Combinato Shuttle-Box Training con elettrofisiologiche Cortex registrazione e stimolazione come strumento per studiare percezione e apprendimento

Riepilogo

Shuttle-box apprendimento evitamento è ben consolidata in neuroscienze comportamentali. Questo protocollo descrive come navetta-box di apprendimento nei roditori può essere combinata con microstimolazione site-specific elettrica intracorticale (ICMS) e croniche simultanea nelle registrazioni vivo come strumento per studiare molteplici aspetti dell'apprendimento e della percezione.

Abstract

Apprendimento Shuttle-box evasione è un metodo consolidato in neuroscienze comportamentali e sperimentali messe a punto sono stati tradizionalmente su misura; l'attrezzatura necessaria è ora disponibile da diverse società commerciali. Questo protocollo fornisce una descrizione dettagliata di una navetta-box evitare paradigma di apprendimento nei due sensi nei roditori (gerbilli qui Mongolia; Meriones unguiculatus) in combinazione con microstimolazione site-specific elettrica intracorticale (ICMS) e simultanee elettrofisiologici vivo registrazioni croniche in. Il protocollo dettagliato è applicabile per studiare molteplici aspetti del comportamento di apprendimento e la percezione di diverse specie di roditori.

ICMS site-specific dei circuiti corticali uditive come stimoli condizionati qui viene utilizzato come strumento per testare la rilevanza percettiva di specifici afferenti, efferenti e connessioni intracorticali. Pattern di attivazione distinti possono essere evocati da utilizzando diversi arr elettrodi di stimolazioneays per, ICMS strato dipendenti locali o siti distanti ICMS. Utilizzando analisi comportamentale di rilevamento del segnale si può determinare quale strategia stimolazione è più efficace per suscitare un segnale comportamentale rilevabile e saliente. Inoltre, multicanale registrazioni parallele utilizzando diversi modelli di elettrodi (elettrodi di superficie, elettrodi di profondità, etc.) consentono di indagare osservabili neuronali nel corso tempo di tali processi di apprendimento. Esso verrà discusso come i cambiamenti del design comportamentale può aumentare la complessità cognitiva (ad esempio il rilevamento, la discriminazione, l'apprendimento di inversione).

Introduzione

Un obiettivo fondamentale di neuroscienza comportamentale è di stabilire legami specifici tra neuronali proprietà strutturali e funzionali, l'apprendimento, e la percezione. Attività neurale associata con la percezione e l'apprendimento può essere studiato dalla registrazione elettrofisiologica dei potenziali d'azione e potenziali di campo locale in diverse strutture cerebrali in più siti. Mentre registrazioni elettrofisiologiche forniscono associazioni correlativi tra l'attività e il comportamento neuronale, microstimolazione diretta elettrica intracorticale (ICMS) da oltre un secolo è stato il metodo più diretto per i rapporti di prova causali delle popolazioni di neuroni eccitati e dei loro effetti sul comportamento e percettivi ^{1 - 3.} Molti studi hanno dimostrato che gli animali sono in grado di fare uso di varie proprietà spaziali e temporali di stimoli elettrici in compiti percettivi seconda del sito di stimolazione entro per esempio retinotopica ^4, tonotopic ^5, o somatotopica ^{6 regioni} della corteccia. Propagazione di attività elettricamente evocata nella corteccia è determinato principalmente dalla disposizione delle fibre assonali e la loro connettività sinaptica distribuito ² che, nella corteccia, è chiaramente ^layer-7 dipendenti. L'attivazione polisinaptici risultante evocata dalla ICMS è ormai molto più diffuso di effetti diretti della ^2,8,9 campo elettrico. Questo spiega perché le soglie di effetti percettivi indotte da microstimolazione intracorticale possono essere fortemente dipendente dal livello di ^8,10,11 e il sito-dipendente ^9. Uno studio recente ha dimostrato in dettaglio che la stimolazione di strati superiori ha prodotto più diffusa attivazione di circuiti corticocorticali in strati principalmente supragranular, mentre la stimolazione di strati più profondi della corteccia risultato in una focale, corticoefferent ricorrente intracolumnar attivazione. Esperimenti comportamentali parallele rivelato che quest'ultimo ha di gran lunga inferiore thr rilevamento percettivoesholds ^8. Pertanto, il vantaggio di site-specific ICMS stimoli come condizionato è stato sfruttato in combinazione con registrazioni elettrofisiologiche di mettere in relazione causale specifiche attivazioni circuiti corticali ^{8 a} misure comportamentali di apprendimento e percezione nella shuttle-box.

