Generazione di scalabili, Metallic Tacchi-Aspect nanocompositi Rapporto in un Biologica Liquid Media

Riepilogo

Qui vi presentiamo un protocollo per sintetizzare nuovi, ad alto rapporto di aspetto biocompositi in condizioni biologiche e in mezzi liquidi. I biocompositi scala da nanometri a micrometri di diametro e lunghezza, rispettivamente. Nanoparticelle di rame (CNPS) e solfato di rame in combinazione con cistina sono le componenti chiave per la sintesi.

Abstract

L'obiettivo di questo protocollo è quello di descrivere la sintesi di due nuovi biocompositi con strutture ad alto rapporto-aspetto. I biocompositi consistono di rame e cistina, sia con nanoparticelle di rame (CNPS) o solfato di rame contribuendo componente metallico. Sintesi è condotta in un liquido in condizioni biologiche (37 ° C) e la forma compositi autoassemblati dopo 24 ore. Una volta formati, questi composti sono altamente stabili in entrambi i liquidi e in una forma secca. I compositi ridimensionare dal nano alle micro gamma di lunghezza, e da pochi micron a 25 nm di diametro. Emissione di campo microscopia elettronica a scansione con spettroscopia a dispersione di energia dei raggi X (EDX) ha dimostrato che lo zolfo è presente nelle strutture lineari NP-derivati, mentre era assente dal materiale di partenza CNP, confermando cistina come fonte di zolfo nei nanocompositi finali . Durante la sintesi di questi nano e micro-compositi lineari, una vasta gamma di lunghezze di structures è formata nel serbatoio di sintesi. Sonicazione della miscela liquida dopo la sintesi è stata dimostrata per aiutare a controllare dimensione media delle strutture diminuendo la lunghezza media con un tempo di sonicazione. Poiché le strutture formate sono altamente stabili, non agglomerato, e si formano in fase liquida, centrifugazione può essere utilizzato anche per aiutare a concentrare e segreganti compositi formati.

Introduzione

Copper is a highly reactive metal that in the biological world is essential in some enzyme functions ^1,2, but in higher concentrations is potently toxic including in the nanoparticulate form ^3,4. Concern over copper toxicity has become more relevant as CNPs and other copper-based nanomaterials are utilized, due to the increased surface area/mass for nanostructures. Thus, even a small mass of copper, in nanoparticle form, could cause local toxicity due to its ability to penetrate the cell and be broken down into reactive forms. Some biological species can complex with and chelate metal ions, and even incorporate them into biological structures as has been described in marine mussels ⁵. In studying the potential toxic effects of nanomaterials ⁴, it was discovered that over time, and under biological conditions used for typical cell culturing (37 °C and 5% CO₂), stable copper biocomposites could be formed with a high-aspect ratio (linear) structure.

By a process of elimination, the initial discovery of these linear biocomposites, which occurred in complete cell culture media, was simplified to a defined protocol of essential elements needed for the biocomposites to self-assemble. Self-assembly of two types of highly linear biocomposites was discovered to be possible with two starting metal components: 1) CNPs and 2) copper sulfate, with the common biological component being cystine. Although more complex, so called “urchin” and “nanoflower” type copper-containing structures with nanoscale and microscale features have been previously reported, these were produced under non-biological conditions, such as temperatures of 100 °C or greater ^6-8. To our knowledge, synthesis of individual, linear copper-containing nanostructures that are scalable in liquid phase under biological conditions has not been previously described.

One of the starting materials utilized for synthesis of nanocomposites, namely CNPs, has been reported previously to be very toxic to cells ⁴. It has recently been reported that after the nanocomposites are formed, these structures are less toxic on a per mass basis than the starting NPs ⁹. Thus, the synthesis described here may be derived from a biological and biochemical reaction that has utility in stabilizing reactive copper species, both in the sense of transforming the NP form into larger structures and in producing composites less toxic to cells.

