Generation e Multi-fenotipica Screening-Alto contenuto di<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Mutants transposon

Riepilogo

Coxiella burnetii è un batterio Gram-negativi obbligato intracellulare responsabile della zoonotici malattia febbre Q. Qui si descrivono i metodi per la generazione di Coxiella mutanti di trasposoni fluorescente nonché l'identificazione automatizzata e l'analisi dei risultanti internalizzazione, replica e citotossici fenotipi.

Abstract

Invasione e la colonizzazione delle cellule ospiti di batteri patogeni dipendono dall'attività di un gran numero di proteine ​​procariotiche, definite come fattori di virulenza, che può sovvertire e manipolare funzioni host chiave. Lo studio delle interazioni ospite / patogeno è quindi estremamente importante per comprendere le infezioni batteriche e di sviluppare strategie alternative per combattere le malattie infettive. Questo approccio tuttavia, richiede lo sviluppo di nuovi saggi high throughput per la imparziale, l'identificazione automatica e la caratterizzazione dei determinanti di virulenza batterica. Qui, si descrive un metodo per la generazione di una libreria mutante GFP-tagged by trasposone mutagenesi e lo sviluppo di screening ad alto contenuto di approcci per l'identificazione simultanea di più fenotipi trasposoni-associata. Il nostro modello di lavoro è intracellulare batterica burnetii patogeno Coxiella, l'agente eziologico della febbre zoonosi Q, che è associato con sévere epidemie con un conseguente onere sanitario e economico. La natura obbligato intracellulare di questo patogeno è, fino a poco tempo, gravemente ostacolato l'identificazione dei fattori batterici coinvolti nella patogeno ospite, rendendo di Coxiella il modello ideale per l'attuazione di approcci high-throughput / alto contenuto.

Introduzione

L'emergente, batterio endemico Coxiella burnetii è responsabile di grandi epidemie di febbre Q, una debilitante zoonosi simil-influenzale con grave salute e l'impatto economico ^1. I principali serbatoi di Coxiella sono animali domestici e da fattoria, e si stima che oltre il 90% dei bovini da latte negli Stati Uniti portano C. burnetii ^2. Gli esseri umani sono ospiti accidentali che vengono infettati da inalazione di aerosol contaminati. Febbre Q umana si manifesta sia come una malattia acuta o cronica, che può avere complicanze fatali, con un tasso di mortalità raggiunge il 65% ^1,3. Con una dose infettiva di 1 - 10 organismi, Coxiella è il patogeno più infettiva noto ed è stato studiato come potenziale arma bio ^4. La recente epidemia esplosiva di febbre Q nei Paesi Bassi (2007 - 2010), con casi crescente da 182 a più di 2.000 all'anno, si pone come un esempio della grave virulenza di questo patogeno^5.

La notevole efficienza di infezioni Coxiella è probabilmente associata con la sua resistenza allo stress ambientale, in combinazione con il suo adattamento unico di ospitare le cellule. Infatti, Coxiella è presente nell'ambiente sotto forma di varianti metabolicamente inattive a piccole cellule (SCV), che sono notevolmente resistenti alle diverse condizioni difficili (essiccamento, temperatura, etc.). Distributori sono up presa da fagociti via α _V β ₃ integrine ⁶ mentre l'invasione delle cellule non fagocitiche è mediato dal Coxiella adesione / invasione OmpA ⁷ e un recettore non ancora identificato. Dopo l'assorbimento, Coxiella risiede in vacuoli aderenti, positivi per i marcatori endosomali primi Rab5 e EEA1 ^8. I batteri rispondono a endosomiale acidificazione convertendo alle varianti a grandi cellule metabolicamente attive (LCV) e l'attivazione di un sistema di secrezione di tipo 4 Dot / Icm (T4SS) ⁹, Altamente omologa a quella di Legionella pneumophila ^10. La secrezione di effettori Dot / ICM consente coxiella di generare un grande vano acido LAMP1-positivo contenente enzimi lisosomiali attivi dove i batteri possono prosperare e attivamente proteggere le cellule infette da apoptosi ^11. Pertanto, il ciclo di intracellulare Coxiella è controllata dalla traslocazione Dot / Icm-mediata di effettori batterici ^12, tuttavia, i fattori microbici coinvolti nell'invasione cellula ospite, replicazione batterica e la diffusione dell'infezione sono generalmente poco noti.

La combinazione di trasposoni mutagenesi e analisi basate sulla fluorescenza, stiamo sviluppando approcci imparziali per l'identificazione simultanea di fattori batterici coinvolti nelle fasi principali di infezioni Coxiella: 1) internalizzazione all'interno delle cellule ospiti, 2) la replica intracellulare, 3) spread cella-a-cella e 4) la persistenza. Fino ad oggi, abbiamo proiettato oltre 1.000 mutations in 500 sequenze Coxiella codificanti, che ci ha fornito intuizioni senza precedenti nelle interazioni ospite-patogeno che regolano Coxiella patogenesi ^7. Da notare, questo approccio può essere applicato allo studio di altri patogeni intracellulari che condividono caratteristiche di biologia cellulare con Coxiella.

Protocollo

1. Generazione di una libreria di GFP-tagged Coxiella mutanti trasposoni

Manipolare Coxiella burnetii RSA439 NMII in un livello di biosicurezza di contenimento 2 (BSL-2) in cabina di sicurezza microbiologica (MSC) in conformità con le normative locali. Se compatibile con il modello batterico usato, passaggi di ripetizione da 1.4.1 a 1.4.4 per aumentare la probabilità di ottenere mutanti clonali. Un tipico biblioteca mutante è composto (almeno) di un numero di mutanti che è pari a tre volte il numero di sequenze codificanti annotati nel genoma dell'organismo utilizzato.

