Un metodo per infliggere Chiuso Testa trauma cranico in<em&gt; Drosophila</em

Riepilogo

Qui si descrive un metodo per infliggere cranico chiuso lesione cerebrale traumatica (TBI) in Drosophila. Questo metodo fornisce un gateway per studiare i meccanismi cellulari e molecolari che sono alla base delle patologie TBI utilizzando la vasta gamma di strumenti sperimentali e le tecniche disponibili per le mosche.

Abstract

Lesione cerebrale traumatica (TBI) colpisce milioni di persone ogni anno, causando perdita di valore di fisico, cognitivo, e funzioni comportamentali e la morte. Gli studi che utilizzano Drosophila hanno contribuito importanti passi avanti nella comprensione dei processi neurologici. Così, con l'obiettivo di comprendere le basi cellulari e molecolari di patologie TBI negli esseri umani, abbiamo sviluppato il dispositivo High Impact Trauma (HIT) di infliggere alla testa chiusa TBI in mosche. Le mosche sottoposte alla visualizzazione fenotipi dispositivo HIT coerenti con TBI umana, come incapacità temporanea e progressiva neurodegenerazione. Il dispositivo HIT utilizza un meccanismo a molla per spingere basato mosche contro la parete di una fiala, causando danni meccanici al cervello mosca. Il dispositivo è economico e facile da costruire, il suo funzionamento è semplice e rapida, e produce risultati riproducibili. Di conseguenza, il dispositivo HIT può essere combinato con strumenti sperimentali esistenti e tecniche per mosche per affrontare fondamentaledomande su TBI che possono portare allo sviluppo di strumenti diagnostici e terapie per TBI. In particolare, il dispositivo HIT può essere utilizzato per eseguire schermi genetici su larga scala per comprendere la base genetica di patologie TBI.

Introduzione

Lesione cerebrale traumatica (TBI) è definita come lesioni al cervello da una forza meccanica esterna. Più comunemente, i risultati TBI da forze testa chiusi quali forze smussati e accelerazioni inerziali e decelerazione che causano il cervello per colpire l'interno del cranio. Negli Stati Uniti, si stima che 50.000 persone muoiono ogni anno per TBI e 2,5-6.500.000 individui vivono con le conseguenze del trauma cranico, tra cui debilitante fisico, cognitivo, e problemi comportamentali ^1,2. Le conseguenze del trauma cranico non solo a causa di infortuni meccanici primari al cervello, ma anche per le lesioni cellulari e molecolari secondari al cervello e altri tessuti che si verificano nel corso del tempo ^3-5. Lo sviluppo di approcci per diagnosticare e trattare TBI ha dimostrato di essere difficile, perché TBI è un processo patologico complesso. La variabilità delle lesioni primarie, la fisiologia umana, e fattori ambientali si traduce in eterogenei i secondarionjuries e patologie. Fattori variabili esistenti includono la gravità della lesione primaria, il tempo tra lesioni primarie ripetitive, e l'età e il genotipo dell'individuo. Capire come ogni fattore variabile contribuisce alle conseguenze di trauma cranico è probabile che per aiutare nello sviluppo di approcci per diagnosticare e trattare TBI ^6,7.

Qui si descrive un metodo per infliggere testa TBI chiuso in Drosophila melanogaster (moscerino della frutta) che può essere utilizzato per delineare il contributo dei fattori variabili per le conseguenze del trauma cranico. Il metodo si basa su una prima osservazione che intensamente colpire il lato di un flaconcino cultura mosca contro il palmo di una mano causato wild-type vola a diventare temporaneamente inabili, un probabile conseguenza di TBI. Così, abbiamo costruito il Trauma (HIT) dispositivo ad alto impatto di ricapitolare le forze di accelerazione e decelerazione dall'azione incisiva mano. Un film ad alta velocità mostra che un singolo colpo dallaHIT dispositivo fa sì che vola a contattare il muro flacone più volte con la loro testa e il corpo ^8. In una certa misura, tutti i contatti sono suscettibili di causare il cervello mosca per rimbalzare e deformare contro la capsula testa, simile a quanto accade per gli esseri umani in cadute e incidenti stradali ^9. Di conseguenza, mosche trattato con il display fenotipi dispositivo HIT coerenti con lesioni cerebrali, tra cui incapacità temporanea seguita da atassia, graduale recupero della mobilità, cambiamenti di espressione genica nella testa, e la progressiva neurodegenerazione nel cervello ^10. Così, il dispositivo HIT consente di studiare TBI utilizzando l'enorme arsenale di strumenti e tecniche sviluppate per mosche sperimentali.