La navetta-box paradigma a due vie è un apparecchio da laboratorio consolidata per studiare elusione apprendimento ^12. Una navetta-scatola è composta da 2 vani separati da un ostacolo o di porta. Un stimolo condizionato (CS) che è rappresentato da un segnale adatto come una luce o il suono, è potenzialmente seguito da uno stimolo incondizionato avversivo (US), come ad esempio uno shock piedi su un pavimento griglia metallica. I soggetti possono imparare ad evitare USA da spola da un compartimento shuttle-box all'altra in risposta al CS. Apprendimento Shuttle-box comporta una sequenza di fasi di apprendimento distinguibili ^13,14: In primo luogo,soggetti imparano a prevedere gli Stati Uniti dal CS dal condizionamento classico e di fuggire dagli Stati Uniti dal condizionamento strumentale, come gli Stati Uniti è terminata sulla spola. In una fase successiva, i soggetti apprendono evitare USA complessivamente da spola in risposta alla prima CS US insorgenza (reazione evitamento). In generale, l'apprendimento di navetta-box coinvolge condizionamento classico, condizionamento strumentale, così come un comportamento goal-directed seconda fase ¹⁴ di apprendimento.

La procedura di shuttle-box può essere installato facilmente e in generale produce un comportamento affidabile dopo alcune sedute di allenamento giornaliere ^{di 15 - 17.} Oltre alla semplice evasione condizionata (rilevamento), lo shuttle-box può essere ulteriormente utilizzato per studiare la discriminazione stimolo impiegando paradigmi go / Nogo. Qui, gli animali sono addestrati per evitare USA da una risposta condizionata (CR) (go comportamento; navetta nel vano opposta) in risposta ad un go-stimolo (CS +) e da comportamenti nogo (rimanere nel vano corrente, senza CR) in risposta ad una di Nogo-stimolo (CS) microstimolazione parallelo e la registrazione di attività neurale con gli array multielettrodico alta densità permetterà di studiare. i meccanismi fisiologici alla base di apprendimento di successo. Numerosi dettagli tecnici che sono fondamentali per le combinazioni di successo della formazione di navetta-box, ICMS e elettrofisiologia parallelo, saranno discussi.

Protocollo

Tutti gli esperimenti presentati in questo lavoro sono state condotte in accordo con gli standard etici definiti dalla legge tedesca per la protezione degli animali da esperimento. Gli esperimenti sono stati approvati dal comitato etico dello stato della Sassonia-Anhalt.