1. Preparazione di electrocompetent Coxiella RSA439 NMII:
   1. Preparare 1x ACCM-2 ^13: 13.4 mM di acido citrico, citrato di sodio 16,1 mM, potassio fosfato 3.67 mM, 1 mM di cloruro di magnesio, 0,02 mM di cloruro di calcio, 0,01 mM solfato di ferro, 125,4 mM cloruro di sodio, 1,5 mM di L-cisteina, 0,1 g / L Bacto Neopeptone, 2,5 g / L acidi Casamino, 1 g / L di metile beta ciclodestrina, 125 ml / L RPMI. Regolare il pH a 4,75 e sterilizzare il filtro (non sterilizzare in autoclave). Nota: Liquid ACCM-2 è stabile a 4 ° C per circa 1 mese.
   2. Seminare 100 ml di ACCM-2 con 2 x 10 ⁶ genoma equivalente (GE) / ml di Coxiella RSA439 NMII (da uno stock batterica precedentemente generato e quantificati come al punto 1.5) dalle scorte -80 ° C e distribuire la sospensione batterica in 75 cm ² cellulari fiasche di coltura con tappi di sfiato (10 - 15 ml di sospensione batterica per bombola). Grow per 7 giorni a 37 ° C in atmosfera umidificata al 5% di CO ₂ e 2,5% O _2.
   3. PISCINA La sospensione batterica conseguente provette da 50 ml e centrifugare a 3.900 g per 1 ora a 4 ° C.
   4. Eliminare il surnatante e risospendere il pellet in 30 ml di glicerolo al 10%. Centrifugare a 3.900 xg per 1 ora a 4 ° C.
   5. Risospendere il pellet in un volume adeguato di 10% glicerolo (tipicamente 2 ml) e aliquota 50 microlitri in tubi 500 microlitri. Mantenere risospeso bacteria in ghiaccio durante l'intero processo. Nota: In questa fase, i batteri sono electrocompetent ed un'aliquota è sufficiente effettuare una elettroporazione. Le sospensioni batteriche possono essere conservati a -80 ° C per 6 mesi o essere utilizzati direttamente per l'elettroporazione di DNA plasmidico.
2. Elettroporazione di Coxiella competente transposon- e plasmidi-trasposasi codifica:
   Nota: per il seguente protocollo, l'elemento trasponibile e il trasposasi sono codificati da due plasmidi diversi (pitr-CAT-GFP e pUC19-Himar1C9, rispettivamente) ^7. Entrambi i plasmidi non hanno un origine di replicazione-specific Coxiella, rendendoli plasmidi suicidio quando elettroporate in Coxiella. Questo assicura inserzione di trasposoni stabili. L'elemento trasponibile contiene una cassetta di resistenza cloramfenicolo sotto il controllo del promotore p1169 Coxiella per la selezione e il gene GFP ai sensi del regolamento del p.311 promotore Coxiella per contrassegnare i mutanti generati con GFP.
   1. Pre-raffreddare un 0,1 centimetri elettroporazione cuvetta per 10 min in ghiaccio. Mescolare 50 ml di electrocompetent Coxiella con 10 mcg transposon plasmide e 10 microgrammi di plasmide trasposasi ^7. Assicurarsi che concentrazione plasmide è superiore a 500 pg / ml per minimizzare diluizione del glicerolo.
   2. Elettroporazione utilizzando la seguente configurazione: 18 kV, 500 Ω, 25 uF. Assicurarsi che la costante di tempo risultante è compreso tra 9 e 13 msec.
   3. Aggiungere immediatamente 950 ml di RPMI, risospendere i batteri elettroporate e trasferire in una provetta con tappo a vite e mantenerlo a temperatura ambiente.
   4. Prendete 200 ml di batteri elettroporate e aggiungere 3 ml di ACCM-2 integrato con 1% di calore-inattivato siero fetale bovino (FBS) in 6 pozzetti. Aggiungere 88 ml di DMSO al volume residuo di batteri elettroporate (per raggiungere una concentrazione finale del 10% DMSO) e conservare a -80 ° C.
3. Selezione dei mutanti di trasposoni:
   1. Incubate le piastre da 6 pozzetti inoculate come descritto sopra (1.2.4) overnight a 37 ° C in atmosfera umidificata al 5% di CO ₂ e 2,5% O _2. Aggiungere gli antibiotici appropriati (375 mg / ml kanamicina o 3 mg / ml cloramfenicolo). Incubare la coltura batterica per 3 giorni aggiuntivi nelle condizioni sopra descritte.
4. L'isolamento dei singoli mutanti:
   1. Preparazione di solidi ACCM-2 piastre e la placcatura di Coxiella mutanti trasposoni
      Nota: Seguendo le istruzioni sono per 1 piastra di Petri, diverse diluizioni di colture batteriche devono essere testati per valutare il volume ottimale inoculazione per l'isolamento delle colonie.
      1. Riscaldare 10,5 ml di 0,5% agarosio in un forno a microonde e lasciarlo raffreddare in un bagno d'acqua a 55 °. Riscaldare 11,25 ml di 2x ACCM-2 (pH 4,75) a 37 ° C.
      2. Preparare agarosio fondo:
         1. Mescolare 10 ml di 0,5% agarosio fuso con 10 ml di 2x ACCM-2 e aggiungere antibiotici appropriati (375 mcg / ml kanamicina o 3ug / ml cloramfenicolo).
         2. Versare immediatamente nella piastra di Petri. Tenere il piatto unlidded Petri, lasciare raffreddare il mezzo per 30 minuti e asciugare all'aria per 20 minuti.
      3. Preparare top agarosio:
         1. Mescolare 1,25 ml di 2x ACCM-2 con 0,75 ml di acqua in un tubo di polistirene da 5 ml, aggiungere gli antibiotici appropriati (375 mcg / ml kanamicina o 3 mg / ml cloramfenicolo) e incubare a 37 ° C.
         2. Aggiungere la coltura batterica (in genere 1 a 100 ml) e vortex per 5 sec.
         3. Aggiungere 0,5 ml di agarosio fuso, mescolare e versare immediatamente sul agarosio fondo.
         4. Lasciare raffreddare per 20 min, sostituire il coperchio sulla piastra di Petri e incubare a 4 ° C per 20 min per facilitare la solidificazione agarosio.
         5. Lasciare asciugare all'aria per 20 minuti in un unlidded MSC. Grow piastre a 37 ° C in atmosfera umidificata al 5% di CO ₂ e 2,5% O ₂ da 6 a 7 giorni.
   2. Aggiungere DMSO alle restanti battericulture l per raggiungere una concentrazione finale del 10% DMSO e conservare a -80 ° C.
   3. Valutare la diluizione ottimale come segue: assicurare che le colonie sono 0,5 a 1 mm di diametro e sono adeguatamente isolate per evitare la contaminazione incrociata. Scongelare rimanenti colture batteriche dal punto 1.4.2 e la piastra alla diluizione appropriato ACCM-2 agar come descritto in 1.4.1.2 e 1.4.1.3. Incubare per 6-7 giornate di cui al 1.4.1.3.5.
   4. Una volta che le colonie sono rilevabili, raccogliendoli tagliando la fine di una punta 1 ml, raccogliendo la spina contenente colonie isolate e disperdere la colonia pipettando in 1,5 ml di ACCM-2 contenente gli antibiotici appropriati (375 mg / ml kanamicina o 3 mg / ml cloramfenicolo) in una piastra da 24 pozzetti. Amplifica singole colonie per 6 giorni, nelle condizioni descritte al punto 1.3.1. Il giorno 3 di incubazione, disperdere le macchie batteriche pipettando ogni cultura.
   5. Conservare ogni sospensione mutante in tubi di tappo a vite con codice a barre 2D in piastre da 96 pozzetti in 10% DMSO a -80 ° C.
5. La valutazione della concentrazione batterica:
   Nota: il seguente protocollo può essere applicata per ottenere curve di crescita di mutanti batterici replicano in mezzo axeniche (vedi 1.4.4).
   1. Standard di preparazione della curva:
      1. Preparare una soluzione / azione ml 2 mg di dsDNA (tipicamente un plasmide casuale di dimensioni note e concentrazione) in 1x Tris-EDTA (TE). Preparare 10 diluizioni seriali dalla soluzione madre di ottenere concentrazioni comprese tra 2 mg / ml a 2 ng / ml. Dispensare 50 ml di ciascuna concentrazione di singoli pozzetti di una micropiastra a 96 pozzetti con pareti nere e fondo (vedi tabella dei Materiali).
      2. Diluire la quantificazione reagente dsDNA 1: 200 in tampone 1x TE e aggiungere 55 ml di reagente diluito a ciascun campione nella micropiastra a 96 pozzetti. Mescolare bene con un agitatore e incubare per 2 a 5 min a temperatura ambiente, al buio.
      3. Misurare la fluorescenza dei campioni con una fluorescenzalettore di micropiastre nce e filtri per le lunghezze d'onda standard di fluoresceina (eccitazione ~ 480 nm, emissione ~ 520 nm).
      4. Tracciare l'intervallo di concentrazione plasmide contro le letture di intensità di fluorescenza.
   2. Batterica sospensione quantificazione:
      1. Dispensare 5 ml di 10% Triton X-100 per bene in una micropiastra a 96 pozzetti con pareti nere e fondo (vedi tabella dei Materiali). Aggiungere 50 ml di sospensioni batteriche a ciascun pozzetto ed incubare 10 minuti a temperatura ambiente, su un agitatore.
      2. Diluire la quantificazione reagente dsDNA 1: 200 in tampone 1x TE e aggiungere 55 ml di reagente diluito a ciascun campione nella micropiastra a 96 pozzetti. Mescolare bene con un agitatore e incubare per 2 a 5 min a temperatura ambiente, al buio.
      3. Misurare la fluorescenza dei campioni mediante un lettore di micropiastre a fluorescenza e filtri per le lunghezze d'onda standard di fluoresceina (eccitazione ~ 480 nm, emissione ~ 520 nm).
      4. Per ottenere l'batterica DNUna concentrazione, tracciare le letture di fluorescenza nel grafico ottenuto al punto 1.5.1.4. Dividere la concentrazione di DNA dalla massa del genoma Coxiella (2,2 fg) per ottenere concentrazioni batteriche. Esprimere i risultati in Genome / ml equivalenti.
      5. Scartare mutanti che presentano un difetto di crescita significativa in ACCM-2.

