Iniezioni intramuscolari Lungo le piastre Motor finale: un approccio mini-invasivo di navetta Tracers Direttamente nella Motor Neurons

Riepilogo

The efficacy of intramuscular uptake and retrograde transport of molecules to corresponding motor neurons depends on the location of the injection sites with respect to the motor end plates (MEPs). Here, we describe how to locate MEPs on skeletal muscles to optimise retrograde transport of tracers into motor neurons.

Abstract

Malattie che colpiscono l'integrità dei neuroni motori del midollo spinale sono tra le condizioni neurologiche più debilitanti. Durante gli ultimi decenni, lo sviluppo di diversi modelli animali di questi disturbi neuromuscolari ha fornito alla comunità scientifica con differenti scenari terapeutiche volte a ritardare o invertire la progressione di queste condizioni. Sfruttando la macchina retrograda dei neuroni, uno di questi approcci è stata quella di indirizzare i muscoli scheletrici, al fine di navetta geni terapeutici in corrispondenti motoneuroni del midollo spinale. Anche se una volta promettente, il successo dell'approccio consegna tale gene è stata ostacolata dal numero non ottimale dei motoneuroni trasdotte che finora ha dimostrato di cedere. Piastre terminali Motor (MEP) sono regioni altamente specializzati sulla muscolatura scheletrica che sono in contatto sinaptico diretto al midollo spinale α motoneuroni. A questo proposito, è importante notare che, finora, gli sforzi per retrogradotrasferimento di geni in neuroni motori sono stati effettuati senza riferimento alla posizione della regione MEP nei muscoli mirati. Qui, descriviamo un semplice protocollo 1) per rivelare la posizione esatta dei deputati sulla superficie dei muscoli scheletrici e 2) di utilizzare queste informazioni per guidare la consegna intramuscolare e successivo trasporto retrogrado ottimale di traccianti retrogradi in neuroni motori. Ci auguriamo di poter utilizzare i risultati di questi esperimenti che tracciano in ulteriori studi in indagando trasporto retrogrado di geni terapeutici per spinale neuroni motori cavo attraverso la destinazione dei deputati.

Introduzione

La perdita di controllo del movimento volontario che deriva da condizioni neurologiche come la malattia del motoneurone e spinal- nonché Duchenne atrofia muscolare è una condizione debilitante che ha un impatto elevato e duraturo sulla vita quotidiana di individui affetti. Negli ultimi dieci anni, gli sforzi di ricerca volti a fermare o almeno ritardare gli effetti deleteri di queste malattie neuromuscolari è stata una priorità per molti medici e scienziati di tutto il mondo. A questo proposito, la recente generazione di modelli animali che imitano queste malattie neuromuscolari è stato determinante per ottenere intuizioni fondamentali sui meccanismi fisiologici alla base dello sviluppo e la progressione di queste condizioni ^1-13. Il trattamento di queste malattie neuromuscolari richiede l'accesso diretto al midollo spinale e può essere ottenuto mediante iniezioni spinali ^14,15. I recenti progressi nella terapia genica hanno mirato i muscoli striati del superiore earti inferiori a navetta geni terapeutici ai corrispondenti motoneuroni α che si trovano all'interno del corno ventrale del midollo spinale ^1,9-13. Tuttavia, questa strategia una volta promettente non è riuscita a migliorare il risultato di queste condizioni neurologiche. Mentre è giusto concludere che questi poveri risultati potrebbero essere, almeno in parte, essere attribuibile alla bassa efficacia di questi geni protettivi, non si può escludere la scarsa efficacia di questi metodi di trasferimento genico.