1. Su misura multicanale Electrode Array per microstimolazione e registrazione

1. Matrice microstimolazione su misura
   1. Per la consegna di ICMS, preparare elettrodi di stimolazione nella progettazione dello spazio desiderato (array laterale qui di 2 canali) con fili a 3 cm di lunghezza Teflon isolati in acciaio inox (Ø con isolamento = 50 micron). Vedere la Figura 2.
   2. Crimpare un'estremità dei fili ad un sistema perno maschio (mm passo 1.25).
   3. Per una matrice a 2 canali con ~ 0,5 mm o 0,7 millimetri ~ fili passa distanza elettrodo perpendicolarmente attraverso due griglie di microscopia elettronica Porta oggetti allineati verticalmente (distanza di griglie ~ 5 mm) guida i fili (mm passo 0,1654).
   4. Fili colla insieme ad una piccola goccia di acrilico dentale circa 4 mm sopra le terminazioni dei fili che alla fine servono come punte degli elettrodi.
   5. Mettete pin maschio nel corpo del connettore.
   6. Mettere l'elettrodo in un piatto con la soluzione elettrolitica (ad esempio, 0,9% cloruro di sodio) e misurare l'impedenza di ciascun canale con un rispettivo dispositivo di misura di impedenza (ad es., FHC impedenza condizionata Module). Mirare a impedenze nel 100-500 gamma k.
      1. Se l'impedenza è troppo alta, fornire corrente elettrica a breve (1 sec, 1 mA) attraverso i canali per abbassarlo. Controllare l'impedenza di nuovo.
2. Ad alta risoluzione array di registrazione multicanale su misura
   Nota: questo protocollo descrive la produzione di array di superficie per la registrazione di dati electrocorticogram (ECOG). Tuttavia, i disegni possono essere personalizzati per soddisfare le esigenze della rispettiva domanda di ricerca (registrazioni di profondità, ecc.) Array multicanale ad alta risoluzione sono built da cavi in ​​acciaio inox teflon isolamento (Ø con isolamento = 50 micron) aggraffato ad un sistema pin maschio (mm passo 1.25).
   1. Per schiere di elettrodi di superficie, 18 guida i fili attraverso una matrice 3 x 6 di due griglie di microscopia elettronica oggetto porta-preparati.
   2. Incorporare il 6 x 3 disposizione dei fili tra le griglie con acrilico dentale e mettere perni nel corpo del connettore.
   3. Macinare l'acrilico dentale in un blocco rettangolare utilizzando smerigliatrice attaccato ad un trapano tenuto in mano.
   4. Verificare che l'impedenza di tutti i canali (vedi 1.1.6) è nel range tra i 100 - 500 k.
   5. Prima dell'impianto (vedi punto 2) di superficie frantumazione delle matrici per abbinare la convessità della superficie corticale.

2. impianto chirurgico di array in Auditory Cortex in Herbils mongolo anestetizzati per cronica di utilizzo

1. Tenere l'approvazione ufficiale per eseguire tutti i passi necessari sperimentali che sono in programma. Indossare approindumenti protettivi oppor- (cappotto, guanti sterili, mascherina chirurgica, cappa).
2. Utilizzare adulti gerbilli maschi della Mongolia (Meriones unguiculatus) o qualsiasi altra specie di roditori. Indossare guanti protettivi e cappotto e sempre utilizzare strumenti chirurgici sterilizzati e ben identificati.
3. In caso di gerbilli, anestetizzare animali con una iniezione ip di una miscela di ketamina (100 mg / kg) e xilazina (5 mg / kg) diluito in soluzione sterile di cloruro di sodio allo 0,9%. Mantenere per infusione di 0,6 ml / h / kg di una composizione miscela di ketamina: xilazina: sodio cloruro (0,9%) nel rapporto di 9: 1: 10.