Protocollo

1. Costruzione del dispositivo di HIT

1. Fissare la molla alla scheda utilizzando due morsetti e quattro viti (Figura 1A). Centrare i morsetti relativi alla larghezza della tavola e allineati l'uno con l'altro con il filo morsetto esterno con il bordo della scheda. Prima di collegare i morsetti, piegarli con una pinza per adattarsi perfettamente durante la primavera.
   NOTA: Vedi Tabella 1 per le descrizioni dei materiali necessari per la costruzione del dispositivo HIT. L'estremità bloccato della molla deve essere 1/8 di pollice (3,2 mm) dal bordo della tavola, e l'estremità libera sia estesa al bordo da 3/4 di pollice (19 mm). Regolare la molla in modo che risulti parallelo alla lunghezza della tavola.
2. Avvolgere l'estremità libera della molla una volta intorno con il nastro adesivo di loop velcro. Il bordo esterno del velcro deve essere a filo con l'estremità della molla. Il Velcro è importante perché è utilizzato per fissare il flacone per la molla creDELL'INDICE DI un raccordo a compressione stretto. Il Velcro consente inoltre una facile connessione e la rimozione di fiale, permettendo molte fiale da trasformare in un breve periodo di tempo.
3. Mettere il coperchio del contenitore di ghiaccio a testa in giù, al centro, a contatto con la tavola di legno. Orientare la zona in rilievo del coperchio del contenitore di ghiaccio tale che il lato lungo è parallelo alla larghezza della tavola. Si noti che la zona in rilievo della benna di ghiaccio è di 1/2 di pollice (13 mm) più alto del bordo di legno, in modo che quando una fiala è collegato alla molla la molla non sarà piatte sul bordo.
4. Scorrere l'intero dispositivo contro un oggetto fisso, ad esempio un muro, in modo che il coperchio del contenitore di ghiaccio si incunea tra la scheda e l'oggetto e non si muove.
5. Nastro il goniometro carta sul fondo del cartone vola vassoio fiala e basamento sul bordo contro la lunghezza della tavola in modo che il marchio di 90 ° sia allineata con la molla quando viene tirato indietro ad una posizione perfettamente verticale.