Piastre laterali del motore (deputati) sono regioni specializzate delle miofibre scheletriche che sono rientrati dai terminali degli assoni di fibre motorie periferiche di grandi dimensioni provenienti da α motoneuroni. Insieme, le terminazioni delle fibre nervose periferiche e gli eurodeputati formano la giunzione neuromuscolare, cioè il luogo in cui gli impulsi sinaptici sono attivati ​​dal rilascio anterograda del neurotrasmettitore, l'acetilcolina. È importante sottolineare che il rapporto tra le fibre nervose periferiche e gli eurodeputati è bi-tivazionale, anche se diversi motori sono responsabili per il trasporto di molecole e organelli verso e via dal neurone somata ^16-18. Alla luce di queste considerazioni anatomiche, i deputati sembrano essere gli obiettivi di scelta per la consegna e il successivo trasporto retrogrado di materiale genetico alle corrispondenti motoneuroni. In questo contesto, non è sorprendente che il successo del motoneurone trasduzione dipende molto dalla distanza tra l'iniezione intramuscolare di vettori virali e europei del muscolo ^19-20. Sorprendentemente, tuttavia, la posizione esatta delle zone MEP sulle miofibre di ratto e topo di laboratorio, le due specie di scelta per modellare malattie neuromuscolari, non erano disponibili fino a poco tempo.

Abbiamo prodotto le mappe complete della regione MEP per diversi muscoli degli arti anteriori nel ratto e nel topo ^21-22. Più di recente, abbiamo mostrato i dettagli dell'organizzazione del deputato rEgion per diversi muscoli della arti posteriori del mouse ²³ e stiamo attualmente analizzando le caratteristiche dei deputati sulla arti posteriori del ratto. Nelle nostre mani, iniezioni intramuscolari di traccianti retrogradi diretti alle intere zone MEP in questi muscoli hanno dato luogo a neuroni motori più marcati che si abbracciano segmenti del midollo spinale di più di quanto precedentemente riportato. Presentiamo qui il protocollo che è stato sviluppato negli ultimi anni per rivelare la posizione dei deputati sulla superficie esterna e per tutto lo spessore e hindlimb forelimb muscoli sia nel topo e nel ratto.

Protocollo

Tutte le procedure sperimentali qui descritte conformi alla Cura e Comitato Etico degli animali di UNSW Australia e sono stati eseguiti in conformità con il Servizio Sanitario Nazionale e il Medical Research Council of Australia regolamenti per la sperimentazione animale. Tutte le procedure di questo protocollo devono essere effettuate in conformità ai requisiti del proprio comitato Animal Care and Ethics.

1. Acetilcolinesterasi istochimica colorazione

1. Preparare la miscela di reazione Acetilcolinesterasi
   1. Aggiungere 290 mg di acetiltiocolina ioduro a 200 ml di tampone fosfato 0,1 M (PB). Mescolare con un agitatore magnetico a 900 rpm.
   2. Aggiungere 600 mg di glicina sotto continua agitazione.
   3. Aggiungere lentamente 420 mg di solfato di rame alla miscela di reazione sotto agitazione continua fino a quando il prodotto è completamente sciolto.
2. Togliere la pelle sulla carcassa animale (ottenuto attraverso la condivisione dei tessuti) facendo incisioninella pelle di un ratto o topo perfuso, afferrando la pelle dalla zona del collo e tirandolo oltre i suoi piedi. Assicurarsi che la fascia che copre ogni muscolo o è rimosso o significativamente forato per garantire un'ampia esposizione delle fibre muscolari alla soluzione di reazione.
3. Immergere l'intero corpo o di un arto di interesse nella miscela di reazione e incubare O / N a 4 ° C.
4. Lavare la carcassa per 2 minuti in acqua distillata. Nota: In questa fase, i muscoli mostrano una colorazione blu e le piastre terminali del motore (MEP) possono essere visti come punti bianchi.
5. Esporre la carcassa ad una soluzione di solfuro di ammonio 10% per 3-5 sec.
   Nota: Le fibre muscolari saranno ben presto diventano marroni e gli eurodeputati saranno osservabili come punti neri macchiati. Se la reazione avviene troppo rapidamente, e le fibre muscolari sono macchiati troppo buio per distinguere tra i deputati e le fibre muscolari provare utilizzando basse concentrazioni di soluzione di solfuro di ammonio (per esempio, 5%). Il tempo di reazione per ottenere laottimale contrasto tra i deputati e le fibre muscolari varia da un campione all'altro. Pertanto è difficile definire il tempo di esposizione esatta al reagente. La reazione deve essere attentamente monitorata e si fermò quando il contrasto è ritenuto adeguato.
6. Lavare la carcassa per due volte, con l'agitazione in acqua distillata e tamponare delicatamente la carcassa secca.
7. Fotografia sia gli aspetti laterale e mediale degli arti, assicurando che i deputati europei per tutti i muscoli di interesse vengono catturati.

