Atomic Force Microscopy Imaging e Spettroscopia Forza supportati doppi strati lipidici

Riepilogo

We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

Abstract

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force.

The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.

Introduzione

Atomic Force Microscopy (AFM) genera un'immagine di una superficie di scansione attraverso l'area del campione utilizzando una mensola con una punta molto affilata ^1. Il movimento del cantilever sonda la topologia superficiale del campione. AFM è stato ampiamente applicato alle molecole biologiche - come proteine, DNA e membrane, grazie alla sua versatilità nell'analisi campioni fissati in aria o stato quasi native nel liquido ^2-5.

Oltre alla sua capacità di imaging ad alta risoluzione in nanometri, il cantilever AFM agisce come una molla per sondare forze di interazione (adesione e repulsione) e le proprietà meccaniche del campione di ^5,6. Questo è noto come spettroscopia di forza. In questa modalità, la prima sonda si avvicina al campione e esercita una forza su di esso, allora viene retratto fino perde contatto con il campione (Figura 1A). Le curve generate mostrano forza in funzione della distanza del cantilever sia per l'applicazionescarafaggio e retrazione. Diversi proprietà incluso il modulo elastico per misurare la rigidità di un materiale, e le forze di adesione possono essere derivati.

Bistrati lipidici supportati sono membrane biologiche modello situata sulla sommità di un supporto solido - solitamente mica, vetro borosilicato, silice fusa, o ossidato silicio ^7. Sono preparati utilizzando varie tecniche come vescicole deposizione, metodo Langmuir-Blodgett e spin-coating ^8,9. L'imaging AFM è stato utilizzato per seguire la formazione di questi bistrati supportati ^10, e sonda diverse strutture formate da membrane di diverse composizioni ^11-15.

Esecuzione di spettroscopia di forza su bistrati risultati supportati in un picco nella curva approccio. Questo picco indica la forza necessaria per perforare il doppio strato, e si chiama forza rivoluzionaria. Lo spessore doppio strato può essere misurata utilizzando la curva della forza ^6. La forza innovativa tipica di bistratirange compreso tra 1-50 nN ^6. Queste proprietà dipendono imballaggio lipidi (liquido o gel fase) e la struttura (acil lunghezza della catena e il grado di insaturazione) e modificata da agenti membrana attiva ^16. La teoria dietro la rottura è stato spiegato ^{il 17} ed altri parametri sperimentali come cantilever morbidezza, il raggio e la velocità di punta approccio influenzare anche la forza rivoluzionaria ^15,16,18. Spettroscopia di forza è stato utilizzato per analizzare le proprietà di diverse fasi lipidiche ^11,19, composizione-dipendente cambiamenti ^12,20, così come gli effetti di altre biomolecole, quali peptidi, sulla stabilità della membrana ^21.

L'orientamento piatta di bistrati supportati è vantaggioso per combinare AFM con altri metodi come la risonanza plasmonica superficiale ²² e microscopia a fluorescenza ^11,19 per meglio caratterizzare struttura e le proprietà delle membrane.

Questo video proto dettagliatacol lo scopo di preparare i doppi strati lipidici supportati con vescicole deposizione e analizzarli con AFM e spettroscopia di forza. Mentre vescicole di varie dimensioni possono essere usati per preparare bistrati, questo protocollo si concentra sulle piccole e grandi vescicole unilamellari. Bistrati supportati quella fase separano in liquido ordinato (L _o) e disordinati (L _d) fasi liquide sono state caratterizzate ^11,15. La membrana è composta di-oleoyl-fosfatidilcolina (DOPC), sfingomielina (SM) e colesterolo (Chol) a 2: 2: 1 ratio. Questi modelli di composizione delle zattere lipidiche, che sono proposti a comportarsi come piattaforme importanti per il traffico di proteine ​​e di smistamento, segnalazione cellulare e altri processi cellulari ^23,24.