2. Single Primer colonia PCR, Sequencing, e annotazione

Nota: il seguente protocollo è per l'amplificazione del DNA di 96 campioni, una pipetta multicanale è consigliato per i seguenti passaggi. Depurazione Colonna di prodotti PCR con sfere magnetiche e sequenziamento del DNA con un primer specifico per trasposone (2,3) sono in subappalto a una società esterna.

1. Assicurarsi che il primer di amplificazione è progettata per ibridare tra 100 e 200 basi coppie monte della ripetizione tandem invertita (ITR), per ottenere prodotti PCR che coprono il sito di inserzione del trasposone su Coxiellun genoma. Preparare 3 ml di miscela PCR (1x tampone alta fedeltà, 200 micron dNTP, 1 micron di amplificazione di primer, 20 U / ml alta fedeltà DNA polimerasi) ed erogare 29 microlitri per bene in un pozzo-96 piastra PCR impostato su ghiaccio. Trasferimento 1 ml di ogni mutante in fase stazionaria in ACCM-2 al mix PCR.
2. Eseguire PCR con denaturazione iniziale (98 ° C, 1 min), 20 cicli di alta stringenza (98 ° C, 10 sec; 50 ° C, 30 sec; 72 ° C, 90 sec), 30 cicli a bassa stringenza (98 ° C, 10 sec; 30 ° C, 30 sec; 72 ° C, 90 sec) e 30 cicli stringenza elevate (98 ° C, 10 sec; 50 ° C, 30 sec; 72 ° C, 90 sec) seguita da una estensione finale a 72 ° C per 7 minuti.
3. Purificare prodotti PCR utilizzando sfere magnetiche e la sequenza di DNA con un primer specifico per trasposone. Progettare il primer specifico trasposone con una temperatura di fusione prevista compresa tra 50 ° C e 75 ° C, un contenuto di GC tra il 40% e il 60%, una lunghezza compresa tra 18 e 25 nucleotidi e una si ricotturate a valle del sito di ibridizzazione di amplificazione primer e almeno 100 coppie di base a monte della prima coppia di basi della ITR trasposone.
4. Utilizzando il software di analisi di sequenza, caricare il completo, genoma commentata di Coxiella burnetii 493 NMI. Utilizzare la funzione "align di riferimento" per caricare e allineare (BLASTN) i risultati di sequenziamento e determinare il sito di trasposizione. Eliminare mutanti con i non-matching e / o la visualizzazione doppio reads.To monitorare la saturazione della biblioteca mutante, tenere un registro del verificarsi di molteplici inserzione di trasposoni nello stesso sito.