2.Il funzionamento del dispositivo di HIT

1. Luogo tra 1 e 60 CO ₂ -anesthetized vola in una fiala vuota e tappo del flacone con un batuffolo di cotone aderente.
2. Confinare linea al fondo 1 pollice (2,5 cm) del flaconcino spingendo il batuffolo di cotone nel flaconcino finché è 1 pollice (2,5 cm) dal fondo. E 'utile a tracciare una linea sul flacone al segno 1 pollice (2,5 cm). Si noti che confinare mosche a regioni più grandi o più piccoli della fiala può influenzare la gravità dei fenotipi.
3. Attendere 5 minuti per le mosche di recuperare la mobilità della CO _2. Si noti che non è noto se 5 min è sufficiente per eliminare completamente gli effetti di CO _2.
4. Inserire l'estremità della molla nel flaconcino finché il bordo interno del Velcro è a filo con la parte superiore della fiala (Figura 1B). Quando la molla è disteso, 1 pollice (2,5 centimetri) del flaconcino deve sovrapporsi regione rialzato del coperchio del secchiello del ghiaccio. Fiale possono essere riutilizzati mogni volta.
5. Stando seduti, tenere il flaconcino in corrispondenza della zona in velcro con il pollice e l'indice della mano sinistra. Tenere il bordo stretto al banco con la mano destra. In alternativa, utilizzare C-morsetti per tenere la scheda stretto al banco.
6. Tirare la molla perfettamente dritto torna all'angolazione desiderata. Rilasciare la molla. Lasciare che la primavera a venire ad un arresto completo.
7. Rimuovere la fiala dal primavera e consentire in linea di recuperare per ≥5 min. Sottoporre linea ad un altro sciopero o trasferire le mosche per una fiala con la mosca cibo.
   NOTA: Una varietà di saggi possono essere utilizzati per valutare gli effetti fenotipici dei colpi dal dispositivo HIT. Ad esempio, gli effetti sulla longevità può essere determinato analizzando la percentuale di mosche che sopravvivono a volte dopo la lesione, effetti sulla morfologia cerebrale può essere determinata mediante analisi istologica della testa, e gli effetti sulla espressione genica può essere determinata mediante l'analisi quantitativa dei livelli di mRNA ^10.
8. Determine effetti del procedimento non dovuti ad attacchi trattando identicamente linea di controllo che non sono soggette a colpi. Indossare protezione acustica perché l'impatto della fiala contro il coperchio del contenitore di ghiaccio produce un forte rumore.

Risultati

Siamo interessati a capire il motivo per cui le mosche muoiono poco dopo la lesione primaria. Per quantificare la morte, abbiamo determinato l'indice di mortalità in 24 ore (MI _24), che è la percentuale di mosche che sono morti entro 24 ore della lesione primaria. Mosche sottoposti a colpi dal dispositivo HIT sono state incubate a 25 ° C in una fiala con fly cibo, e il numero di mosche morte è stato contato dopo 24 ore. Abbiamo usato questo approccio per identificare fattori che influenzano il MI

Discussione

Il metodo dispositivo HIT si distingue da altri metodi che infliggono lesione traumatica in linea dal fatto che essa provoca cranico chiuso piuttosto che penetrante TBI ^11. Inoltre, il metodo di dispositivo HIT richiede meno tempo, fatica e abilità per infliggere TBI in molte mosche, in modo che il metodo è più suscettibili di altri metodi agli schermi genetici su larga scala. Infine, il fatto che le lesioni primarie inflitte dal dispositivo HIT non si limitano al cervello è un limite e un vantaggio. Si t...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zinc plated compression spring	The Hillman  Group	540189	9 7/8 inch (length, 2.2 cm), 15/16 inch (outer diameter, 2.4 cm), 0.12 inch (wire size, 0.3 cm)
Wooden board			9 inch (length, 22.9 cm), 6.5 inch (width, 16.5 cm), 0.75 inch (height, 1.9 cm)
Clamps	Sigma Electrical Manufacturing Corporation	49822	3.10 inch (length, 7.9 cm), 0.68 inch (width, 1.7 cm), 1.11 inch (height, 2.8 cm), EMT Two Hole Straps, click on type for 1 inch (2.5 cm) steel EMT conduit
Loop half of self-adhesive velcro			3 inch (length, 7.6 cm), (3/4 inch width, 1.9 cm)
Polyurethane ice bucket cover	Fisher Scientific	02-591-45	9 1/8 inch (length, 23.2 cm), 9 1/8 inch (width, 23.2 cm), 1 1/4 inch (height, 3.2 cm)
Plastic fly vials	Applied Scientific	AS-510	3 11/16 inch (height, 9.4 cm), 1 1/16 inch (inner diameter, 2.7 cm), 1 1/8 inch (outer diameter, 2.9 cm)
Large cotton balls	Fisher Scientific	22-456-883
Paper protractor			10 inch (diameter, 25.4 cm)