Asimmetrica Passerella: A Novel comportamentale saggio per lo Studio Asymmetric Locomozione

Riepilogo

Here, we present a protocol to quantify precise stepping in rodents. Cortical and the spinal central pattern generator signals are required for precise foot-placement during obstructed locomotion. We report here the novel constrained walking task that directly examines precise stepping behavior.

Abstract

Saggi comportamentali sono comunemente usati per la valutazione di deterioramento sensorimotor nel sistema nervoso centrale (CNS). I metodi più sofisticati per quantificare deficit locomotori nei roditori è di misurare i disturbi minuto di vincoli andatura overground (ad es., Il punteggio BBB manuale o passerella automatizzato). Tuttavia, input corticali non sono necessari per la generazione di locomozione base prodotta dal generatore spinale modello centrale (CPG). Così, i compiti non vincolati a piedi prova deficit locomotori da deterioramento corticale motore solo indirettamente. In questo studio, si propone un nuovo, preciso compito motorio piede posizionamento che valuta input corticali al midollo CPG. Un peg-way strumentati è stato utilizzato per imporre compiti locomotore simmetrici e asimmetrici che mimano deficit lateralizzati movimento. Dimostriamo che il trasferimento dal equidistanti lunghezze inter-falcata di 20% producono cambiamenti nelle caratteristiche di fase posizione degli arti anteriori durante la locomozione con prefsbagliato lunghezza del passo. Inoltre, proponiamo che la passerella asimmetrica consente misurazioni di risultati comportamentali prodotte da segnali di controllo corticali. Queste misure sono rilevanti ai fini della valutazione di danno dopo danno corticale.

Introduzione

Post-ictus morbilità nella popolazione superstite comprende menomazioni motorie che rappresentano una sfida per la valutazione quantitativa di entrambi gli esseri umani dopo l'ictus e animali modelli di danno neurologico ^1. In ambito clinico, queste difficoltà motorie sono valutate con criteri soggettivi che sono più sensibili al deterioramento grave piuttosto che moderata esibito dalla maggior parte dei pazienti. Allo stesso modo, tali valutazioni soggettive del comportamento motorio post-infortunio negli animali sono comuni, ad esempio., Basso, Beattie e Bresnahan (BBB) ​​scala locomotore metodo ^2,3. Mentre questi metodi di valutazione soggettivi stanno aiutando traduzione tra gli studi di riabilitazione andatura in modelli animali quadrupedi e gli esseri umani, i dettagli di deficit motori associati all'attività dei gruppi muscolari separati non sono valutati. Inoltre, la valutazione del contributo corticale motore locomozione, come il colpevole putativo di deficit motorio in un incidente cerebrovascolare,può essere ottenuto solo indirettamente anche utilizzando metodi quantitativi più nuovi automatizzate ^4,5, in quanto si basano sul campo aperto o compiti lineari piedi. Queste attività non richiedono contributo corticale e possono essere eseguite dai meccanismi neurali del midollo spinale, animali cioè, il generatore di pattern centrale (CPG) della rete che è risparmiata nella maggior modelli animali di danno neuronale, ad esempio, spinalized ^{6 -.. 8} . Contributo corticale essenziale a questi meccanismi spinali è stata sperimentalmente coinvolto in compiti che richiedono anticipato aggiustamenti posturali ⁹ e raggiungendo ^10, così come precisa un passo ^10.

Inoltre, molti danni neurologici è asimmetrica; per esempio, ictus provoca emiparesi, cioè, debolezza su un lato del corpo, che si traduce in un andatura asimmetrica ^{11 -. 14.} L'asimmetria di andatura emiplegica è prodotto da spatiotempor asimmetricaattivazione muscolare al manifesta più significativamente abbreviando la fase di appoggio estensore associata e l'allungamento della fase di oscillazione flessori-associato del ciclo gradino sul lato paretico ^15,16. Questa tendenza non è stato ancora esplorato attraverso una gamma di velocità locomotore in animali sani o paretici. In questo studio, abbiamo utilizzato l'analisi della fase durata caratteristiche ¹⁷ che descrive la relazione tra la durata delle fasi di oscillazione o una posizione in funzione della durata del ciclo in ogni passaggio. Il modello di regressione lineare ottenuta è stata poi ulteriormente descritto con l'analisi di asimmetria in tutte le arti.