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Protocollo

1. Preparazione di doppi strati lipidici supportati (SLB) ^11,12,21

1. Preparazione di lipidi miscela e multilamellari vescicole Sospensioni
   1. Preparare i seguenti buffer in anticipo.
      1. Preparare tampone PBS a concentrazioni di 2,7 mM KCl, 1,5 mM KH ₂ PO _4, 8 mM Na ₂ HPO _4, e 137 mM NaCl, pH 7,2.
      2. Preparare SLB (bistrato lipidico supportato) tampone a concentrazioni di NaCl 150 mM, HEPES 10 mM, pH 7,4.
      3. Preparare una soluzione di 1 M CaCl _2.
   2. Sciogliere le seguenti lipidi in cloroformio a una concentrazione desiderata: ad esempio, di-oleoyl-fosfatidilcolina (DOPC) a 25 mg / ml, sfingomielina (SM) a 25 mg / ml e colesterolo (Chol) a 10 mg / ml.
   3. Prendere 18,38 ml di DOPC, 17,10 ml di SM e 11.30 ml di Chol per ottenere una soluzione con 1 mg di lipidi totali in rapporto 2: 2: 1 DOPC: rapporto molare Chol: SM. Variare i volumi di conseguenza, basandosi sul concentrations dei lipidi preparate in 1.1.2. Tuttavia, mantenere il rapporto molare di 2: 2: 1 DOPC: SM: Chol, come cambiando il rapporto molare cambierà le caratteristiche di fase della membrana ^25.
   4. Mescolare la soluzione completamente nel vortex. Aggiungere un colorante fluorescente lipidico a 0,05 moli% se si desidera visualizzare il doppio strato con un microscopio a fluorescenza.
      Nota: La famiglia di dialkylcarbocyanines a catena lunga, come ha fatto, DII e DiO abbracciano una vasta gamma di lunghezze d'onda e possono essere utilizzati in posizione ideale per etichettare membrane lipidiche. In alternativa, i lipidi fluorescente, come rodamina-fosfatidiletanolamina o BODIPY-colesterolo possono essere utilizzati. In ogni caso, la concentrazione del colorante deve essere ottimizzato in base all'impostazione microscopia, tenendo presente che alte concentrazioni di fluoroforo legato al lipide possono modificare il comportamento lipidica ^19.
   5. Asciugare il cloroformio con N ₂ gas (o qualsiasi gas inerte disponibili come Ar e He).
   6. Ulteriore t seccoegli lipidico miscela sotto vuoto per almeno 1 ora.
      Nota: Se si conserva questa miscela lipidica, eliminare l'aria con gas inerte (N _2, Ar o He) e conservare a -20 ° C. Aliquota lipidi-in-cloroformio in eccesso in piccole fiale marrone. Asciugarli in un modo simile come la miscela di lipidi, spostare l'aria con gas inerte (N _2, Ar o He) e conservare a -20 ° C.
   7. Sciogliere i lipidi essiccati in tampone PBS ad una concentrazione di 10 mg / ml.
   8. Vortex la miscela vigorosamente per circa 20 secondi a 1 minuto per ottenere una sospensione torbida, contenente vescicole multilamellari. Assicurarsi che il non ci sono film lipidici sporgenti ai lati del flacone.
   9. Distribuire la sospensione in 10 aliquote microlitri (1 mg di lipidi rende 10 aliquote).
   10. Conservare a -20 ° C fino all'utilizzo.
2. Preparazione di unilamellari vescicole
   Nota: I vari formati di vescicole unilamellari possono essere preparate con il metodo sonicazione o il metodo di estrusione. Sonicazione utilizza sound energia per agitare la miscela e separare gli strati della sospensione multilamellare. Questo è indicato da ripulire della sospensione nebuloso. Estrusione costringe le vescicole multilamellari passare attraverso un filtro a membrana con dimensione dei pori definito.
   1. Metodo Sonicazione
      1. Prendete i 10 ml di sospensioni lipidiche multilamellari e aggiungere 150 ml di tampone SLB.
      2. Trasferire il composto in piccoli (2 ml) fiale di vetro ricoperti e sigillare con Parafilm.
      3. Sonicare la miscela a temperatura ambiente in un bagno sonicatore per 10 minuti o fino a quando diventa chiaro per produrre piccole vescicole unilamellari (SUV, inferiore a 50 nm di diametro).
   2. Metodo di estrusione
      1. Prendete i 10 ml di sospensioni lipidiche multilamellari e aggiungere 150 ml di tampone SLB.
      2. Trasferire la sospensione in un tubo criogenico.
      3. Congelare la sospensione lipidica immergendo il tubo criogenico per alcuni secondi in azoto liquido.
      4. Scongelare lasospensione lipidica immergendo il tubo criogenico in un bagno d'acqua a temperatura ambiente oa 37 ° C per alcuni minuti. Ripetere le fasi gelività almeno 10 volte.
