspirare utilizzando un puntale. Posizionare delicatamente il piatto di nuovo in incubatrice per lasciare il gel interno polimerizzare per 45 min.
4. Preparare la soluzione O (per esterno, gel di collagene acellulare) circa 15 minuti prima della fine di questa fase di incubazione.
   Nota: La condizione gel esterno può variare in termini di concentrazione di collagene e polimerizzazione a pHottenere reti con diverse microstrutture ^10. In questo protocollo, concentrarsi su un 1,5-4,0 mg / ml di gel di collagene polimerizzato ad un pH di 7,4.
   1. Sulla base della concentrazione di collagene magazzino, calcolare il volume richiesto necessario per preparare 200 ml di soluzione di collagene O alla concentrazione finale.
5. Aggiungere 20 ml di 10 × tampone PBS lentamente la quantità richiesta di soluzione di collagene magazzino (calcolata al punto 3.4) con dolce vorticoso. Regolare il pH della miscela a pH finale con 0,1 M NaOH con l'uso di calibrato pH-metro. Vedere nota al punto 2.5 per quanto riguarda la regolazione del pH.
6. Portare la soluzione ad un volume finale di 200 microlitri con H ₂ O. Eseguire tutti i passi sul ghiaccio per evitare premature collagene polimerizzazione.
7. Prendete il piatto dal incubatrice dopo 45 min polimerizzazione del gel interno (vedi punto 3.3). Aggiungere delicatamente 180 microlitri di soluzione di O sulla parte superiore del gel interno, in modo che la soluzione copre completamente i internagel e riempie il pozzo (Figura 1B).
   1. Eseguire attentamente questo passo senza agitazione la soluzione, che può portare ad orientamenti fibre non uniformi nel gel esterno. Fare attenzione a non toccare il gel interno con un puntale, e per evitare la formazione di bolle o sacche d'aria. Se si forma un bolla, con attenzione ma rapidamente cercare di rottura sia o aspirare utilizzando un puntale. Posizionare delicatamente il piatto di nuovo in incubatrice per lasciare il gel polimerizzarli esterno.
8. Prendete il piatto dal incubatrice dopo 45 min di polimerizzazione. Il gel dovrebbe essere già abbastanza solidificato, a questo punto, anche se può ancora staccarsi dalla superficie inferiore se maneggiata.
   1. Versare delicatamente 2 ml di mezzo di coltura cellulare riscaldata al piatto (Figura 1C). Assicurarsi che il gel è completamente sommerso nel mezzo. Aggiornare la media ogni 2 - 3 giorni in tutta la durata della cultura.

4. Imaging Live-cell

1. Eseguire immagini utilizzando un microscopio confocale invertito dotato di capacità di imaging live-cell-lungo termine. Include un built-in camera di incubazione con una temperatura (37 ° C) e controllo CO ₂ (5%). Accendere il microscopio e riscaldare il palco, almeno 1 ora prima di avviare l'esperimento.
   Nota: Utilizzare lente obiettivo con lunga distanza di lavoro per ottimizzare l'osservazione e la localizzazione delle cellule in gel 3D.
2. Incubare il gel in terreno contenente 5 ml di colorante fluorescente inseguitore cellule per 30 minuti per consentire la localizzazione precisa delle cellule del sistema 3D. Successivamente, rimuovere il colorante mediante lavaggio tre volte con 1 × PBS. Successivamente, aggiungere mezzo di coltura cellulare al piatto.
3. Prendete il piatto dal termostato e posizionarlo sul palco microscopio (Figura 1D).
   Nota: l'imaging cellulare dal vivo può iniziare in linea di principio a destra dopo la polimerizzazione del gel esterno. Tuttavia, a questo punto, le cellule in i gel interni non sono ancora diffuse. Per esaminare la migrazione delle prime cellule che hanno invaso il gel esterna, live-cell imaging può iniziare 24 ore (a seconda del tipo di cellula) dopo l'inizio della coltura. Indicativamente, circa 12 - 14 giorni di coltura sono necessari per la maggior parte delle cellule del gel interno per immettere il gel esterno.
4. Selezionare Volumi di View (UTP di) nelle regioni del gel esterno che circonda il gel interno. Dopo 24 ore di incubazione, la popolazione cellulare sarà diffuso, attraversato l'interfaccia tra i gel interno ed esterno, e ha iniziato a invadere il gel esterno.
   1. Per il Vov di includere le regioni gel immediatamente accanto all'interfaccia gel, regioni intermedie, e le regioni vicino alla periferia del gel esterno ^7. Esclusione regioni più stretta di 50 micron dalla superficie inferiore e laterale, nonché dalla parte superiore del gel, per evitare possibili effetti di bordo. Ogni vov misura tipicamente 647 × 647 × 100 micron ³ (in x, Y e Z, rispettivamente), con intervallo di 5 micron di z impili.
5. Assicurare modalità di imaging, i canali / filtri, tempi di esposizione, e le risoluzioni di immagine sono selezionati correttamente. Per l'imaging senza etichetta della rete di collagene, utilizzare la microscopia confocale riflettanza simultaneamente durante il time-lapse imaging live-cell.
6. Prendere immagini di esempio, tracciare gli istogrammi di intensità, e regolare i guadagni e offset a osservare il segnale sufficiente e evitare la saturazione assicurando che l'istogramma si trova tra lo zero e l'intensità massima. Non modificare queste impostazioni più tutta la durata dell'esperimento.
7. Prendere immagini time-lapse dei VOV di selezionati, con un intervallo di tempo, Δ t, di 10 minuti per 8 ore (o più se necessario).