3. Cellule eucariotiche Sfida da Coxiella Mutanti e la sorveglianza degli intracellulare crescita

Nota: una pipetta multicanale è consigliato per i seguenti passaggi. Le infezioni sono state eseguite in triplicato in sterili 96 pozzetti con pareti nere e fondo piatto trasparente. burnetii peso Coxiella esprimono GFP ¹⁴ wcome previsto dal Dr. Robert Heinzen.

1. Grow cellule Vero in RPMI senza rosso fenolo integrato con 10% di siero fetale bovino (FBS) in assenza di antibiotici (RPMI completo media).
2. Il giorno prima infezione, lavare cellule Vero da un confluenti o sub-confluenti pallone di coltura di cellule con 10 ml di PBS.
3. Staccare cellule Vero aggiungendo 1 ml di soluzione di tripsina EDTA al pallone di coltura cellulare e incubare per 3 a 5 min a 37 ° C in atmosfera umidificata al 5% CO _2.
4. Risospendere le cellule in 10 ml di media RPMI completo. Contare le cellule e preparare una sospensione cellulare di 10 ⁵ cellule per ml.
5. Pipettare 100 microlitri della sospensione di cellule in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti con fondo piatto nero trasparente.
6. Centrifugare per 5 minuti a 400 xg a RT per facilitare l'adesione delle cellule al fondo dei pozzetti e incubare durante la notte a 37 ° C in atmosfera umidificata al 5% CO _2.
7. Scongelare le piastre a 96 pozzetti contenenti il Comutanti xiella a temperatura ambiente e diluire 150 ml di sospensione batterica in 300 ml di RPMI senza rosso fenolo e FBS in un pozzo profondo piastra da 96 pozzetti.
8. Rimuovere i supporti dal micropiastra contenente cellule Vero e dispensare 100 l / pozzetto di mutanti Coxiella diluiti (MOI di 100). Utilizzare pozzetto A1 come negativo (cellule non infette) di controllo e di pozzi A2 e A3 come controlli positivi (cellule infettate con peso Coxiella esprimono GFP ¹⁴ a molteplicità di infezione (MOI) di 100 e 200).
9. Centrifugare la piastra per 10 minuti a 400 xg a temperatura ambiente usando un portatarga centrifuga a tenuta di aerosol.
10. Incubare a 37 ° C in atmosfera umidificata al 5% di CO ₂ per 2 ore quindi sostituire i batteri contenenti terreno con 100 microlitri / pozzetto di fresco, mezzo completo RPMI.
11. Misurare fluorescenza GFP quotidiana per 7 giorni, utilizzando un lettore di micropiastre a fluorescenza e filtri per le lunghezze d'onda standard di fluoresceina (eccitazione ~ 480 nm, emissione ~ 520 nm). Evitareinterferenza dovuta alla condensazione e la dispersione del segnale nel mezzo di coltura, utilizzare eccitazione fondo e la registrazione di emissione sul lettore di micropiastre.

4. Preparazione dei campioni per Automated Image Acquisition

Nota: La procedura è per una piastra a 96 pozzetti, scalare i volumi di conseguenza. A pochi passi dalla 4.2 possono usufruire di una rondella di piatto.

1. Il 7 ^° giorno dall'infezione, rimuovere terreno dalla piastra e sostituirla con 50 ul / pozzetto di fresco, terreno completo contenente un colorante fluorescente permeabile cella alla diluizione appropriata (generalmente 1: 1.000, di essere ottimizzato secondo la linea cellulare utilizzata ). Incubare le cellule per i 30 - 60 min a 37 ° C in atmosfera umidificata al 5% CO _2.
2. Sostituire media con 50 microlitri / pozzetto di 4% paraformaldeide (PFA) in PBS, incubare per 30 min a temperatura ambiente (RT) quindi rimuovere il buffer contenente PFA e lavare 3 volte con PBS.
3. Rimuovere PBS e dispense 50 ml / pozzetto di soluzione bloccante (0,5% di albumina di siero bovino, 50 mM NH ₄ Cl in PBS, pH 7,4) integrato con 0,05% saponina. Incubare a temperatura ambiente per 30 min.
4. Sostituire soluzione bloccante con 40 microlitri / pozzetto di soluzione di saturazione fresco supplementato con saponina (come sopra) e con un anticorpo anti-LAMP1 ad una diluizione 1: 500. Incubare la piastra per 30 minuti a RT.
5. Rimuovere soluzione bloccante e lavare la piastra a 96 pozzetti 5 volte con 100 microlitri / pozzetto di PBS.
6. Dispensare 40 ml / pozzetto di soluzione bloccante integrato con saponina (come sopra), l'anticorpo secondario fluorescente appropriato (ad una diluizione di 1: 1.000) a rivelare l'anticorpo anti-LAMP1 applicato al passo 4.4, e con Hoechst 33258 a 5 mcg / ml. Incubare la piastra per 30 minuti a RT.
7. Rimuovere soluzione bloccante e lavare la piastra a 96 pozzetti 5 volte con 100 microlitri / pozzetto di PBS. Lasciare il volume di PBS corrispondente all'ultima lavaggio nella piastra a 96 pozzetti, le cellule fissate non devono asciugare.
8. Immagine del piatto immediatamente o piastra conservare a 4 ° C, al riparo dalla luce, per successive analisi.

5. Acquisizione di immagini

1. Acquisire le immagini nella GFP (488 nm, batteri), la Hoechst 33258 (350 nm, cellula ospite nuclei), rosso (~ 555 nm, membrana cellulare marcatore) e rosso lontano (~ 615 nm, LAMP1) i canali utilizzando un microscopio a epifluorescenza automatizzato attrezzate con un obiettivo 20X. Acquisire 21 campi indipendenti per pozzetto per immagine un minimo di 5000 cellule per campione. Applicare messa a fuoco automatica utilizzando il canale nuclei cellula ospite come riferimento. Quando si lavora con batteri patogeni infettare una bassa percentuale di cellule ospiti, l'utente può regolare il numero di campi indipendenti imaged per pozzetto, per ottenere un minimo di 500 cellule infettate da analizzare.