In contrast to many other nanomaterial forms which are known to aggregate or clump upon interaction with biological liquid media ^10,11, once formed, the highly linear composites described here avoid aggregation, possibly due to a redistribution of charge which has been previously reported ⁹. As detailed in the current work, this avoidance of aggregation is convenient for the purposes of working with the structures once formed for at least 3 reasons: 1) composite structures once formed may be concentrated using centrifugation and then easily dispersed again using vortex mixing; 2) formed structures can be decreased in average size by sonication for different periods of time; and 3) the formed linear structures may provide an additional tool for avoiding the recently described “coffee ring effect” ¹² and thus provide a dopant for creating more evenly distributed coatings of materials, especially those containing spherical particulates.

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Protocollo

1. Progettazione di esperimenti

1. Determinare il volume di nanocompositi rame necessari per la sintesi. Su tale base, scegliere un numero di flaconi di piccolo volume (25 centimetri ^2), o flaconi grandi come indicato di seguito nella preparazione dei materiali.
2. Per questa sintesi, utilizzare un incubatore a 37 ° con il 5% di CO ₂ e almeno il 40% di umidità. Assicurarsi che tale incubatrice è disponibile e che non verrà ripetutamente disturbato durante il periodo di sintesi (circa 24 ore).
   ATTENZIONE: l'apertura e la chiusura ripetuta dell'incubatrice sarà certamente causare sbalzi di temperatura che possono provocare la sintesi alterata delle strutture nanocompositi.