      5. Per estrudere la sospensione lipidica, usare una membrana di policarbonato con dimensioni 200 nm pori (altre dimensioni dei pori sono disponibili come, 100 nm o 400 nm) e di un dispositivo di estrusione commerciale ^26.
         Nota: Attualmente, ci sono due dispositivi estrusori disponibili in commercio: un estrusore manuale è disponibile per piccoli volumi (200 microlitri a pochi ml). In questo caso, il campione viene estruso attraverso la membrana spingendo manualmente la sospensione avanti e indietro tra due siringhe. A seconda del produttore, aliquote lipidi dovrebbero essere combinati per raggiungere volume minimo del set up. Per i volumi più grandi (fino a 50 ml) sono utilizzati dispositivi più sofisticati in cui la sospensione è forzato attraverso la membrana di policarbonato utilizzando gas compresso. Condizioni di impianto e di estrusione possono cambiare in base alla model. Consultare le istruzioni del produttore prima dell'uso. Questo protocollo si riferisce al estrusore manuale per piccoli volumi.
      6. Equilibrare l'estrusore in acqua facendo passare l'acqua attraverso l'estrusore. Immergere la membrana in acqua.
      7. Posizionare la membrana tra i due pistoni, montare il dispositivo ed equilibrare in tampone, facendo passare il buffer attraverso l'estrusore, da una siringa all'altra. Questa fase consente inoltre testare la permeabilità del sistema. Se perde, smontare e rimontare nuovamente cambiare la membrana.
      8. Prendere la sospensione lipidica utilizzando una siringa dell'estrusore ('lato sporco').
      9. Applicare la siringa contenente la sospensione lipidica su una camera e la siringa vuota sulla camera opposta.
      10. Premere la siringa su una estremità. Far passare la soluzione attraverso la membrana e nella siringa avversaria. Questo è il passo 1 ^°.
      11. Passare attraverso la membrana per un totale di 31 volte taliche la soluzione finisce sulla siringa opposta ('lato pulito').
          Nota: Controllare la membrana dopo l'estrusione. Se è stato rotto, allora il processo di estrusione, non ha avuto successo e deve essere ripetuto.
      12. Svuotare la siringa in un piccolo tubo. Grandi vescicole unilamellari (Luvs) sono stabili per 1-2 giorni se conservato a 4 ° C.
3. Preparazione di Mica e vetrini
   1. Lavare coprioggetto prima in acqua e poi in etanolo. Aria secca.
   2. Prendete dischi mica e staccare lo strato esterno con del nastro adesivo.
   3. Fissare il disco mica sul vetrino. Colle ottici trasparenti sono ottimali in modo che si possa controllare i doppi strati con un microscopio a fluorescenza.
   4. Fissare cilindri di plastica (diametro 2,5 centimetri esterno, due centimetri di diametro interno, e 0,5 cm di altezza) con ottica colla / grasso. Assicurarsi che tutto sia sigillata e che non vi siano perdite. Usare grasso quando vogliono riutilizzare i cilindri in quanto possono essere facilmente smontato dal the vetrino e lavato. Le dimensioni dei cilindri di plastica dipendono dalle dimensioni del supporto cantilever AFM e devono essere regolati di conseguenza.
4. Deposizione di unilamellari vescicole su un solido appoggio
   1. Pipettare l'intera soluzione liposomiale direttamente sulla mica. Aggiungere più di buffer SLB di raggiungere un volume di 300 ml.
   2. Aggiungere 0,9 ml di soluzione 1 M di cloruro di calcio per raggiungere una concentrazione finale di 3 mM Ca ^2+.
   3. Incubare a 37 ° C per 2 minuti e poi a 65 ° C per almeno 10 min. Coprire sempre i doppi strati con tampone. Il contatto con le bolle d'aria e aria la distruggerà. Durante l'incubazione, aggiungere più tampone se necessario, soprattutto se incubando a temperature più elevate.
      Nota: le temperature di incubazione variano secondo le miscele di lipidi e le fasi necessarie. Occorre tempo di incubazione di almeno 10 minuti per formare bistrati supportati, ma potrebbe essere più lungo, a seconda della temperatura e della composizione.
   4. Lavaggioil doppio strato con calda (65 ° C) del buffer SLB 15-20 volte per rimuovere calcio e vescicole non fuse. Prestare particolare attenzione durante le fasi di lavaggio per mantenere il doppio strato sotto buffer e pipetta delicatamente la soluzione di lavaggio per evitare di distruggere il doppio strato.
   5. Raffreddare bistrati supportati a temperatura ambiente prima misure AFM. Ciò è necessario per formare le diverse fasi della membrana e ridurre la deriva termica dello strumento.