2. intramuscolare iniezioni alle piastre Motor End

1. Tirare micropipette di vetro con un estrattore micropipetta (l'uso di micropipette graduate con pistoni è consigliato). Con l'aiuto di un microscopio da dissezione, rompere le punte delle micropipette con un paio di pinze in modo tale che il diametro interno del lume della micropipetta è circa 0,5 mm.
2. Assicurarsi che tutti gli strumenti chirurgici utilizzati sono appena sterilizzati in autoclave e thnella zona chirurgica è sterile.
3. Riempire le micropipette con Fluoro-oro (5% in acqua distillata).
4. Induce anestetizzare l'animale in una camera di induzione con isofluorano (4% in O _2). Verificare la presenza di riflesso di raddrizzamento e di garantire la sua assenza prima di rimuoverlo dalla camera di induzione. Fissare un cono sul muso del topo e fornire isofluorano (2% in O ₂₎ per il mantenimento dell'anestesia. Pinch dita dei piedi degli animali e toccare delicatamente gli occhi dell'animale per garantire che sia il ritiro del pedale e i riflessi corneali sono assenti. Nota: Una miscela di ketamina e xylazil può essere utilizzato anche (80 e 10 mg / kg, rispettivamente, trasportato via intraperitoneale). La ketamina è un allegato 8 ("Controllo"), di droga e protocolli necessari connessi con l'acquisto, l'uso, lo stoccaggio e lo smaltimento del farmaco dovrà essere rispettato.
5. Applicare lubrificante occhio per evitare l'essiccazione degli occhi nel corso del procedimento.
6. Shave il tarto argeted e uso garza per pulire la zona rasata con tre scrub alternati di clorexidina e il 70% di alcol. Trasferire l'animale per l'area chirurgica.
7. Posto l'animale su un underpad pulito e posizionarla in modo appropriato per garantire un buon accesso al muscolo (s) mirato.
8. Utilizzare un paio di pinze con le prese dente per sollevare la pelle sopra il muscolo mirato dalla muscolatura sottostante e fare un'incisione nella pelle con le forbici chirurgiche. Assicurarsi che l'incisione è abbastanza grande per esporre completamente i muscoli (s) di interesse. Assicurarsi che vi sia il minimo disturbo per la fascia.
9. Utilizzare le fotografie MEP per trasporre mentalmente la posizione e la forma della regione MEP sul muscolo (s).
   Nota: un pennarello multa potrebbe aiutare a riprodurre la regione eurodeputato dalla fotografia sul muscolo (s) di interesse.
10. Eseguire iniezioni multiple lungo la lunghezza della regione MEP (per Fluoro-Gold, 3 o 4 iniezioni di 1-2 ml ogni should essere sufficiente). Pulire delicatamente il muscolo (s) per rimuovere eventuali infiltrazioni.
11. Portare le due estremità della pelle incisa ravvicinati con una pinza smussato e chiudere la ferita con clips chirurgiche. Infiltrarsi 0,1 ml Bupivacaine (0,5% in acqua) (o altri anestetici locali) lungo l'intero arco della ferita.
12. Spegnere la macchina anestetico fuori e monitorare l'animale fino a quando non è completamente ripreso dall'anestesia.
13. Attendere per 14 giorni tra la somministrazione delle iniezioni intra-muscolare e la perfusione degli animali.