Elaborazione 6. Immagine

Nota: i seguenti passaggi sono specifici per l'utilizzo del CellProfiler immagine software di analisi. In tutti i casi, il algorit ottimalehm per la segmentazione deve essere definito sperimentalmente e gli oggetti a contatto con il bordo dell'immagine dovrebbe essere eliminata con l'apposita funzione.

1. Carica tutte le immagini in CellProfiler.
2. Utilizzare il modulo "ImageMath" per sottrarre il canale GFP dal canale Hoechst, per evitare il rilevamento di colonie Coxiella (anche etichettati da Hoechst) come nuclei cellulari ospitante, nei seguenti passaggi.
3. Utilizzare il modulo "IdentifyPrimaryObjects" ai nuclei delle cellule ospitanti segmento dall'immagine risultante della fase 6.2. Nome oggetti segmentati "nuclei".
4. Utilizzare il modulo "IdentifySecondaryObjects" per le cellule ospiti segmento dai 555 immagini nm utilizzando i nuclei rilevati al punto 6.3 come semi. Nome i segmentati oggetti "Cellule".
5. (Facoltativo) Utilizzare il modulo "IdentifyTertiaryObjects" sottrarre nuclei individuati al punto 6.3 da cellule individuate al punto 6.4. Nome oggetti segmentati "Citoplasma221 ;.
6. Utilizzare il modulo "EnhanceOrSuppressFeatures" sui 615 immagini nm per rimuovere lo sfondo e facilitare la seguente identificazione dei compartimenti LAMPADA1-positivi.
7. Utilizzare il modulo "IdentifyPrimaryObjects" a l'immagine ottenuta al punto 6.6 per identificare i compartimenti LAMPADA1-positivi. Nome i segmentati oggetti "lisosomi".
8. Utilizzare il modulo "IdentifyPrimaryObjects" l'immagine 488 nm a identificare colonie Coxiella. Nome oggetti segmentati "colonie".
9. Utilizzare il modulo "IdentifySecondaryObjects" sui 615 immagini nm per identificare vacuoli-Coxiella contenente utilizzando le colonie Coxiella rilevati al passo 6.8 come semi. Nome oggetti segmentati "CCVS".
10. Utilizzare il modulo "MaskObjects" per selezionare CCV rilevati sulle cellule (come sono state eliminate le cellule che toccano il bordo dell'immagine, alcuni CCV possono essere rilevate cellule "fuori"). Nome resOggetti ulting "CCV filtrati".
11. Utilizzare il modulo "MaskObjects" per selezionare colonie rilevate sulle cellule (come sono state eliminate le cellule che toccano il bordo dell'immagine, alcune colonie possono essere rilevate cellule "fuori"). Nome gli oggetti risultanti "Colonie filtrati".
12. Utilizzare il modulo "MaskObjects" per associare lisosomi alle cellule. Nome gli oggetti risultanti "filtrato lisosomi".
13. Utilizzare il modulo "MaskObjects" per selezionare le celle che contengono colonie Coxiella. Nome gli oggetti risultanti "cellule infette".
14. Utilizzare il modulo "Relate oggetti" per impostare gli oggetti "CCVS Filtrato" come figli delle "celle" oggetti padre. Ciò consentirà contando il numero di CCV / Cell.
15. Utilizzare il modulo "Relate oggetti" per impostare gli oggetti "Colonie Filtrato" come figli degli oggetti padre "celle". Questo saràconsentire contando il numero di colonie / Cell.
16. Utilizzare il modulo "Relate oggetti" per impostare gli oggetti "filtrato lisosomi", come figli degli oggetti padre "Cellule". Ciò consentirà contando il numero di lisosomi / Cell.
17. Utilizzare il modulo "MeasureObjectSizeShape" per ottenere una analisi morfologica dei nuclei, cellule, ccvs filtrati, Colonie filtrato e filtrato lisosomi
18. Utilizzare il modulo "MeasureObjectIntensity" per quantificare la fluorescenza GFP associata a filtrata CCV e valutare l'efficienza di replicazione Coxiella all'interno CCV.
19. Utilizzando i moduli "OverlayOutlines" e "SaveImages" sovrapporre i risultati di segmentazione e l'immagine originale per il controllo qualità.
20. Utilizzare il modulo "ExportToSpreadsheet" per esportare tutto o una selezione dei risultati di analisi di immagine.
21. (Opzionale) Utilizzare il modulo "ExportToDatabase" per analizzare i risultatiutilizzando il software Analyst CellProfiler.

Analisi 7. I dati

1. Per ogni parametro ottenuto, identificare ed eliminare valori erratici (a causa di errori di segmentazione delle immagini) quindi calcolare i valori medi per ogni mutante.
2. Utilizzare Z-score per identificare fenotipi significativi. Considerare fenotipi con un Z-score> -2 come non significativa, fenotipi con un Z-score tra -2 e -4 come mite e fenotipi con ≤ Z-score -4 forte.
3. Combinazioni trama dei parametri in base alle esigenze sperimentali.

Risultati

Dopo l'isolamento di mutanti di trasposoni, singola colonia innesco PCR è un robusto, metodo di high-throughput per identificare il sito di inserimento trasposoni per ogni mutante. Questo approccio deriva da un tipico protocollo nested PCR ma qui un singolo innesco ibrida specificamente e / o non specifico per il DNA template seconda della rigorosità della temperatura di ricottura (Figura 1A). I prodotti tipici di PCR costituiti da più frammenti di DNA, la maggior parte dei quali sono specifici (Figura 1B). L'uso di un diverso Primer di sequenziamento che annealing proprio a monte della ITR trasposone, ed a valle della sequenza riconosciuta da primer di amplificazione prevede specificità per la fase di sequenziamento (Figura 1C). Software automatizzato per l'analisi di sequenza allinea le sequenze ottenute al genoma Coxiella fornendo il luogo esatto di inserzione di trasposoni (Figura 1C). Tutti inserzione di trasposoni possono essere quindi annotated sul genoma Coxiella (Figura 1D).