Descriviamo un metodo a basso costo romanzo per valutare l'attività di input corticali decrescente nel sistema motorio degli animali quadrupedi basati su un compito preciso passo locomotore. Questo compito è stato progettato per sfidare la corteccia motoria imponendo esigenze di posizionamento del piede in un area di ripartizione naturale di velocità a piedi. Inoltre, I requisiti piede-posizionamento sono manipolati a sfidare preferenzialmente sul lato sinistro o destro del sistema motorio. In un compito motorio simile, Metz e Whishaw (2009) hanno esaminato i tassi di fallimento, il numero di passi perse sul irregolare passerella gradino, nei ratti. Il nostro metodo è gratuita per questo studio precedente, e in dettaglio la qualità del controllo fase "di successo" ¹⁸ passi.

Protocollo

Il seguente paradigma formazione impiega l'analisi delle rettifiche di fase del media per adulti Sprague-Dawley di ratto. Assicurarsi che il protocollo qui descritto è in conformità con le vostre linee guida per la cura degli animali istituzionali. Tutte le procedure di questo studio sono stati eseguiti in conformità con la cura e l'uso Comitato Animal Istituzionale (IACUC) e Ufficio per Laboratory Animal Welfare (OLAW) alla West Virginia University School of Medicine e si conforma al National Institutes of linee guida di salute per l'uso delle sperimentale animali.

1. apparecchiature di installazione

1. Costruire la passerella asimmetrica come una scatola di plastica open-top rinforzato con supporti in alluminio ad ogni angolo misura 155 cm x 104 cm (Figura 1). Brace i bordi superiori della scatola con barre di alluminio scanalati su entrambi i lati per consentire il posizionamento alternato piolo, lungo il perimetro della scatola, in modo che ciascun piolo consecutive sullo stesso lato definisce la lunghezza del passo.
2. Inserire un 20 cm x 20 cm piattaforma su ogni angolo (quattro totale) che separa le condizioni rappresentate su ciascun lato. Questa distanza deve essere sufficiente per l'inserimento della distanza percorsa da un singolo ciclo del passo ratto.
   1. Utilizzare pioli in alluminio con dimensioni di 20 cm x 1 cm x 0,5 cm. Piegare la parte superiore di ogni spina 2,5 cm dalla punta a produrre una piattaforma di posizionamento del piede.
   2. Fissare i picchetti alle barre scanalate con scorrevole parentesi all'interno attraverso i fori lavorati alla stessa distanza per assicurare livello di posizionamento orizzontale. Regolare le posizioni con un cacciavite e un righello. Utilizzare una larghezza piolo 1 centimetro che corrisponde approssimativamente alla dimensione media topo zampa; pioli più sottili o più ampi sono o disagio o aumentare la variabilità posizionamento del piede.
3. Manipolare il posizionamento perno su ogni lato per produrre uno dei tre precise condizioni sfida stepping.
   1. Produrre un compito motorio simmetrica con una lunghezza di passo 15 centimetri (SL15) impostando la sinistra inter-falcata lunghezza (l ISL) e proprio la lunghezza tra falcata (r ISL) alla metà della lunghezza del passo (7,5 cm).
   2. Imporre una condizione simmetrica aggiuntivo (SL12) cambiando l ISL e r ISL lunghezze a 6,0 cm.
   3. Produrre i compiti asimmetrici cambiando la distanza tra pioli sui lati sinistro e destro, definito dalla lunghezza inter-passo. Per sfidare il sistema motorio asimmetrico, modificare la ISL L e R ISL del 20% per imporre brevi inter-stride lunghezze sia sulla sinistra (condizione L6R9) oppure a destra (L9R6) laterali. Il CM perturbazioni 1,5 impongono l ISL di 6 cm e r ISL di 9 cm per la condizione L6R9, o l ISL di 9 cm ed una ISL r di 6 cm per la condizione L9R6
4. Per ratti, mantenere la lunghezza del passo per tutte le condizioni tranne SL12 a un preferito di 15 cm.
5. Per comodità, assegnare ciascun lato lungo della passerella una condizione asimmetrica favorendo sinistro o il right lato del soggetto, riservando due lati corti per la condizione di controllo simmetrica.
6. Setup una telecamera ad alta definizione con una frequenza di campionamento di almeno 60 Hz in modo che il posizionamento degli arti pioli è ostruita con fotocamera punta perpendicolarmente alla passerella con il campo visivo che copre circa 7 passi. Il primo e l'ultimo passo in prossimità di piattaforme vengono ignorate.