2. Preparazione dei Materiali

1. Preparare tutti materiali freschi prima dell'inizio di un esperimento, aggiungendo materiali solidi a solventi destra prima sintesi deve iniziare. Mantenere soluzioni stock di cistina e di partenza di rame materiale a liquido per tempi lunghi brima l'esperimento non è raccomandato e può portare a risultati variabili. Una volta aperto dal fornitore, tenere materiali secchi avvolgendo la parte superiore del contenitore con parafilm partenza.
   Nota: il seguente protocollo viene utilizzato come esempio per la reazione in 25 cm ² cella pallone di coltura con 7 ml di cistina, 6643 ml di acqua sterile, e 350 ml di CNPS.
2. Preparare una soluzione di 2 mg / ml di nanoparticelle rame pesando almeno 2 mg di CNPS. Indossare guanti monouso durante questa fase per evitare possibili contatti di CNPS con la pelle. Mettere le nanoparticelle in un vuoto sterile 16 ml di vetro fiala.
   1. Per la fiala contenente CNPS, aggiungere acqua deionizzata sterile il volume appropriato per ottenere una soluzione 2 mg / ml e agitare la soluzione per 20 sec per fornire dispersione delle nanoparticelle prima dell'inizio di sintesi (almeno 1 ml di volume totale è raccomandato). Non riempire il più di metà strada fiala con l'acqua come questo inibisce la miscelazione con il vortex. CNPS will risolvere rapidamente al fondo del flacone e apparirà di colore scuro (grigio e il nero).
   2. Sonicare la soluzione CNP per 17 minuti a temperatura ambiente per fornire la dispersione massima di CNPS prima dell'inizio della sintesi. Controllare periodicamente per assicurarsi che CNPS stia mescolando causa di ultrasuoni. Dopo una sonicazione successo, CNPS rimangono sospese in soluzione per almeno 30 minuti e la soluzione sarà di colore scuro.
3. Pesare massa sufficiente di cistina per ottenere una soluzione / ml 72,9 mg per la sintesi. Poiché cistina non è direttamente solubile in acqua, posizionare la cistina pesati in un recipiente di pesata antistatico.
   1. Per la pesatura recipiente contenente cistina, aggiungere sufficiente volume di sterili, 1 M NaOH, in modo che la cistina scioglie completamente. Ad esempio, sciogliere 7,29 mg di cistina completamente in 100 ml di 1 M NaOH, per fare un / ml soluzione 72,9 mg.
   2. Per mantenere condizioni di sterilità, eseguire questo passaggio in una cappa coltura tissutale flusso sterile.
      ATTENZIONE: NaOHa 1 M concentrazione caustica, così indossare guanti monouso durante questa fase per evitare il contatto di NaOH concentrato con la pelle
4. Lavorando in una cappa coltura tissutale sterili, aggiungere 7 ml di cistina con 6643 ml di acqua sterile alla beuta di sintesi sterili prima, e lasciate incubare per 30 min in incubatore a 37 ° C con il tappo pallone ventilato (sciolto) per fornire efficace miscelazione. Risospendere il / soluzione CNP ml 2 mg vortexando per 30 secondi, in quanto CNPS sarà risolto dopo la fase di ultrasuoni.
   1. Aggiungere la soluzione CNP sufficiente al pallone di sintesi (con tecnica sterile) per mantenere i seguenti rapporti tra i componenti: combinare 1 parti cistina, 50 parti CNPS, e 949 parti di acqua sterile in 25 cm ² pallone di coltura cellulare per iniziare la sintesi. Ad esempio, per un volume di sintesi 7 ml, unire 7 ml di soluzione madre cistina, 350 ml di CNPS, e 6643 ml di acqua sterile. Rimettere il tappo sul pallone e stringere in modo che sia secure.
   2. Dopo che unisce tutti i componenti per la sintesi, mescolare delicatamente nel pallone agitando 4-5 volte. Posizionare beuta nel CO ₂ incubatore e sfiatare la beuta allentando il tappo in modo che ci sia lo scambio di gas dentro e fuori del pallone durante la sintesi.
5. Lasciare che la sintesi di eseguire in incubatrice per circa 24 ore. Durante la sintesi, si può osservare, con microscopia e occhio, formazione di compositi altamente lineari.
   Nota: Il processo di formazione delle strutture può accadere improvvisamente nel senso che le strutture sono inizialmente difficili da individuare, quindi aspetto procede rapidamente a una densità crescente. La formazione può quindi avvenire prima 24 ore. Il processo può anche essere osservato ad occhio volta strutture diventano più grandi e loro densità aumenta. Mentre la generazione delle strutture può essere osservato nel tempo al microscopio e occhio a successivi punti di tempo, interrompendo continuamente le condizioni di sintesi e temperatura porterà a scarsarisultati di sintesi.
6. Terminare sintesi di biocompositi dal strettamente tappatura matraccio sintesi e memorizzare il vaso in frigorifero (4 ° C). Strutture, una volta generati, rimangono stabili in questa forma per almeno un anno. Etichettare il pallone con condizioni di sintesi, compresi i componenti utilizzati, la data della sintesi, e il tempo di incubazione della sintesi prima della terminazione.

3. Sintesi Utilizzando solfato di rame

1. Eseguire la sintesi di auto-assemblaggio, sostituendo CNPS con sale solfato di rame. Usando una tecnica sterile, sciogliere almeno 2 mg di solfato di rame in quantità sufficiente di acqua deionizzata sterile per ottenere uno / ml soluzione 2 mg. I cristalli di solfato di rame facilmente andare in soluzione a questa concentrazione, ma vortice il flaconcino se necessario, e ispezionare ad occhio per garantire che tutti i cristalli sono dissolti.
2. Dopo la preparazione del solfato di rame, effettuare sintesi come descritto in precedenza, ma sostituendo CNPS con solfato di rame.
   Nota: nanocompositi auto-assemblati con solfato di rame come materiale di partenza sono stati trovati ad essere molto più consistente in forma finale che per le strutture sintetizzate da CNPS.
3. Terminare la sintesi di biocompositi solfato di rame come per i compositi CNP (punto 2.6) e archiviarli a lungo termine a 4 ° C.