4. Posizionare animale su una piastra di riscaldamento per mantenere la temperatura corporea a 37 ° C da un sistema di feedback sonda rettale (ad esempio, World Precision Instruments).
5. Shave pelliccia che copre interoccipital, parietali, temporali e le ossa. Asetticamente preparare il sito di incisione con un disinfettante efficace (ad es., Alternando Betadine o clorexidina e 70% di alcool frega 3 volte). Procchi otect contro asciugatura pomata occhio.
6. Tagliare la pelle del cranio che copre il interoccipital, parietali e frontali ossa utilizzando un bisturi e rimuovere periosteum muovendo delicatamente un trapano sulla superficie ossea.
7. Piccole perforazioni nel parietale controlaterale e l'osso frontale come laterale possibile per non ostacolare montare la testa in seguito. Ora avvitare due viti ossee con un diametro di circa 1 mm saldamente nei fori. Assicurarsi che la vite parietale ha buon contatto della dura, come sarà utilizzata come riferimento comune e la terra, così come elettrodo di ritorno per la stimolazione elettrica in seguito.
8. Colla un piccolo bar di alluminio medialmente sulle ossa frontali e usarlo come fissaggio testa durante l'impianto da un headholder.
9. Togliere la pelle che copre le Musculus temporale su un lato con le forbici.
10. Tagliare la parte dorsale del muscolo temporale per ottenere l'ammissione alla osso temporale.
11. Esporre corteccia uditiva da craniotomia (~ 3 mm x 4 mm) didell'osso temporale utilizzando un trapano dentistico. Identificare la posizione della corteccia uditiva in base alla tipica firma ematoencefalica vasi ^18,19.
12. Con cura un'incisione della dura con un micro bisturi nella posizione in cui l'elettrodo di stimolazione è impiantato nel cervello. Spostare delicatamente lungo la superficie fino alle lacrime della dura di vietare danni al neuropilo sottostante.
13. Inserire matrice di stimolazione sotto controllo micromanipolatore. Scegliere un angolo di inserimento tangente per consentire l'array epidurale per essere posizionato sopra la regione di interesse. A seconda angolo di inserimento e la posizione e il sito mirato di stimolazione, considerare attentamente la profondità di inserimento.
14. Posizionare la matrice di registrazione superficie epidurale con buon contatto alla superficie del cervello che copre la regione di interesse (corteccia qui uditiva) da una seconda micromanipolatore. Fare attenzione che la matrice corrisponde alla curvatura della corteccia di non rientrare la dura.
15. Fissare entrambi gli array di elettrodi e la loro spinacustodie con acrilico dentale al cranio.
16. Copertura esposta superficie corticale con un lubrificante antisettico (ad esempio, KY-Jelly) e vicino craniotomia con acrilico dentale (ad esempio, Paladur, Heraeus Ulzer). Tenete a mente che la polimerizzazione può produrre calore. Utilizzare lubrificante sufficiente tra neuropilo e acrilico dentale per evitare qualsiasi contatto dell'acrilico dentale e la superficie corticale, in quanto ciò potrebbe causare danni ai tessuti.
17. Ora consentono agli animali di recuperare prima dell'inizio di qualsiasi altro procedimento. I tempi di recupero possono differire tra le specie (ad esempio, gerbilli: ≥ 3 giorni, i topi: ≥ 7 giorni). Monitorare attentamente lo stato dell'animale e un trattamento analgesico nei giorni successivi se applicabile (ad esempio, meloxicam, 1 mg / kg e postchirurgico 24 ore dopo l'intervento).