2. Forza Atomica Microscopia Misure ^11,12

1. Imaging
   Nota: eseguire a forza atomica immagini di microscopia in modalità contatto o in modalità tapping. Immagini supportati bistrati in soluzione; non consentono soluzione evapori completamente, come questo distruggerà i doppi strati. Come ci si potrebbe lavorare con tampone, osservare le precauzioni di sicurezza per fare in modo che ogni parte AFM è protetto da fuoriuscite di liquidi.
   1. Selezionare una mensola morbido (di seguito è consigliato di 0,2 N / m costante della molla) e montarlo in tegli AFM. La scelta di cantilever rigidità è più critica per la spettroscopia di forza (e se ne parlerà più avanti).
   2. Montare il campione sul palco AFM e fare in modo che tutti i moduli di vibrazione-isolamento sono attivate. Attendere almeno 15 minuti per equilibrare e ridurre la dispersione termica del sistema. A seconda della AFM set-up, messa a punto e di imaging specifiche possono variare. Consultare manuale del costruttore.
   3. Avvicinare il campione con la punta AFM fino contatto.
   4. Poiché doppi strati lipidici sono solitamente 4 nm in altezza, utilizzare la Z-gamma dello strumento che darà il più alto z-risoluzione (ad esempio 1,5 micron).
   5. Seleziona una regione per immagine. Per avere una panoramica del doppio strato lipidico, a 50 micron x 50 micron o 25 micron x 25 micron regione sarà un buon punto di partenza per l'immagine. Se appaiono le caratteristiche più piccole, immagine una lattina nelle aree più piccole (10 micron x 10 micron, o 2 micron x 2 micron). La scelta della zona di imaging dipende anche dalla r lavorareange dello scanner piezoelettrico. Si prega di consultare il manuale dello strumento per questo.
   6. Come bistrati sono molto fragili, regolare il set point della punta AFM durante l'imaging di mantenere la forza al minimo e corretta per deriva termica, restando a contatto con il campione. Nella modalità di contatto, ridurre al minimo il set point. In modalità toccando, massimizzare il set point.
   7. Le immagini del processo di montaggio ogni linea di scansione per le funzioni di livellamento polinomi. Eseguire la rimozione delle linee per le scansioni che perdono contatto con la membrana utilizzando il software proprietario della società di produzione AFM.
2. Spettroscopia Forza
   1. Calibrare il cantilever seguendo le istruzioni in base al protocollo del produttore. La calibrazione consente la conversione del segnale elettrico di fotodiodi a forza (Figura 1B).
      1. Calibrare la sensibilità della punta per misurare deflessione come movimento z-piezo (in unità di lunghezza) invece del segnale elettrico in volt.
         Nota: AFM rileva variazioni della deflessione del cantilever utilizzando un laser riflessa sul retro del cantilever. Il laser raggiunge un fotodiodo in grado di rilevare la posizione spaziale del punto laser. Un cambiamento nella deflessione della cantilever come si piega a contatto con il campione viene rilevata da questo fotodiodo come "deflessione verticale", e questo è in unità di tensione. Poiché il cantilever viene spostato dalla z-piezo, la deflessione verticale è legato al movimento in z-piezo. Il rapporto tra la deflessione verticale e z-movimento è chiamato sensibilità e converte la tensione a distanza.