Ogni mutante Coxiella è isolata e amplificata in condizioni asettiche in ACCM-2 di media prima di uno stoccaggio o di screening. La Figura 2 illustra un esempio di 38 mutanti di trasposoni in 16 punti / ICM geni Coxiella (Figura 2A). Per valutare la fattibilità di mutanti Coxiella, curve di crescita axeniche sono ottenute campionando colture batteriche per 7 giorni post-inoculazione e l'applicazione del test di concentrazione batterica descritto in 1.5 (Figurie 2B). Mutanti amplificati vengono poi incubate con cellule epiteliali, in triplicato piastre a 96 pozzetti per 7 giorni. Tutti i mutanti Coxiella generati essendo GFP-tag, curve di crescita intracellulari sono ottenute misurando l'intensità di fluorescenza GFP di ogni pozzetto, ogni 24 ore, e riportando i valori misurati in funzione del tempo (Figura 2C).

Intrcurve di crescita acellulari forniscono analisi quantitativa dei fenotipi associati con ogni inserimento trasposoni nel genoma Coxiella. Per aggiungere informazioni qualitative sugli stessi mutanti di trasposoni, abbiamo optato per l'acquisizione automatica delle immagini e analisi. Sette giorni dopo l'infezione, le piastre sono fissate, trasformati per immunofluorescenza come descritto in 4 e analizzati utilizzando un processo automatizzato, microscopio a epifluorescenza come descritto nella 5. immagine automatica software di analisi come CellProfiler (Broad Institute, www.cellprofiler.com ) elabora i canali acquisiti oggetti per analisi comparative (figura 3) in modo indipendente e segmenti identificati. Questo consente l'identificazione e la caratterizzazione morfologica dei nuclei ospitanti cellulari, contorni di cellule, lisosomi e Coxiella colonie (Figura 3 pannelli superiori). Correlazione colonie Coxiella con le cellule ei lisosomi permette ai Identificatisu e specifiche analisi morfologica di Coxiella vacuoli -non (che sono LAMP1 positivi, Figura 3 pannello in basso a sinistra). Correlazione colonie Coxiella con contorni della cellula ospite consente l'identificazione e specifica analisi morfologica delle cellule infette (Figura 3 pannello in basso al centro). Infine, i 4 canali vengono uniti per scopi di controllo qualità illustrazione e (Figura 3 in basso pannello di destra).

I dati ottenuti da analisi delle immagini automatizzata possono essere tracciati uno contro l'altro per ottenere "grafici a dispersione multi-fenotipiche". Come esempio, nella Figura 4A zona media (in micron ²⁾ di colonie Coxiella è tracciata contro il numero di colonie per cella (Figura 4A), al fine di identificare mutazioni che influenzano la replicazione intracellulare di Coxiella (replica fenotipo) e / o la capacità dei batteri di invadere le cellule ospiti (internalization fenotipo). L'analisi statistica è stata usata per definire le regioni nel risultante grafico a dispersione corrispondente a lievi (-4 (Figura 4A, puntini rosa e rosso); mutazioni che hanno interessato Coxiella internalizzazione nelle cellule sono state raggruppate nella parte inferiore del grafico (Figura 4A, blu chiaro e scuro punti) e, infine, i punti verdi nella regione più a destra della trama corrisponde a mutazioni conseguente fenotipi non significativi ( Z-score> -2). È importante sottolineare che, mutanti che non riescono a replicare, ma sono ancora in grado di invadere le cellule ospiti, vengono rilevati dopo 7 giorni di infezione da batteri singoli o piccole colonie, adiacente ad ospitare nuclei delle cellule (Figura 4C, secondo pannello). Pertanto, la dimensione di Coxiella colo "Nies "sarà influenzato in modo significativo, ma il numero delle cellule infette non varierà rispetto alle cellule -infected WT Coxiella. Al contrario, le mutazioni che influenzano la capacità di Coxiella di invadere cellule ospiti determinano una diminuzione del numero di colonie / cellule. Quando questo numero è significativamente inferiore a 1, indica che, in media, vi è una diminuzione del numero complessivo di cellule infette. In alternativa, l'area media (in micron ²⁾ delle colonie Coxiella può essere tracciata contro il numero di cellule ospiti sopravvissute infezione (Figura 4B), per identificare mutazioni che conferiscono citotossicità di Coxiella (fenotipo citotossico). Come sopra, l'analisi statistica è stata usata per definire le regioni nel risultante grafico a dispersione corrispondente a lievi (-4 Figura 3B). 37 mutazioni sopravvivenza della cellula ospite forma lieve (Figura 3B, punti luce rossa), e 7 mutazioni erano particolarmente dannoso per ospitare sopravvivenza cellulare (figura 3B, puntini rossi scuri). Si noti che i parametri addizionali ottenute dall'immagine procedura di analisi automatica possono essere usate per derivare altri grafici, a seconda delle esigenze sperimentali.