2. Formazione su Apparatus

1. Si prega di utilizzare le risorse di formazione standard, ad es., NIH Formazione in base Biomethodology per topi di laboratorio, per familiarizzare con la formazione generale del comportamento dei roditori.
2. All'inizio della formazione, acclimatare soggetti ponendo e ricompensandoli sulla piattaforma 20 x 20 centimetri per almeno 5 minuti. Poi, guidare gli animali attraverso un accordo piolo con un 1 cm Lunghezza inter-falcata alla prossima piattaforma per la presentazione di una ricompensa in cibo. Premiare gli animali verbalmente e con carezze per raggiungere la piattaforma.
3. After 5 piste di allenamento, spazio i pioli un extra di 1 - 2 cm di distanza e svolgere i prossimi 5 piste di allenamento. Il numero di ripetizioni elencato qui è sufficiente a produrre statisticamente appropriata dimensione del campione (20 - 35 gradini).
   1. Se l'animale acquisisce il compito più lentamente, come giudicato dalla consistenza di passo (senza sosta) e la postura (schiena arcuata), per poi focalizzarsi formazione sul rafforzamento di queste competenze alle brevi lunghezze falcata (S12) prima di riprendere formazione sui lunghi passi ( S15) alla fine si avvicina la lunghezza del passo desiderato.
   2. Se la nuova spaziatura induce ansia o disagio con il compito, riaggiustare i pioli per l'impostazione precedente e ripetere il paradigma di formazione.
   3. Procedere con questa formazione fino a quando la lunghezza corretta inter-falcata si ottengono per le quattro condizioni e le norme locomotore sono soddisfatte. Nella nostra esperienza, i ratti rispondono bene a incoraggiamento vocale come spunti per avviare un processo. Il test può essere eseguito lo stesso giorno come formazione previstoi soggetti sono motivati ​​per eseguire l'operazione.
      Nota: Le norme locomotorie sono le seguenti: a piedi è coerente e non comporta arresti o passi falsi; testa alla maschietta è minima; la parte posteriore è arcuato e la coda è sollevata durante la locomozione; ogni arto è chiaramente visibile da una vista ortogonale della passerella a insorgenza e offset di fase di appoggio. Questo processo di selezione è essenziale come il presente studio si concentra solo a camminare piuttosto che altri comportamenti gaiting.