3. Due vie Shuttle-box disegni utilizzando ICMS stimolo come Condizionata

1. Formazione Shuttle-box
   1. Posizionare una navetta-box (custom-build o qualsiasi prodotto commerciale, ad esempio, E10-E15, Coulbourn Instruments) in una camera acusticamente ed elettricamente schermato. La scatola contiene due compartimenti separati da una transenna. Considerare l'altezza del ostacolo in quanto influenza la polarizzazione del comportamento di go-risposte. Utilizzare altezze adeguate per le specie specifiche (ad esempio, ~ 2 cm per topi, ~ 3 cm per gerbilli).
   2. Per applicare il piede-shock (US), utilizzare un pavimento griglia con una distanza tra le barre appropriate per le specie in esame ^12,15. Fare sempre attenzione che nulla Scorciatoie elettricamente le singole barre (feci, capelli, crema elettrodo).
   3. Dopo un tempo considerevole recupero dell'animale (vedi 2.17), collegare il soggetto al cavo registrazione e stimolazione preferibilmente senza impiegare anestesia breve termine. Cercare di coprire l'animale con un asciugamano e prendere delicatamente l'animale in mano. Scoprire la testa e connettori dell'animale con l'altra mano e collegare i cavi.
   4. Lasciare gli animali a abituano alla camera di formazione per 3 minuti prima dell'inizio di ogni sessione.
   5. Per allenamento (1-2 al giorno) si applicano tra 30-90 prove. Durate uso di prova di fino a 15 sec, e gli intervalli tra le prove che variano in modo casuale tra il 25 - 30 sec.
   6. Per la consegna di ICMS per la stimolazione condizionato agli elettrodi di stimolazione utilizzare uno stimolatore multicanale (ad esempio, MCS STG2000). Per ottenere effetti comportamentali senza danneggiare il tessuto cerebrale, applicare treni di impulsi (ad esempio, 300 ms lunghezza, 100 pps) di impulsi, carica-equilibrato bifasica (catodica prima) con una durata della fase di 200 ms. Ripetere treni con una pausa di 700 ms per una durata di 4 sec (finestra di osservazione).
   7. Per la presentazione uditiva CS utilizzare una scheda PCI uscita analogica (ad esempio, NI PCI-6733). Programmare questi dispositivi con Matlab per controllare in modo flessibile e hardware innescare il sistema di navetta-box attraverso le linee di uscita digitali.
   8. Far passare il segnale di uscita analogico a the navetta-box altoparlanti tramite un amplificatore audio.
   9. Condizionale consegnare il piede-shock degli Stati Uniti attraverso un piano griglia. Per ottimale qualità di registrazione elettrofisiologica, generare la scossa da una seconda fascia alta multicanale stimolatore (MCS STG2000).
   10. Per applicare la formazione di rilevamento presenti solo gli stimoli CS +. Qui, presenti le prove in bianco, senza CS e US intercalati tra le prove di laboratorio (~ 10%) per correggere un comportamento navetta di parte (vedi 3.2). Per un compito più impegnativo, addestrare gli animali per discriminare tra CS + e CS-stimoli presentati nella stessa sessione in ordine casuale.
   11. Classificare un cambiamento vano dall'insorgenza CS + entro una finestra di tempo critico di 4 sec (CR) come risposta positiva. Negli studi + CS senza CR nella finestra temporale critica (miss), consegnare subito una scossa piede delicato per 6-10 secondi come stimolo incondizionato (US).
       Nota: ripetitiva stimolazione CS + che si sovrappone con gli Stati Uniti ridurrà lo sforzo di apprendimento per gli animali unnd migliorare la velocità di apprendimento e le prestazioni ('ritardo' rispetto condizionata 'traccia', vedi la discussione).
   12. Per gli studi CS, classificare un cambiamento vano all'interno della finestra di tempo critico di risposta come falso allarme, e si applicano gli Stati Uniti per un massimo di 10 secondi subito dopo CR inadeguato. Non applicare degli Stati Uniti dopo CS quando l'animale rimane nel vano (senza CR) durante la finestra di tempo critico, e classificare questo processo come corretto rifiuto.
       Nota: È importante sottolineare che il piede scossa Stati Uniti è sempre spenta, quando gli animali cambiano comparto in risposta ad essa (la fuga). Utilizzare finestre temporali più critici per le prove CS, ad esempio, se sono utilizzati stimolazione ripetitiva condizionata, anche se questo imporrà un criterio di apprendimento più conservatore in quanto offre maggiore sforzo da parte dell'animale di inibire la CR.
   13. Per un efficace associazione di CS e US regolare la forza d'urto in una gamma moderata per essere repulsivo ma non dolorosa. Initia Ottimaleforza attuale l differisce tra le specie (ad esempio, 50 μA per i topi, 200 μA per gerbilli). Pertanto, si prega di consultare i prossimi due proiettili per ulteriori dettagli tecnici:
