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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Oscillazioni sono proprietà di rete fondamentali e sono modulati dalla malattia e la droga. Studiare le oscillazioni cerebrali slice permette la caratterizzazione di reti isolate in condizioni controllate. I protocolli sono forniti per la preparazione di fettine di cervello acuto per evocare CA1 oscillazioni γ.

Abstract

Oscillazioni di rete neuronali sono caratteristiche importanti di attività cerebrale in salute e malattia e può essere modulata da una serie di farmaci usati clinicamente. Un protocollo è prevista per generare un modello per studiare oscillazioni CA1 γ (20 - 80 Hz). Queste oscillazioni γ sono stabili per almeno 30 minuti e dipendono attività sinaptica eccitatoria e inibitoria oltre all'attivazione di correnti pacemaker. Oscillazioni Tetanically stimolati hanno una serie di caratteristiche riproducibili e facilmente quantificabili compresi conteggio picco, la durata di oscillazione, la latenza e la frequenza che riporta sullo stato della rete. I vantaggi delle oscillazioni stimolate elettricamente includono stabilità, riproducibilità e acquisizione episodica consentendo robusta caratterizzazione della funzione di rete. Questo modello di CA1 oscillazioni γ può essere usato per studiare i meccanismi cellulari e di indagare in modo sistematico come rete neuronale attività è alterata nella malattia e dalle droghe.Malattia stato farmacologia può essere facilmente integrato con l'uso di sezioni di cervello di modelli animali geneticamente modificati o interventistiche per consentire la selezione di farmaci che colpiscono specificamente meccanismi di malattia.

Introduzione

Oscillazioni di rete del cervello si verificano all'interno di bande di frequenza distinte che sono correlate a stati comportamentali. Nei roditori, le oscillazioni θ dell'ippocampo (5-10 Hz) sono osservate durante comportamenti esplorativi 1,2, mentre le oscillazioni γ (20 - 80 Hz) associato con i vari processi cognitivi, tra cui la percezione e l'attenzione 3,4. Attività di rete γ sincrona è anche implicato nella patologia di disturbi come l'epilessia e la schizofrenia 5,6. Ad esempio, le oscillazioni γ si pensa che corrispondono alle aree di corticali focolai epilettici 5,7,8 e potrebbero essere utilizzati come marcatori di pharmacosensitivity o di resistenza, due importanti aree di indagine nel campo della ricerca epilessia 9.

La fetta cerebrale dell'ippocampo è un modello che è stato ampiamente utilizzato per studiare l'attività di rete 10-12. Sono stati sviluppati vari protocolli di generare oscillazioni γ in fettine cerebrali che tipicamente involve modulazione farmacologica quali partire Mg 2+, 4 aminopiridina (4AP), bicucullina, e acido kainico 12-17. Carenze di oscillazioni farmacologicamente innescate sono che si verificano casualmente dopo l'applicazione della droga e non sono affidabile generati o stabile nel tempo. Elettricamente attivati ​​oscillazioni γ superare molti di questi problemi e hanno anche il vantaggio di essere temporalmente bloccato all'evento stimolante che consenta la registrazione e l'analisi episodica. Qui un protocollo è descritto per la generazione di oscillazioni CA1 γ fornendo una stimolazione tetanica alle Oriens falda nella fetta dell'ippocampo.

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Protocollo

Tutti gli esperimenti sui topi sono stati approvati dal comitato etico animali Florey Institute.