3. Prove e analisi dei dati

1. Animali da esperimento sui compiti S12, S15, L9R6, e L6R9 (descritti nella sezione 1.3) con disegno randomizzato sessione. Usa pause per evitare di adattamento all'interno di un compito.
2. Sessioni di registrazione con fotocamera ad alta definizione, con una frequenza di campionamento di almeno 60 Hz. Importa registrazioni video senza re-campionamento in software di video editing e selezionare solo le attacchi a piedi per ulteriori analisi.
3. Mark insorge e offset delle fasi cinematichein registrazioni video di ogni soggetto.
4. Qui, utilizzare il software personalizzato chiamato Videoa scritto in Matlab per identificare manualmente il tempo della posizione insorgenza e offset per ogni arto su base fotogramma-per-fotogramma, dove posizione insorgenza è indicato dalla perdita dell'effetto movimento associato al posizionamento degli arti sulla un piolo, e la posizione di offset, che si verificano al momento della comparsa di arto lift-off, è indicato per la prima prova di motion blur.
5. Calcolare la durata della fase di oscillazione come il tempo rimanente tra due consecutivi esacerbazioni stance cinematiche. Escludere qualsiasi comportamento non è coerente con overground camminare quadrupede, ad es., Quando l'andatura contiene un doppio fase di oscillazione (entrambi arti anteriori o zampe posteriori da terra), dal procedimento di analisi.
6. Tracciare la durata di ogni fase in funzione della durata del ciclo corrispondente passo. Cattura il rapporto con il modello di regressione lineare (Tphase = B1 + B2 * Tc) ottenuto per ogni arto, dove Tc è la durata del ciclo, è l'e Tphaseither Te posizione estensore legati o Tf, che è l'oscillazione flessori riscontrato, e B1 e B2 sono costanti empiriche (offset e slope) del modello di regressione.
   Nota: La pendenza (B2) rappresenta la quantità di variazione della durata di fase con il cambiamento di velocità di locomozione.
7. Utilizzare Equazioni 1 e 2 (Figura 2C) per ogni arto per calcolare l'indice di asimmetria (AI). Entrambe le equazioni hanno la stessa forma di un semplice rapporto che normalizza la differenza dei due valori alla loro somma.
   1. Con l'equazione 1, calcolare la differenza orizzontale (AI _h) che utilizza la differenza tra pendii di modulazione posizione di sinistra (L) e destro (r) arti. Analogamente, calcolare l'asimmetria verticale (AI _v) utilizzando le piste da anteriore / anteriore (a) e posteriore (p) arti posteriori /. Il risultato dell'applicazione di queste due equazioni è l'insieme di dati di 4 punti xy corrispondenti a 1) forelimb asimmetria, AAI _h; 2) l'asimmetria degli arti posteriori, Pai _h; 3) a sinistra zampa anteriore-hindlimb asimmetria, LAI _v; 4) l'asimmetria degli arti posteriori zampa anteriore-destra, Raï _v.
   2. Tracciare questi valori come patch (Figura 2B) per la rappresentazione visiva di asimmetria in tutte le arti.
8. Calcolo indici diagonalità (DI) per valutare l'accoppiamento diagonale tra parametri di una zampa anteriore e del suo arti posteriori controlaterale (Equazione 3, Figura 2C).
9. Testare il DI, nonché la differenza di quattro IA tra le condizioni di asimmetria opposte (ΔAI = | AIL9R6 - AIL6R9 |) per la significatività statistica utilizzando ANOVA al confronto post-hoc di mezzi analisi ¹⁹

Risultati

Figura 2 mostra l'analisi di asimmetria durante l'attività locomotoria per un singolo soggetto rappresentativo. I valori sono stati calcolati per ogni condizione con l'equazione 1 e 2 da tutti i soggetti individualmente (Figura 2) e da dati compositi di 8 femmina Sprague-Dawley (250 - 400 g, Figura 3). Generalmente, la modulazione di fase statica forelimb era minore per il lato in cui la condizione locomozione stata favorita...

Discussione

The rationale for this study was to develop a behavioral task that quantitatively assesses the changes in precise control of asymmetric locomotor behaviors. The existence of the spinal CPG has been functionally demonstrated for some time²⁰, but the anatomical and functional characteristics that describe its mechanism as well as its modulatory inputs from descending or sensory feedback pathways have not been characterized until the past decade^6,21,22. The current consensus is that the intrinsic spina...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
MATLAB® R2013a	MathWorks		Design platform for custom videoa video annotation software
Sony HDR-CX380/B High Definition Handycam	Sony	27-HDRCX330/B	Video acquisition device.
Jif Creamy Peanut Butter - Gluten Free 454 g	J.M. Smucker Company		Food reward stimulus.
Sucrose Tablet - Chocolate 1800 g	TestDiet	1811256	Food reward stimulus.
Manzanita Wood Gnawing Sticks	BioServe	W0016	For presentation of food reward stimulus.