       1. Adattare individualmente la forza d'urto nella prima sessione di allenamento inizia con ampiezze lievi (~ 200 μA per gerbilli). Se la forza d'urto del piede è troppo basso, la fuga jitter latenze e associazione tra CS e gli Stati Uniti non è ottimale.
       2. Prestare sempre attenzione se gli animali iniziano a vocalizzare e di congelare, in risposta al CS. In questa forza footshock caso è troppo alto. Questa risposta di paura condizionata interferisce con l'apprendimento evitamento.
   14. Determinare attentamente le latenze di fuga. Aumentare la forza d'urto del piede passo-passo se latenze di fuga sono più di 2 secondi dopo le prime 20 prove. Controllare dopo ogni allenamento se l'animale è sotto controllo shock, vale a dire, si vede sfuggire latenze notevolmente al di sotto di 2 sec.
       Nota: Tuttavia, evitare di aumentare il piedescossa forza troppo in fretta, come la strategia comportamentale di un animale molto stressato può ripiegare a risposte di fuga puri. Pertanto strettamente osservare il comportamento e in particolare le latenze di risposta mentre si regola l'ampiezza degli USA. Per un esempio vedere la Figura 3E.
   15. Se l'animale mostra la CR, interrompere immediatamente la presentazione del CS. Questo è fondamentale per il rafforzamento della risposta di evitamento.
   16. Se gli animali hanno acquisito una strategia di evitamento, vale a dire, mostrare a tutti adeguato CR CS, variare parametri (ICMS ampiezza, durata della fase, frequenza di ripetizione ecc) per eseguire le analisi psicometriche. Applicare parametrica variazione CS in modo a blocchi con gli Stati Uniti l'associazione, che però indurrà apprendimento e di adattamento.
       1. Per evitare questo, inizia con 15 a 30 prove della formazione originale, e quindi in modo casuale intervallare le variazioni CS senza Uniti come prove di laboratorio, tra le prove di formazione regolari con l'originale del CS. Al massimo use 25% di prove di laboratorio.
   17. Dopo la formazione rimuovere l'animale dalla camera di formazione e pulire accuratamente la scatola completa prima dell'allenamento della prossima animali. Cercate di evitare la formazione di diverse specie in un momento nella stessa scatola, come il loro odore naturale potrebbe interferire con le prestazioni di formazione.
2. Analisi dei dati di allenamento
   1. Registrare tutte le modifiche vano in fase di assuefazione.
   2. Registrare tutti i cambiamenti vano durante l'allenamento e dividerlo in colpi e falsi allarmi, la fuga risposte (mancate e navette indietro dopo un falso allarme) e navette tra le prove spontanee (ITS).
   3. Calcolare i tassi di CR per CS + e CS come segue: i tassi di successo = hits / numero di + prove CS; falsi allarmi = falsi allarmi / numero di prove CS.
   4. Ottenere i tassi di CR session-saggio. Tuttavia, per valutare le dinamiche di apprendimento ad una risoluzione temporale superiore, calcolare i tassi di CR da blocchi più corti dello stesso numero di CS + e sperimentazioni CS- ( eg, n = 10), rispettivamente.
   5. Plot CR tariffe in funzione della sessione o blocco di prova per valutare le dinamiche di formazione di progresso e di apprendimento.
   6. Per la quantificazione della sensibilità comportamentale indipendente dalle condizioni sperimentali di polarizzazione della risposta dell'animale, ricavare valori d 'basati sulla teoria rilevamento del segnale ^8,9,17.
   7. Per d 'uso analisi Z-score di corrispondenti tassi di successo e falso-allarme (learning discriminazione) o colpiti prezzi e ITS (apprendimento rilevazione) derivati ​​dai inverse di una funzione di distribuzione normale standardizzata e sottrarre queste z-score. Impostare un criterio di soglia per il rilevamento di stimolo d '= 1,0, che corrisponde ad un dosaggio di una deviazione standard sopra il rumore del segnale. Vedere la Figura 3 come esempio.
   8. Inoltre determinare CR- e fuggire tempi di reazione in risposta a diverse CS misurando il periodo di tempo tra CS insorgenza e risposta comportamentale (vano completocambiare).
   9. Ottenere un'analisi più dettagliata del comportamento dal videoregistrando il comportamento shuttle-box. Ottenere la sincronizzazione temporale tra sistemi video e di registrazione registrando impulsi di comando dalla navetta-box o di un sistema di stimolazione sulla traccia audio del video. Analisi video permette di attenzione asini e di orientamento risposte dell'animale precedente CR.