Figura 1:. Sequencing e annotazione di Coxiella mutanti di trasposoni (A) primer colonia singola PCR è usato per amplificare frammenti di DNA contenenti il sito di inserimento trasposoni. Un primer di amplificazione (Amp) è utilizzato sia come primer specifici e non specifici a seconda della rigorosità della temperatura di ricottura. (B) Tipico risultato di singola colonia di primer PCR. Ogni riattisu produce una serie di frammenti di dimensioni variabili, alcune delle quali contengono il sito di inserzione trasposone; alcuni altri sono amplificati casualmente come sottoprodotti della bassa stringenza ciclo PCR. (C) L'uso di un primer di sequenziamento (Seq) che ibridizza alla sequenza trasposone permette il sequenziamento dei frammenti di interesse. Software (D) Le analisi della sequenza consente l'annotazione automatica di inserzione di trasposoni sul genoma batterico. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2:. Axeniche e la crescita intracellulare di Coxiella mutanti di trasposoni (A) Nella schermata pilota, abbiamo isolato, sequenziato e proiettato 38 mutanti di trasposoni in 16 nucleo gEnes del sistema di secrezione dot / ICM Coxiella (indicati in rosso). (B) Al fine di valutare la fattibilità di ogni mutante trasposoni, la crescita di ogni isolare in terreno di coltura axeniche viene monitorata in 8 giorni utilizzando una fluorescenza tagged agente intercalante del DNA. (C) Ogni mutante viene quindi utilizzato per infettare cellule epiteliali. Come il trasposone possiede una cassetta GFP, la crescita batterica intracellulare è monitorato oltre 7 giorni di infezione, seguendo le variazioni di fluorescenza GFP associata con la replica Coxiella, usando un lettore per micropiastre. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3: analisi delle immagini automatizzata delle infezioni Coxiella Un auto.microscopio a epifluorescenza accoppiate viene utilizzato per l'immagine di 21 posizioni per pozzetto di triplicato piastre da 96 pozzetti. I segmenti software di analisi dell'immagine oggetti in ogni canali acquisiti per la quantificazione e analisi. In tutti i casi, sono esclusi oggetti toccano il bordo delle immagini. (A) Il canale Hoechst è utilizzato per identificare i nuclei della cellula ospite (cerchiato in verde). (B) Questi sono usati come semi per identificare contorni della cellula ospite nel canale Cy3 (la posizione dei nuclei è cerchiato in blu, contorni cellulari sono in verde). (C) Il canale Cy5 è utilizzato per identificare compartimenti LAMPADA1-positive (cerchiato in verde); solo gli oggetti inclusi nei contorni di cellule individuate in precedenza (in rosso) sono conservati per l'analisi delle immagini. (D) Il canale GFP viene utilizzato per identificare colonie Coxiella (cerchiato in verde). (E) Correlazione colonie Coxiella con scomparti LAMPADA1 positivo permette l'identificazione di Coxiella vacuoli -contenenti (CCV); solo gli oggetti inclusi nei contorni di cellule individuate in precedenza (in verde) sono conservati per l'analisi delle immagini. (F) Correlazione colonie Coxiella con contorni cellulari permette l'identificazione delle cellule infette (pseudocolored). (G) Le immagini acquisite nei 4 canali di fluorescenza (corrispondente a colonie Coxiella (verde), nuclei delle cellule ospite (blu), membrana plasmatica della cellula ospite (grigio), compartimenti LAMPADA1-positivo (rosso)) vengono fuse e utilizzata per l'illustrazione e la qualità controllo. Scala bar 10 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4: identificazione su larga scala dei fattori coinvolti nella Coxiella host / patogeno interagisconoioni. (A) La superficie media (in micron ²⁾ di colonie Coxiella è tracciata contro il numero relativo di colonie per cella, per identificare replica e internalizzazione fenotipi di interesse. Punti verdi rappresentano fenotipi che si discostano da WT coxiella da un Z-score> -2 (non significativo). Rosa e puntini blu rappresentano replica e internazionalizzazione fenotipi, rispettivamente, con un Z-score tra -2 e -4 (fenotipi lievi). Rosso e puntini blu scuro rappresentano fenotipi con Z-score ≤ -4 (fenotipi forti). (B) La superficie media (in micron ²⁾ delle colonie Coxiella è stata tracciata contro il numero totale di cellule infettate (e non infetti) sopravvissute 7 giorni di infezione per valutare l'effetto citotossico risultante dalla inserzione di trasposoni. Punti verdi rappresentano fenotipi che si discostano da WT coxiella da un Z-score> -2 (non significativo). Puntini rosa rappresentano citotossico phenotypes con Z-score tra -2 e -4 (fenotipi lievi). I punti rossi rappresentano fenotipi citotossici con Z-score ≤ -4 (fenotipi forti). Le frecce indicano mutanti illustrate dal corrispondente lettera minuscola in C. (C) Immagini rappresentative della replica, internalizzazione e fenotipi citotossici. In tutti i casi, i nuclei delle cellule ospiti sono in rosso, colonie Coxiella sono in verde. Scala bar 50 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussione

Lo studio delle interazioni ospite / patogeno ha dimostrato di essere un metodo notevole per capire infezioni batteriche e sviluppare strategie alternative per contrastare malattie infettive. Tuttavia, a causa della diversità delle strategie elaborate da diversi batteri patogeni, l'identificazione e la caratterizzazione di fattori di virulenza batterici e dell'ospite vie di segnalazione che sono indirizzate durante le infezioni rappresentano una vera e propria sfida. Ciò richiede lo sviluppo di nuovi approcci per l'identificazione su larga scala dei nodi principali di interazione ospite / patogeno. Il recente sviluppo di prodotti innovativi, ad alto throughput e tecniche di screening ad alto contenuto rappresenta una preziosa risorsa che può essere adattato allo studio di batteri patogeni intracellulari ^15. Qui, abbiamo usato il zoonotici batterica patogeno coxiella burnetii come modello per sviluppare approcci di screening che combinano transposon mutagenesi e analisi basate sulla fluorescenza. Importantemente, questo metodo di screening consente il monitoraggio simultaneo di molteplici fasi del ciclo intracellulare Coxiella, fornendo una panoramica globale delle strategie sviluppate da questo batterio di invadere, replicare e persistono all'interno delle cellule infette.

L'approccio qui descritto si basa su due tecniche ben consolidate, trasposone mutagenesi e saggi basati sulla fluorescenza, che sono state applicate con successo allo studio di batteri patogeni. Combinando queste tecniche nel contesto di schermi ad alta produttività / elevato contenuto permette di valutare gli effetti di un elevato numero di mutazioni batteriche analizzando un numero molto elevato di eventi (tipicamente 15.000 cellule infettate per mutazioni batteriche vengono esposte e analizzati). Ciò fornisce un importante analisi statistica di eventi come invasione batterica delle cellule ospiti e la replica intracellulare, che sono, per natura, ad una elevata variabilità. È importante notare che le linee cellulari diverse epithelial può essere utilizzato per questo tipo di screening. Tuttavia, le cellule epiteliali piatte e grandi sono ottimali per l'analisi delle immagini come organelli delle cellule ospiti sono più facili da individuare. Poiché la maggior parte dei microscopi automatici può gestire automaticamente un gran numero di piatti, non ci sono limiti al numero di mutanti che possono essere proiettati contemporaneamente. A seconda del patogeno, il privilegio utente può l'uso di un epifluorescenza o un microscopio confocale. Il tempo di acquisizione dell'immagine sarà principalmente dipende dalla sensibilità della telecamera microscopio, il numero di campi acquisiti per pozzetto e dal numero di canali acquisiti per campo di vista. L'utente può decidere come regolare questi fattori per ottimizzare il protocollo di screening. A titolo di esempio, abbiamo ripreso una 96-pozzetti / h utilizzando le condizioni di cui al punto 5.1. L'analisi delle immagini dipende in gran parte la macchina (o cluster di macchine) utilizzato. Usiamo un 12-core (2 x 3,06 GHz 6-Core), 48 GB di RAM workstation. La macchina richiede approxirca 40 minuti per analizzare le immagini acquisite da una piastra.