4. Caratterizzazione e manipolazione dei biocompositi Post-sintesi

1. Caratterizzare biocompositi derivati ​​da CNPS e da solfato di rame dal bianco al microscopio ottico ⁹ e microscopia elettronica ^9.
   1. Per la caratterizzazione e l'ispezione di biocompositi post-sintesi mediante microscopia a luce bianca, utilizzare un microscopio invertito come compositi si depositerà alla superficie inferiore del pallone entro pochi minuti dalla posa del matraccio piatta, e può quindi essere messo a fuoco. Utilizzare l'impostazione in campo chiaro sul microscopio per massimizzare il contrasto tra biocompositi e il mezzo liquido. Compositi derivati ​​da CNPS e poliziottoper solfato saranno entrambi apparire chiaro opaco colore, ma che non hanno reagito aggregati CNP appare molto scuro.
      1. Utilizzare una fotocamera digitale collegata al microscopio per catturare le immagini dei compositi. Viene osservata una gamma di lunghezze per le singole strutture.
   2. Per la caratterizzazione e l'ispezione di biocompositi post-sintesi e dopo conservazione a 4 ° C, permettono fiaschi di venire a temperatura ambiente per almeno 15 minuti come fiaschi formeranno condensazione inizialmente dopo la rimozione dal frigorifero, che oscurare efficace focalizzazione nello svolgimento immagini di microscopia. Dopo aver lasciato il raggiungimento dell'equilibrio di RT, pulire le superfici superiore e inferiore del pallone con un tovagliolo di carta pulito per ottimizzare la qualità delle immagini di microscopia.
   3. Quando si lavora con o immagini compositi che sono stati conservati a lungo termine, il vortice fiasco per 30 sec a dissociarsi ciuffi di composti che si formano mentre in frigorifero. Dopo vortex, ispezionare le strutture con un microfono invertitoROSCOPE per garantire che gli aggregati sono dissociate, e ripetere vortex se necessario.
   4. Utilizzare invertita microscopia luce bianca per valutare l'efficacia della sintesi per un dato esperimento utilizzando CNPS. Ad esempio, documentare la presenza o l'assenza di non reagito CNPS in fiaschi di sintesi utilizzati per biocompositi CNP-derivati ​​da palloni con diversi parametri come il tempo di sintesi.
      Nota: individuale CNPS sono troppo piccoli per osservare con un microscopio ottico, ma non reagito CNP aggregati appariranno come tondeggiante e oggetti scuri, in contrasto con il CNP-compositi sintetizzati con successo che avrà un rapporto di alta aspetto, forma lineare, e avrà una gamma di differenti lunghezze. Evitare di realizzare sintesi per troppo tempo di un periodo di tempo prima della terminazione, come questo si tradurrà in strutture di tipo altamente ramificate "riccio", che sono difficili da disperdere in singole strutture volta formate.
   5. Utilizzare invertita microscopia ottica bianca per valutare l'efficaciadella sintesi per un dato esperimento utilizzando solfato di rame. Poiché solfato di rame va completamente in soluzione con questo protocollo, la soluzione apparirà meno scuro rispetto alla soluzione dalla sintesi utilizzando CNPS. Documentare la dimensione e la portata dei compositi solfato di rame confrontando palloni con differenti condizioni di sintesi, quali il tempo di sintesi prima della terminazione.
      Nota: composti sintetizzati con successo mostreranno una gamma di diverse lunghezze. Evitare di realizzare sintesi per troppo tempo di un periodo di tempo prima della terminazione, come questo si tradurrà in aggregati altamente ramificati di compositi, alcuni dei quali saranno "urchin-like" nella struttura, e che sono difficili da disperdere in singole strutture volta formate .
2. Per concentrare biocompositi post-sintesi, soluzioni di centrifugazione di compositi in una provetta da centrifuga. Aggiungere 6 ml di una delle strutture CNP-derivati ​​o strutture solfato derivato rame in una provetta da centrifuga da 15 ml. Centrifugare per 10 minutia 500 xg a RT per formare un pellet. Per i volumi più piccoli, aggiungere 500 ml di strutture in soluzione di 0,6 ml tubi di dimensioni. Centrifugare a 2.000 xg a temperatura ambiente per almeno 10 minuti per formare un pellet.
   1. Dopo centrifugazione per un tempo sufficiente (almeno 10 min per microfuges), salvare il pellet osservabile nella parte inferiore del tubo dove le strutture sono concentrati rimuovendo accuratamente il liquido supernatante sopra il pellet. Strutture Biocomposite derivate da solfato di rame appaiono di colore blu e strutture derivate da CNPS sono più scuro (grigio al nero).
   2. Aggiungere più compositi di questo tubo e ripetere il processo nello stesso tubo di concentrare strutture se desiderato. Per disperdere i pellets concentrati, aggiungere il volume desiderato di soluzione al tubo, e vortex per 10-30 sec.
3. Strutture Sonicare volta formate, per spostare la dimensione media della popolazione (lunghezza) delle strutture a valori più bassi. Strutture Luogo in acqua deionizzata sterile e sonicare a Least 10 min. Utilizzando questo processo, nel corso del tempo, strutture vengono frammentati e più piccola della lunghezza media (vedi figura 6 del testo). Le modifiche ai documenti di dimensioni compositi con diversi tempi di sonicazione usando un microscopio a luce bianca invertito e fotocamera digitale.