5. Monitoraggio cellulare e analisi dei dati

1. Effettuare immagine quantitative post-processing delle immagini impili z utilizzando appropria te software di elaborazione delle immagini.
   1. Segmento le immagini time-lapse per selezionare automaticamente le posizioni di cellule 3D in (x, y, z, t).
   2. Per ogni fotogramma, controllare manualmente la precisione di localizzazione e rimuovere i falsi positivi dovuti a detriti cellulari e sporgenze cellulari che potrebbero essere stati scambiati per le cellule. Rimuovere le cellule proliferative dall'analisi e le cellule sovrapposte o collegate dividere in oggetti distinti.
2. Generare tracce cellulari temporizzata 3D dalle coordinate di cella (x, y, z, t) ottenuti nella fase precedente collegando la posizione di ogni cella nella sequenza temporale.
3. Eliminare il rumore casuale e sistema rimuovendo tracce inferiori alla lunghezza di traccia soglia (tipicamente 20 min).
4. Correggere per la deriva del campione sottraendo gli spostamenti netti complessivi dai binari se necessario.
5. Calcolare spostamento delle cellule,iles / ftp_upload / 52735 / 52735eq2.jpg "width =" 80 "/>, e la distanza migrazione cellulare, , Dalle traiettorie cella osservati, dove è un vettore che rappresenta la posizione 3D di una cella al tempo ed è il numero totale di punti temporali.
   1. Calcolare velocità cella come S = d / (n • Δ t), dove Δ t è l'intervallo di tempo tra i fotogrammi. Calcola direzionalità migrazione cellulare (o persistenza) con P = Δd / d. Questa semplice misura di persistenza implica che per P = 0 lo spostamento netto è zero e per P = 1 la traiettoria è una linea retta direzionale.

Risultati

Il test gel concentrica qui presentato è stata effettuata utilizzando cellule di carcinoma mammario altamente invasive, MDA-MB-231, con 2,4 mg / ml di gel di collagene interna e una densità di semina cellulare di = 2 × 10 ⁶ cellule / ml, come esempio. Come mostrato in Figura 2, tipicamente dopo alcuni giorni di coltura, le cellule violato l'interfaccia gel interno-esterno e ha iniziato ad invadere il gel esterno. La popolazione di cellule diffuse prevalentemente radialmente verso l'...

Discussione

In this protocol we describe an in vitro assay to study the 3D migrational behavior of cells in matrix environments that topologically resemble ECMs encountered in vivo. There are three main strengths of this assay as compared to other currently available methods. First, this assay allows one to simultaneously examine the cell migration mechanisms at both population level and individual cell level. This opens up possibilities of studying collective cell migration¹³, which has to date been lar...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture incubator	Fisher Scientific Pte Ltd	Model: 371, S/No 318854-6055
Confocal microscope	Nikon A1R		Inverted confocal laser scanning microscope equipped with incubator chamber
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Life Technologies	11965-092
Fetal Bovine Serum (FBS)	Life Technologies	10082-147
Fluorescent CellTracker dye CMTMR	Life Technologies	C2927
Glass-bottom dish	IWAKI Cell Biology	3931-035	35 mm diameter dish with 12 mm diameter glass-bottom well
Hemocytometer	iN CYTO	DHC-N01 (Neubauer Improved)
Microprocessor pH meter	Hanna Instruments	pH 211
Nutragen Collagen	Advanced BioMatrix	#5010-D	Acid-solubilized bovine collagen type I (stock pH ~ 2)
Objective lens	Nikon		CFI Super Plan Fluor ELWD ADM 20XC, W.D. 8.2-6.9mm, NA 0.45.
Penicillin-Streptomycin	Life Technologies	15140-122
pH meter	Sartorius	S/No 29153352	Basic pH Meter PB-11
Trypsin-EDTA	Life Technologies	15400-054