4. Tecniche Vivo elettrofisiologici in Animali Learning

1. Registrazione elettrofisiologica durante l'allenamento
   1. Durante l'addestramento, registrare i segnali elettrofisiologici (ad esempio, con i ECOG-array descritti) da elettrodi multipli monopolarly contro l'elettrodo di riferimento comune / terra.
   2. Segnali prime di tutti gli elettrodi in un amplificatore headstage o collegati direttamente o tramite un adattatore di breve nei connettori di testa.
   3. Collegare headstage all'amplificatore principale attraverso un cablaggio di sottili cavi flessibili avvoltoda una maglia metallica per proteggerlo da danni causati da morsi di animali.
      Nota: lo stress meccanico nel cablaggio può essere alleviato da una molla che permette ulteriormente la libera circolazione e la rotazione degli animali nella casella. Ideale è l'utilizzo di una parte girevole e girevole motorizzato. Tuttavia, per gli esperimenti uditivi posizionare il girevole all'esterno della camera insonorizzata o schermo sano con schiuma per ridurre il rumore ad alta frequenza acustica prodotta dal suo motore.
   4. Utilizzare un preamplificatore nella casella schermato per aumentare il rapporto segnale-rumore e filtro passa-banda del segnale nella gamma di frequenza desiderata.
   5. Dati campione a più di 1 kHz frequenza di campionamento (per il campo locale potenziali registrazioni) e almeno 40 kHz (per azione potenziali registrazioni) e conservare al PC per l'analisi offline. Utilizzare le impostazioni dei filtri adatti per entrambi i tipi (ad esempio 2 - 300 Hz per il potenziale campo locale, 300 - 4000 Hz per potenziali d'azione).
   6. Controllare attentamente la qualità della registrazione prima dell'inizio della tPiove (nessun rumore o artefatti di movimento). Applicare un FFT-filtro in linea per il segnale per determinare l'ampiezza del rumore 50 Hz. Se necessario ricontrollare tutti i collegamenti tra il connettore testa, gli adattatori, i headstages, il cablaggio, e gli amplificatori.
   7. Per la riduzione di artefatti nei dati registrati evocati da stimolazione elettrica utilizzare un procedimento di interpolazione per ricostruire tutti i punti dati interessati dal manufatto 1 ms prima fino ~ 5 ms dopo l'inizio di ciascun impulso. Per questo, inserire zeri tra i punti dati inalterati, e applicare un filtro FIR-simmetrica che riduce al minimo gli errori medi quadrati tra i punti interpolati ed i loro valori ideali (funzione interp.m di Matlab). Applicare questa procedura per il segnale grezzo, separatamente ciascun canale prima di ulteriori analisi ^9.
2. Dettagli tecnici di formazione navetta-box parallelo, ICMS, e la registrazione
   1. In generale, in modo che gli animali sentirsi a proprio agio nella surroundi scatolang. Permettere agli animali di muoversi liberamente e raggiungere tutti gli angoli della scatola. Tempo sufficiente per abituare un giorno prima del primo allenamento (20 min) e prima di ogni sessione (3 min) è benefico.
   2. Dopo ogni trattamento chirurgico, lasciare il tempo sufficiente animale per recuperare compresi i farmaci, se necessario (vedi sopra 2.17) e iniziare ad allenarsi solo l'animale, se gli animali non mostrano alcun segno tipici di soffrire o di dolore (occhi chiusi, fenotipo letargica, pelliccia trasandato ^20).
   3. Garantire la corretta messa a terra del piano della griglia. Loop di massa tra il sistema di registrazione, shuttle-box e l'animale deve essere evitato. A terra l'animale solo tramite l'elettrodo di un terreno comune, lasciando il gridfloor ad una tensione fluttuante.
   4. Collegare lo stimolatore multicanale (MCS STG2000) al connettore capo della matrice di elettrodi di stimolazione impiantato attraverso linee separate della girevole motorizzato.
   5. Utilizzare l'elettrodo di terreno comune della registrazione come terra o elettrodo di ritorno per l'ICMS, pure.

5. Analisi istologica di elettrodi posizioni

1. In seguito il set completo di formazione, il controllo per la posizione stabile della matrice di elettrodi di stimolazione mediante analisi istologica.
2. Anaesthetize animali con una iniezione ip di una miscela di ketamina (100 mg / kg) e xilazina (5 mg / kg) diluito in 0,9% sterile di sodio cloruro. Quindi applicare corrente catodica monopolare (30 μA per 60 sec) erogata attraverso tutti i canali di stimolazione per ottenere deposito di ferro nel tessuto in corrispondenza della posizione di fissaggio ^8.
3. Seguendo questa procedura, sacrificare l'animale in modo appropriato e approvato dell'eutanasia (ad esempio iniezione intraperitoneale di una overdose di pentobarbital; 100 mg / kg).
4. Rimuovere il cervello dell'animale immediatamente e congelare in 2-metilbutano raffreddata a -70 ° C in azoto liquido.
5. Ora tagliare la regione di interesse su un microtomo criostato in 50 micron hsezioni ORIZZONTALI.
6. Istologia: -staining Nissl e "Blu di Prussia"
   1. Per l'identificazione di strati corticali trattare ogni secondo fetta con Nissl macchia. Innanzitutto, il bagno fette 5 min in 0,05 M tampone sodio acetato triidrato (pH 4.0 -4.2).
   2. Bagnare le fette per 5 - 10 minuti a 5% di acetato violetto cresolo. Sciacquare fette con acqua distillata.
   3. Bagnare fette per 2 min consecutivamente 0,05 M tampone sodio acetato triidrato (pH 4.0 - 4.2), e in soluzioni di 50%, 70% e il 90% di etanolo, rispettivamente.
   4. Bagnare le fette due volte in isopropanolo: 96% etanolo (2: 1) per 5 minuti ciascuno.
   5. Infine, il bagno fette in Roticlear tre volte per 5 min.
   6. Ottenere posizione dei canali di stimolazione da "Blu di Prussia" -staining di ogni altra sezione che rende la deposizione di ferro evocata da lunghe correnti monofasici dopo gli esperimenti visibili.
   7. Preparare una soluzione fresca di 1% hexacyanoferrat potassio (II) triidrato K ₄[Fe (CN) _6] miscelando 2 g di K ₄ [Fe (CN) _6] in 200 ml di HCl 1%.
   8. Aggiungere 800 ml di tampone fosfato 0,1 M (pH 7,4).
   9. Bagnare fette di cervello per 10 minuti con acqua distillata, e poi per 10 min nella soluzione hexacyanoferrat.
   10. Bagnare fette due volte per 10 min in tampone fosfato 0,1 M e infine per 5 minuti in acqua distillata.