1. Setup per il taglio Fette cervello

  1. Preparare una soluzione di taglio costituito da (mm) 125 colina-Cl, 2,5 KCl, CaCl 2 0.4, 6 MgCl 2, 1,25 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO 3, 20 D-glucosio saturata con gas CarboGen (95% O 2 -5 % 2 CO) e un liquido cerebrospinale artificiale (soluzione aCSF) registrazione composto (mM) 125 NaCl, KCl 2,5, 2 CaCl 2, MgCl 2 2, 1,25 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO3, 10 D-glucosio, saturata con CarboGen. Posizionare la soluzione di taglio su ghiaccio per mantenere il freddo.
  2. Congelare circa 400 ml della soluzione di taglio e si fondono insieme con 100 ml di soluzione di taglio scongelato per creare una sospensione di ghiaccio. Bubble con CarboGen (95% O 2 -5% CO 2) ad una portata di circa 0,5 L / min attraverso piccoli ctubi Aliber o vetro sinterizzato per produrre un flusso costante ma gentile di bolle.
  3. Preparare un becher da 250 ml con un inserto in maglia di nylon sollevata in cui verranno inseriti le fette di cervello. Riempire con aCSF per coprire la rete da circa 2 cm e bolla con CarboGen, assicurando che le bolle non disturbare direttamente l'area della sezione possesso. E 'anche importante che non ci siano bolle d'aria nel rete di nylon, così se presenti rimuoverli. Questo sarà camera di raccolta e si mantiene a RT (20 - 25 ° C).
  4. Layout La strumenti sezionare tra cui un grosso paio di forbici, un piccolo paio di forbici, piccoli e grandi micro spatole, e grandi e piccole coppie di pinze e raffreddare su ghiaccio. Posizionare il blocco vibratome tessuto taglio sul ghiaccio su un quadrato di carta stagnola. Ottenere 2 pezzi di 6 cm carta filtro, una lama ad archetto, e un becher da 25 ml riempito con l'impasto soluzione di taglio pure.
  5. Riempire un secondo contenitore con ghiaccio, e c'era un pezzo di tessuto paper sul ghiaccio e collocare un piatto di coltura di 12 cm da cima. Riempire il piatto cultura con taglio soluzione liquami ghiaccio e bolla con CarboGen. Questo è il contenitore in cui con essere eseguita la dissezione cerebrale.
  6. Preparare il vibratome. Rimuovere un doppio lama di rasoio taglio fresco (usare una lama fresca ogni volta) dal suo involucro e spruzzare con l'80% di etanolo acqua poi deionizzata. Tagliare a 3 ml pipetta di plastica al punto in cui inizia a cono. Questo verrà utilizzato per trasferire fettine cerebrali. Bend un ago G 27 alla base di circa 45 ° e legarsi a una siringa da 1 ml. Questo sarà usato per manipolare fette durante il taglio.

2. Taglio cervello Slices

  1. Anestetizzare un topo (P16 - P18) con il 2% isoflurano o un metodo approvato a livello locale. Dopo l'induzione, decapitare il animale con un grosso paio di forbici e cadere la testa nel piatto cultura 12 centimetri che contiene bollito soluzione di taglio liquami. La sospensione deve immergere totalmente la testa perraffreddamento rapido.
  2. Tenere la parte anteriore della testa con una mano peeling la pelle e il tessuto connettivo in avanti verso il naso. Utilizzando le piccole forbici tagliate il tessuto connettivo per rivelare il teschio sottostante. Quindi rimuovere i muscoli sovrastanti parte dorsale del cranio e del collo.
  3. Rimuovere il cervello dal cranio dapprima fissare la parte anteriore del cranio con le pinze grandi e quindi fare due tagli laterali attraverso l'osso entrambi i lati del foro occipitale utilizzando le forbici piccole (Figura 1, tagli etichettati A1 e A2).
    1. Fare un altro taglio tra gli occhi (solo anteriore del bregma) (Figura 1, taglio etichetta B) poi accuratamente tagliare lungo la sutura sagittale anteriormente e riflettere le sezioni di taglio del cranio per rivelare il cervello (Figura 1, taglio C marcato).
    2. Utilizzare la piccola spatola per scavare il cervello e posto su un piatto di coltura. Siate consapevoli del crannervi IAL sulla faccia inferiore del cervello che dovranno essere tagliati, questo può essere fatto utilizzando la dimensione micro spatola più piccoli. Uso spatola il più grande trasferimento cervello al bicchiere da 25 ml riempito con il liquame soluzione di taglio.
  4. Preparare l'emisfero cerebrale per affettare.
    1. Posizionare un pezzo di carta da filtro 6 cm sul fondo di un piatto di coltura fresco quindi riempire con soluzione di taglio fresco slurry e bolla. Utilizzare la spatola grande per posizionare il cervello, lato ventrale giù, sulla carta da filtro. Prendere un nuovo e pulito lama di rasoio singolo bordo e tagliare il cervello per rimuovere il cervelletto, poi fare un taglio lungo la linea di metà di separare il cervello in due emisferi.
  5. Preparazione del blocco dei tessuti vibratome.
    1. Prendete il blocco dei tessuti vibratome refrigerati, asciugare la superficie, e una goccia di colla cianoacrilato in mezzo e diffondere in modo uniforme la dimensione approssimativa del cervello. Utilizzare la piccola spatola per manipolare uno deiemisferi cerebrali sul grande micro spatola in modo che il lato mediale del cervello è giù.
    2. Toccare il bordo della spatola all'interfaccia del cervello sul secondo pezzo di carta da filtro per rimuovere la maggior quantità della soluzione possibile. Far scorrere il cervello al largo delle spatola di grosse dimensioni con la spatola più piccolo per guidarla sulla colla.
    3. Fissare il blocco di taglio nella camera vibratome e riempire la camera con soluzione di taglio liquami e bolla, assicurando il cervello è completamente immersa. Ruotare il blocco di taglio in modo che il lato ventrale del cervello si trova ad affrontare la lama.
  6. Affettare il cervello.
    Nota: Ogni vibratome è unica in modo da seguire le istruzioni del produttore.
    1. Impostare lo spessore della fetta a 450 micron, e di garantire la lama vibra mentre si muove attraverso il cervello ad una velocità di circa 0,3 mm / s. Tagliare interamente attraverso il cervello dal lato ventrale di superficie corticale, questo produrrà intero cervello fette sagittali che possono Be utilizzato per le registrazioni elettrofisiologiche. Fette saranno prodotti lateralmente medialmente e tipicamente 3 - 4 fette possono essere tagliati da ciascun emisfero.
    2. Se la base della fetta ascensori utilizzare il piegato 27 ago G di stampa dolce fetta indietro. Poiché ogni fetta viene tagliata, utilizzare la pipetta di trasferimento per spostarlo sulla piattaforma nella camera di tenuta dove sono vitali per un massimo di 8 ore.