3. perfusione

1. Somministrare una dose letale di soluzione di sodio pentobarbitone (es Lethabarb; 150 mg / kg) per l'animale mediante iniezione intraperitoneale.
   1. Strettamente monitorare l'animale fino a raggiungere un livello profondo di anestesia, come confermato dall'assenza di ritiro pedale e riflessi corneali.
2. Posizionare l'animale sulla sua schiena su una tavola di dissezione posto sopra un perfusion lavandino.
3. Utilizzare un paio di pinze con le prese dente per sollevare la pelle che ricopre la base dello sterno. Fai una piccola incisione cutanea con un paio di forbici chirurgiche forti immediatamente sotto lo sterno e poi usare il forcipe per afferrare la cartilagine xifoideo dello sterno. Tenendo la cartilagine xifoide, allargare l'incisione su entrambi i lati della cavità toracica, dallo sterno alle ascelle.
4. Tagliare il diaframma per esporre il cuore.
   1. Iniettare 0.ml di eparina direttamente nella punta del cuore per evitare la coagulazione del sangue.
   2. Tagliare il vertice per consentire l'inserimento di una cannula nel ventricolo sinistro, e quindi serrare rapidamente la cannula in posizione con l'ausilio di un emostatico.
   3. Fare un'incisione nell'atrio destro con un paio di forbici fini e iniziare immediatamente la pompa peristaltica. Profumato con 0,1 M PB finché il liquido in uscita dell'atrio è quasi privo di sangue e il colore del fegato diventa marrone chiaro. Poi, profumato con una soluzione di paraformaldeide (4% in 0.1 M PB) finché l'intero corpo dell'animale diventa rigida.

4. cervicale midollo spinale Dissection e preparazione per Istologia

1. Posare la carcassa animale sul suo addome.
2. Tagliare la pelle in linea mediana del corpo con un bisturi e rifletterla dalla base del cranio al livello dell'osso iliaco.
3. Tagliare e riflettere i muscoli paravertebrali per esporre la parte dorsale della colonna vertebrale.
4. Identificare il processo spinoso ossea di Atlante, il secondo segmento cervicale (cioè, C2), e rimuoverlo con un paio di pinze chirurgiche o rongeurs per individuare la radice dorsale sottostante corrispondente.
   1. Identificare il diritto radice C2 e colorare con un pennarello permanente.
   2. Rimuovere il prossimo vertebre uno per uno e contrassegnare le radici dorsali destra con colori alternati (cioè, C2, C4, C6, C8 e può essere colorato in verde e C3, C5, C7, T1 può essere colORed in blu).
5. Usare un piccolo ago chirurgico (ad es, 30 G ago calibro) per forare delicatamente attraverso la dura copre l'estremità inferiore del midollo spinale. Con la smussatura dell'ago rivolto verso l'alto, sollevare la dura madre dal cavo mentre si muove l'ago rostrally per fare una fessura longitudinale.
   1. Riflettere la dura.
6. Tagliare il trasversalmente midollo spinale in blocchi uno o due segmenti con una nuova lama di bisturi.
   1. Lasciare i segmenti del midollo spinale in situ e, per ciascun blocco, fare attenzione un piccolo segno fiducial sul lato sinistro di ciascun blocco con metà strada tra due bisturi radici adiacenti. Assicurarsi che il marchio fiducial è abbastanza profonda attraverso il tessuto da essere visibili dalla faccia ventrale dei blocchi. Trasformare il marchio fiducial con un angolo di circa 45 °, indicando sia anteriormente o posteriormente rispetto alla anatomia animale, per facilitare l'orientamento del segmento tissutale conseguente dissezione.
7. Raccogliere i singoli blocchi in piccoli flaconi chiaramente etichettate contenenti una soluzione di paraformaldeide (4% in 0.1 M PB) e lasciare a RT O / N.
8. Trasferire i blocchi in puliti, bottiglie etichettate chiaramente contenenti una soluzione di saccarosio (30% in 0.1 M PB) e conservare a 4 ° C per almeno due giorni.
9. Posizionare i segmenti in crio-stampi e ricoperto con terreno di congelamento dei tessuti. Per la preparazione longitudinale istologica, orientare i blocchi con la parte dorsale rivolto verso l'alto e utilizzare il marchio fiduciale per orientare il blocco nella crio-stampi.
10. Congelare le crio-stampi a -20 ° C e tagliare con un criostato in 50 sezioni micron di spessore. Nota: Le sezioni possono essere montati direttamente su vetrini da microscopio adesione e lasciati asciugare O / N. In alternativa, le sezioni possono essere galleggiare in piastre 48 pozzetti riempiti con 0.1 M PB e successivamente montati usando il marchio fiduciale di orientare le sezioni di tessuto nelle diapositive.