Un aspetto importante da prendere in considerazione nella preparazione di queste analisi è la messa a punto di nuovi (o l'ottimizzazione di protocolli esistenti) per consentire la manipolazione e il trattamento di un gran numero di campioni. Un esempio tipico è lo sviluppo della singola colonia di primer PCR approccio, che ha permesso di amplificare rapidamente e frammenti di sequenza di DNA contenenti Coxiella il sito di inserimento di ciascun trasposone, da campioni molto piccoli. Sulla base della nostra esperienza, la polimerasi ad alta fedeltà deve essere attentamente selezionati e testati per ottenere risultati riproducibili. L'unica limitazione di questo approccio può nascondere nell'osservazione che, nella maggior parte dei casi, circa il 30% dei campioni trattati non sono sfruttabili, sia a causa della PCR o la procedura di sequenziamento. Tuttavia, considerando che l'isolamento di nuovi mutanti di trasposoni Coxiella non è un fattore limitante, questo non rappreinviato un grosso problema. Analogamente, lo sviluppo di un test affidabile per quantificare la concentrazione batterica delle scorte mutanti è stato fondamentale per questo approccio. A causa della tendenza ad aggregarsi Coxiella quando in sospensione, l'uso di letture di densità ottica non è applicabile per calcolare la concentrazione di culture Coxiella e l'unica alternativa esistente era PCR quantitativa (qPCR). Qui, l'uso di un DNA agente intercalante fluorescente contrassegnati notevolmente accelerato batteri quantificazione.

Questo approccio può anche sfruttare l'uso di linee cellulari stabili esprimenti marcatori fluorescenti per diversi compartimenti intracellulari seconda patogeno utilizzato. Un altro aspetto importante è l'uso di colture cellulari privo di rosso fenolo. Abbiamo osservato che questo indicatore pH ha una fluorescenza naturale attraversa spettro rosso e verde che satura il segnale registrato sul lettore di fluorescenza automatizzato.

Tegli strategia qui presentata si basa su casuale mutagenesi trasposoni. Per i mutanti di interesse, si consiglia di convalidare trasposizioni unici (e clonalità) con Southern blot e PCR amplificazioni del sito di inserimento trasposoni.

Oltre al materiale descritto nella sezione protocollo, squadre interessate a utilizzare l'approccio di screening qui presentato, avranno grande vantaggio nel set up di un database relazionale per la raccolta dati, un server per la memorizzazione dei dati e di una stazione di lavoro per l'analisi delle immagini rapida.

È importante sottolineare che il metodo qui descritto è adatto per lo studio di altri patogeni batterici intracellulari fornito un metodo di mutagenesi casuale esiste per il patogeno, linee cellulari possono essere infettati dal patogeno e questo mostra un fenotipo specifico durante l'infezione.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Citric acid	Sigma	C0759-500G	ACCM-2 medium component
Sodium citrate	Sigma	S4641-500G	ACCM-2 medium component
Potassium phosphate	Sigma	60218-100G	ACCM-2 medium component
Magnesium chloride	Sigma	M2670-100G	ACCM-2 medium component
Calcium chloride	Sigma	C5080-500G	ACCM-2 medium component
Iron sulfate	Sigma	F8633-250G	ACCM-2 medium component
Sodium chloride	Sigma	S9625-500G	ACCM-2 medium component
L-cysteine	Sigma	C6852-25G	ACCM-2 medium component
Bacto Neopeptone	BD (Beckton-Dickinson)	211681	ACCM-2 medium component
Casamino acids	BD (Beckton-Dickinson)	223050	ACCM-2 medium component
Methyl-B-cyclodextrin	Sigma	C4555-10G	ACCM-2 medium component
RPMI w/glutamax	Gibco	61870-010	ACCM-2 medium component
RPMI w/glutamax, without phenol red	Gibco	32404-014	For cell culture and infection
Fetal bovine serum	GE healthcare	SH30071	For cell culture
Trypsin EDTA (0.25%)	Life Technologies	25200-056	For cell culture
Saponin	Sigma	47036	For immunofluorescence staining
Ammonium chloride	Sigma	A9434	For immunofluorescence staining
Bovine serum albumin	Sigma	A2153	For immunofluorescence staining
Electroporation cuvette 0.1 cm	Eurogentec	ce0001-50	For Coxiella transformation
Trackmates screw top tubes with caps	Thermo Scientific	3741	2D barcoded screwcap
96-well microplate with black walls and bottom	Greiner	655076	Flat dark bottom, for dsDNA quantitation
96-well PCR microplate	Biorad	2239441	DNAse/RNAse free
96-well plate, deepwell	Labcon	949481	For Coxiella mutants infections
PicoGreen	Life Technologies	P7581	For dsDNA quantitation
Triton X-100	Sigma	T9284-500ML	For dsDNA quantitation
Phusion high fidelity DNA polymerase	New England Biolabs	M0530L	For single primer colony PCR
Celltracker Red CMTPX	Life Technologies	C34552	For imaging
Anti-LAMP1 antibody	Sigma	94403-1ML	For immunofluorescence staining
Hoechst 33258	Sigma	L1418	For imaging
Fluorescence microplate reader Infinite 200 Pro	Tecan
Epifluorescence automated microscope Cellomics	Thermo Scientific