3. extracellulari Elettrofisiologia Recordings

  1. Montaggio fetta nella camera di registrazione.
    1. Usando la pipetta di trasferimento, posizionare una fetta cervello in una camera di registrazione sommerso perfuso con aCSF scorre a 1 - 2 ml / min e riscaldata a 32 ° C. Il aCSF utilizzato per le registrazioni differisce da quella nella camera di tenuta come la concentrazione di Mg 2+ è aumentato da 2 mM a 4 mM.
    2. Fissare la fetta con un "arpa" (acciaio inox semi circolare con fili di nylon tesi attraverso a 2-3 mm di distanza). Luogol'arpa in modo che i fili paralleli a CA1. Aumentare la velocità di perfusione a 8 - 10 ml / min a 32 ° C.
  2. Sotto un microscopio da dissezione posto un elettrodo stimolante e un elettrodo di registrazione (elettrodo di vetro riempita con la soluzione di registrazione aCSF) sulla superficie del radiatum strato della CA1 (Figura 2A). Posizionare l'elettrodo stimolante prima poi posto l'elettrodo di registrazione.
  3. Stimolare la Schaffer dei collaterali con un 120 - 150 μA di ampiezza e 0,1 msec impulso di prova della durata e osservare il conseguente campo posta eccitatorio sinaptica potenziale (fEPSP) forma d'onda per determinare la salute fetta (Figura 2B). Gli elettrodi stimolanti e di registrazione possono avere bisogno di essere spostato nella fetta di circa 50 - 100 micron dalla superficie fetta di ottenere la registrazione di un fEPSP con una piccola fibra volley e grande ampiezza. La garanzia Schaffer evocato fEPSPs sono stereotipati e di fornire un buon indicatore della salute fetta. HEalthy fette mostrano tipicamente una fibra volley per fEPSP rapporto di ampiezza inferiore a 0,3.
  4. Riposizionamento gli elettrodi.
    1. Utilizzando un microscopio da dissezione, spostare l'elettrodo stimolante mezzo delle oriens falda e spostare l'elettrodo di registrazione per lo strato di cellule piramidali più vicino all'elettrodo di registrazione come possibile, come mostrato nella Figura 3A. Gli elettrodi stimolanti e registrazione possono dover essere spinto nella fetta di circa 50 - 100 micron in modo che la risposta di ampiezza fEPSP al 120 - 150 μA impulso di prova è di circa 1 mV.
  5. Generazione di oscillazioni γ.
    1. Per generare oscillazioni γ stimolano il tessuto con un treno di 20 x 0,1 impulsi msec erogati a 200 Hz. Questo stimolo tetanica può produrre risposte riproducibili al momento della consegna ogni 5 minuti.
  6. Utilizzare i seguenti parametri di registrazione.
    1. Scala il guadagno del segnale di uscita in modo che corrisponda alla tensione di ingressoil convertitore analogico-digitale. Assicurarsi che escursione segnale massimo previsto utilizza un minimo di 30% della tensione di ingresso. Fare attenzione quando si imposta guadagni per alta come segnali potrebbero tagliare. La larghezza di banda di riferimento necessario per le registrazioni sul campo è di 500 Hz con accoppiamento AC a 0,1 Hz per eliminare la deriva della linea di base.
    2. Digitalizzare almeno 4 - 5 volte più veloce della frequenza di taglio del filtro passa basso per evitare segnale aliasing.
  7. Analisi dei dati.
    1. Dati filtro passa alto a 5 Hz a rimuovere eventuali spostamenti della linea di base. Identificare picchi utilizzando una soglia derivato, con una distanza minima evento di 10 msec, un tempo tipico evento di picco e l'intervallo di regressione di 7 ms, una soglia di ~ 100 mV / msec, e una valle separazione del 100%. Calcolare la latenza come il tempo impiegato per il primo picco identificato si verifichi dopo la fine del manufatto stimolazione. Questa analisi consente per la caratterizzazione del numero di picchi, latenza intervallo inter-evento, e la durata calcolata comesegue:
    2. Calcolare il numero di picchi come il numero totale di punte per oscillazione per ogni scansione è determinato.
    3. Calcolare la latenza di oscillazione. Per ogni oscillazione, sottrarre il tempo del primo picco identificato dalla fine del manufatto stimolazione.
    4. Calcola l'intervallo di inter-evento media (ISI). Determinare il periodo di tempo tra più picchi rilevati e media.
    5. Calcolare la durata di oscillazione. Misurare il tempo tra il primo e l'ultimo picco rilevato all'interno di ogni oscillazione.