Risultati

Questa sezione illustra un esempio rappresentativo di apprendimento shuttle-box in un gerbillo mongolo. Il soggetto è stato addestrato per discriminare il sito ICMS tra due elettrodi di stimolazione impiantato 700 micron uno dall'altro nella corteccia uditiva (figure 1 e 2). Array di stimolazione possono essere personalizzati in diversi modelli spaziali (Figura 1). Qui, la discriminazione dei due siti ICMS è appreso entro 3 allenamenti con la presentazione di 30 CS + e CS-ciascuno...

Discussione

Questo protocollo descrive un metodo di ICMS simultanei site-specific e registrazioni elettrofisiologiche multicanale in un animale di apprendimento utilizzando un avversivo piede-shock sistema di navetta-box controllato a doppio senso. Il protocollo sottolinea concetti tecnici chiave per tale combinazione e sottolinea l'importanza della messa a terra della animale solo tramite l'elettrodo di un terreno comune, lasciando il gridfloor ad una tensione fluttuante. Qui, uditivo apprendimento navetta-box è stato app...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Teflon-insulated stainless steel wire	California Fine Wire		diam. 50µm w/ isolation
Pin connector system	Molex Holding GmbH	510470200	1.25 mm pitch PicoBlade
TEM grid Quantifoil	Science Services	EQ225-N27
Dental acrylic Paladur	Heraeus Kulzer	64707938
Hand-held drill OmniDrill35	WPI	503599
Ketamine 500mg/10ml	Ratiopharm GmbH	7538837
Rompun 2%, 25ml	Bayer Vital GmbH	5066.0
Sodium-Chloride 0.9%, 10ml	B.Braun AG	PRID00000772
Lubricant KY-Jelly	Johnson & Johnson
Shuttle-box E10-E15	Coulbourn Instruments	H10-11M-SC
Stimulus generator MCS STG 2000	Multichannel Systems
Plexon Headstage cable 32V-G20	Plexon Inc.	HSC/32v-G20
Plexon Headstage  32V-G20	Plexon Inc.	HST/32v-G20
PBX preamplifier 32 channels	Plexon Inc.	32PBX box
Multichannel Acquisition System	Plexon Inc.	MAP 32/HLK2
Cryostate CM3050 S	Leica Microsystems GmbH
Signal processing Card Ni-Daq	National Instruments
Lab StandardTM Stereotaxic Instruments	Stoelting Co.
Audio attenator g.pah	g.pah Guger technologies
Cresyl violet acetate	Roth GmbH	7651.2
Roticlear	Roth GmbH	A538.1
Sodium acetate trihydrate	Roth GmbH	6779.1
Potassium hexacyanoferrat(II) trihydrate	Roth GmbH	7974.2
Di-sodium hydrogen phospahte dihydrate	Merck	1,065,801,000
ICM Impedance Conditioning Module	FHC	55-70-0
Animal Temperarture Controler	World Precision Instruments	ATC2000