      2. Calcolare la costante della molla a sbalzo con il metodo frequenza del rumore termico, solitamente incorporato nel software AFM. In questo metodo, tracciare l'ampiezza di vibrazione dal rumore rispetto alla frequenza di oscillazione, creando una trama densità spettrale di potenza. Questo grafico mostra un picco intorno alla frequenza di risonanza. La frequenza dove l'i dell'ampiezzas il più grande è la frequenza di risonanza. Montare una funzione Lorentziana intorno al picco di calcolare automaticamente la costante della molla dal software. Alcune risorse utili per la teoria del metodo rumore termico sono riportati nei riferimenti ^27-30.
   2. Dopo l'imaging un'area del doppio strato, selezionare una regione x 5 micron 5 micron nel doppio strato effettuare spettroscopia di forza.
   3. Impostare la AFM modo che ci vuole forza curve di una griglia di quella regione 16 x 16. Ciò si traduce in 256 curve di forza per regione. Lo spazio tra i due punti adiacenti dovrebbe essere sufficiente ad evitare che l'area membrana essendo controllato di un punto coinciderebbe con il punto successivo. Questo dipende dal raggio della punta. Una distanza 100 nm tra due punti sarebbe ideale. Dividere il 5 micron x 5 micron regione in 16 x 16 griglia. A seconda delle dimensioni della fase, si può selezionare una regione più piccolo o più grande, e quindi regolare la dimensione della griglia di conseguenza.
   4. Set spostamento z-piezo per400 nm. Questo determina la portata massima di movimento del z-piezo. Esso dovrebbe essere abbastanza grande per assicurarsi che il cantilever sia completamente ritirata dal campione tra le misurazioni.
   5. Impostare velocità di avvicinamento a 800 nm / sec e ritrarre la velocità a 200 nm / sec. Utilizzare una velocità di avvicinamento tra 400 a 6.000 nm / sec a seconda della composizione bistrato e fase lipidica da studiare ^6,16.
   6. Dopo aver impostato tutti i parametri, acquisire forza curve, premendo il tasto "run" del software AFM.
   7. Salvare forza curve come forza contro le curve di altezza (una misura di movimento z-piezo). Ciò non tiene conto della curvatura del cantilever a contatto con il campione. Durante la fase di elaborazione dei dati, il software permette di AFM correzione per cantilever flessione per ottenere forza contro curve di separazione punta-campione (Figura 1C), che darà valori corretti per lo spessore doppio strato. I valori di correzione sono di solito incorporati nel CALIBRAZzione, che viene salvato ad ogni curva di forza. Calcolare separazione punta-campione sottraendo la deflessione verticale dal movimento piezo in un determinato punto.
      Nota: Il picco nella curva forza approccio (il valore della forza scende anche se il movimento cantilever è ancora sul ciclo di accostamento) è la forza innovativa della membrana, mentre la differenza tra la posizione di questo picco e la posizione del punto dove la forza comincia a sollevarsi fornisce nuovamente lo spessore della membrana.
   8. Acquisire almeno 500 curve di forza per ogni condizione di ottenere buone statistiche. Tracciare un istogramma dei valori utilizzando programmi come origine o MatLab, e montare gli istogrammi di una distribuzione gaussiana per ottenere il picco e la larghezza della distribuzione.