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Risultati

Stimolazione tetanica dei Oriens falda generato robusti e riproducibili oscillazioni γ (35.4 ± 2.2 Hz), si veda la Figura 3B. Per dimostrare che le oscillazioni sono stati generati all'interno della rete locale, CA1 fattori produttivi da CA3 furono recisi tagliando la fetta della regione CA2 con un'inclinazione 32 ago G. Le proprietà di oscillazione nelle fette del taglio non differivano dalle fette tagliati (p = 0,85; tagliate a fette 6,16 ± 1,1 picchi, n = 6; fette tagliati 5,89 ± 0,8 pic...

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Discussione

Un metodo robusto per generare CA1 oscillazioni γ in fettine di cervello acuto è descritto. Le oscillazioni generate nascono da un circuito locale consente una migliore opportunità per il controllo e la comprensione della basi neurofisiologiche delle oscillazioni di rete 12. Recettori AMPA, recettori GABA A, I h e T-tipo Ca 2+ canali sono tutti necessari per oscillazioni γ in questo modello. Mentre le oscillazioni locali CA1 qui descritte possono essere generati robusto qu...

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Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Supported by APA to RJH, NHMRC program grant 400121 to SP, and NMHRC fellowship 1005050 to SP. CAR acknowledges the support of the ARC (FT0990628) and the DOWD fellowship scheme. The Florey Institute of Neuroscience and Mental Health is supported by Victorian State Government infrastructure funds.

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
4-(N-Ethyl-N-phenylamino)-1,2- dimethyl-6-(methylamino) pyrimidinium chloride (ZD7288)Sigma-AldrichZ3777
BiucullineSigma-Aldrich14340
6-cyano-7-nitroquinoxa- line-2,3-dione (CNQX)Sigma-AldrichC127
NickelSigma-Aldrich266965
CarbamazepineSigma-AldrichC4024
(2R)-amino-5-phosphonopentano-ate (APV)Tocris Bioscience0105
RetigabineChemPacific150812-12-7
Choline-ClSigma-AldrichC1879-5KG
KClSigma-AldrichP9333-500G
NaH2PO4Sigma-AldrichS9638-250G
NaHCO3Sigma-AldrichS6297-250G
NaClSigma-AldrichS7653-5KG
GlucoseSigma-AldrichG8270-1KG
CaCl2 • 2H2OSigma-Aldrich223506-500G
MgCl2 • 6H2OSigma-AldrichM2670-500G
Electrode glassHarvard Apparatus GC150F-10
Concentric bipolar stimulating metal electrode FHCCBBPF75
Digital IsolatorGetting InstrumentsModel BJN8-9V1 
Model 1800 amplifierA-M systemsModel 1800 amplifier
DigitizerNational IntrumentsNI USB-6211
VibrotomeLeicaVT1200s

Riferimenti

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