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Risultati

La figura 1 mostra una schematica diagramma di flusso delle fasi di sintesi per formare i biocompositi lineari descritti in questo lavoro. CNPS o rame solfato come materiali di partenza sono combinati con acqua sterile per formare un / ml soluzione 2 mg, questa soluzione viene miscelata e sonicato per fornire un impasto omogeneo, e questa soluzione di rame viene quindi miscelata nel seguente rapporto per sintesi: 949 parti sterile acqua: 50 parti miscela di rame: cistina soluzione stock 1 parte. I volum...

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Discussione

Nel valutare potenziali effetti tossici di nanomateriali compreso CNPS, è stato osservato che nel lungo termine, CNPS furono trasformati da una distribuzione di particelle inizialmente più dispersa ad una forma aggregata maggiore (Figura 2). In alcuni casi, queste formazioni altamente aggregati che sono stati prodotti nel piatto di coltura cellulare, in condizioni biologiche, formate proiezioni altamente lineari da dell'aggregato centrale, che ricordano rame precedentemente descritto contengono &q...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mini Vortexer	VWR (https://us.vwr.com)	58816-121
CO2 Incubator Model # 2425-2	VWR (https://us.vwr.com)	Contact vendor	Current model calalog # 98000-360
Eppendorf Centrifuge (Refrigerated Microcentrifuge)	Labnet (http://labnetinternational.com/)	C2500-R	Model Prism R
Cell Culture Centrifuge Model Z323K	Labnet (http://labnetinternational.com/)	Contact vendor	Current model Z206A catalog # C0206-A
Sonicator (Ultrasonic Cleaner)	Branson Ultrasonics Corporation (http://www.bransonic.com/)	1510R-MTH
Balance	Sartorius (http://dataweigh.com)		Model CP225D similar model CPA225D
Olympus IX51 Inverted Light Microscope	Olympus (http://olympusamerica.com	Contact vendor
Olympus DP71 microscope digital camera	Olympus (http://olympusamerica.com	Contact vendor
external power supply unit - white light for Olympus microscope	Olympus (http://olympusamerica.com	TH4-100
10X, 20X, and 40X microscope objectives	Olympus (http://olympusamerica.com	Contact vendor
Scanning Electron Microscope	Hitachi (http://hitachi-hitec.com/global/em/sem/sem_index.html)	model S-4800
Transmission Electron Microscope	Zeiss (http://zeiss.com/microscopy/en_de/products.html)	model Libra 120
Table Top Work Station Unidirectional Flow Clean Bench	Envirco (http://envirco-hvac.com)	model PNG62675	Used for sterile cell culture technique