5. vertebrale lombare Cord dissezione e preparazione per Istologia

1. Posare la carcassa animale sulla sua schiena.
2. Eseguire un'incisione mediana lungo l'addome dell'animale e rimuovere le viscere. Sezionare i muscoli della parete addominale posteriore per esporre la parte ventrale della colonna vertebrale.
3. Individuare il breve costola caudale-più e la sua adiacente T13 vertebra dove la T13 radice ventrale esce l'osso.
   1. Consecutivamente rimuovere uno per uno rostrale due o tre vertebre a T13 (cioè, T12, T11 e, se necessario, T10) con sottili Rongeurs chirurgici per seguire il T13 radice ventrale fino al suo punto di entrata nella parte ventrale del cavo ventrale segnare con un pennarello permanente.
   2. Da questo punto in poi, ripetere la stessa procedura per identificare la posizione dei punti di ingresso della radice ventrale per L1, L2, L3, L4, L5, L6 e S1, li colorazione con colori alternati.
4. Seguire la stessa procedura descritta nella sezione 4,5-4,10 per lumbar dissezione del midollo spinale.

Risultati

Acetilcolinesterasi colorazione istochimica rivela la posizione delle piastre terminali del motore attraverso l'ampiezza dei muscoli. La Figura 1 illustra i risultati di tale colorazione eseguita su un intero zampa anteriore di ratto. Si suggerisce di ottimizzare la concentrazione della soluzione di solfuro di ammonio (ad es., 5-7% invece del 10%) e il momento in cui il campione viene immerso nella soluzione se lo sfondo non specifico macchie sulle fibre muscolari è troppo eccessiva.

Discussione

Il targeting intramuscolare e successivo trasferimento retrograda di transgeni terapeutici ai corrispondenti motoneuroni α per il trattamento sperimentale condizione neuromuscolare non è una nuova strategia. Per esempio, questo metodo di consegna è stato utilizzato per ritardare la degenerazione neuromuscolare in diverse fasi della progressione ALS in topi e ratti ^1,9-12 SOD1 nonché nei topi con SMA ^13. Mentre promettente, l'efficacia di questi scenari di terapia genica è stata limitata. A...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fluoro-Gold	Fluorochrome, LLC	Nil	Diluted to 5%
Drummond PCR Micropipets 1-10 µl	Drummond Scientific	5-000-1001-X10	accompanied with plungers
Acetylthiocholine Iodide	Sigma Life Science	A5751-25G
Copper(II) Sulfate Anhydrous	Sigma-Aldrich	61230-500G-F
Tissue-Tek O.C.T Compound	Sakura Finetek	25608-930
Glycine	Ajax Finechem	1083-500G
Dextran, Tetramethylrhodamine and biotin	Life Technologies	D-3312	Diliuted in distilled water
Isothesia	Provet	ISOF00	1000 mg/g Isoflurane inhalation vapour
Autoclip 9 mm Wound Clips	Texas Scientific Instruments, LLC	205016
Lethabarb Enthanasia Injection	Virbac (Australia) Pty Ltd.	LETHA450
Formaldehyde Solution	Ajax Finechem	A809-2.5L PL
SuperFrost Plus glass slides	Menzel-Glaser	J1800AMNZ
Ammonium Sulphide	Sigma-Aldrich	A1952	Diluted to 10%
Marcain Spinal 0.5% (Bupivacaine hydrochloride)	Astrazenca		Diluted to 0.25%