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Risultati

Doppi strati lipidici supportati composto da DOPC: SM: Chol (2: 2: 1) sono state visualizzate con AFM (Figura 2 AC). A causa della composizione lipidica, sono stati osservati SM / Chol-ricchi L DOPC ricchi fasi L _{d oe.} Il profilo altezza da immagini AFM può fornire importanti informazioni sulla struttura della membrana. Osservando il profilo altezza, lo spessore doppio strato può essere misurato in presenza di difetti nella membrana (Figura 2B), ovvero la differenza di alte...

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Discussione

SLB composti DOPC: SM: Chol (2: 2: 1) sono formati sulla mica dopo vescicole adsorbimento e rottura indotta da cloruro di calcio. Questa composizione lipidica separato in L _d e L _o fasi. La fase L _o si arricchisce in sfingomielina e colesterolo ed è meno fluido / più viscoso (Figura 1A) che l'L _d di fase ^11. La separazione di L _o di fase L _d manifesta come strutture circolari elevata sopra la circostante (Figura 1...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine	Avanti Polar Lipids, Inc.	850375P	Comes as lyophilized powder in sealed vials. Dissolve all powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20 °C. Visit here for more information on storage and handling.
Sphingomyelin (Brain, Porcine)	Avanti Polar Lipids, Inc.	860062P	Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20 °C. Visit here for more information on storage and handling.
Cholesterol	Avanti Polar Lipids, Inc.	700000P	Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20 °C. Visit here for more information on storage and handling.
Sodium chloride (NaCl), 99.8%	Carl Roth GmbH + Co. KG	9265.1
Potassium chloride (KCl), 88%	Sigma	P9541
Sodium hydrogenphosphate (Na2HPO4), >99%	AppliChem GmbH	A1046
Potassium dihydrogenphosphate (KH2PO4), 99%	Carl Roth GmbH + Co. KG	3904.1
Calcium chloride dihydrate (CaCl2), molecular biology grade	AppliChem GmbH	A4689
HEPES, molecular biology grade	AppliChem GmbH	A3724
Glass coverslip, 24 x 60 mm, 1 mm thickness	Duran Group	2355036
Punch and Die Set	Precision Brand Products, Inc	40105
Optical Adhesive	Norland Products, Inc.	NOA 88	Liquid adhesive that hardens when cured under long wavelength UV light.
[header]
Mica blocks	NSC Mica Exports Ltd.		These are mica pieces at least 1 sq. inches in area and thickness ranging from 0.006 inches to 0.016 inches. They are cut to a specific size by the company for shipping. Small mica discs can be punched from the mica blocks using the punch and die set.  Always handle mica with gloves or tweezers.
Laboratory Equipment Grease	Borer Chemie AG	Glisseal N
Liposome Extruder	Avestin	LiposoFast-Basic	As an alternative one can also look at offers from Northern Lipids, Inc.
Adhesive Tape	3M	Scotch(R) Magic (TM) Tape 810 (1-inch)
Bath Sonicator	Bandelin Sonorex Digitec	DT-31	No heating, Frequency: 35 kHz, Ultrasonic Peak Output: 160 W, HF Power: 40 W. (Data sheet)
Silicon Nitride AFM Cantilever	Bruker AFM Probes	DNP-10	Each cantilever has four tips and their nominal tip radius is 20 nm (with possible maximum at 60 nm). Based on the specifications, we use tip D with resonance frequency of 18 kHz, and nominal spring constant of 0.06 N/m.
AFM	JPK	JPK Nanowizard II mounted on Zeiss Axiovert 200