Elettrofisiologia su isolati tronco cerebrale, midollo spinale Ammassi di Newborn Roditore Consente Neural Network respiratoria registrazione Uscita

Riepilogo

The central respiratory drive is located in the brainstem. Spontaneous respiratory motor output from an isolated brainstem-spinal cord is recorded by placing an electrode on the fourth ventral root. This experimental approach is valuable for pharmacological investigations or the assessment of respiratory challenges and genetic manipulations on rhythmic motor behavior.

Abstract

While it is well known that the central respiratory drive is located in the brainstem, several aspects of its basic function, development, and response to stimuli remain to be fully understood. To overcome the difficulty of accessing the brainstem in the whole animal, isolation of the brainstem and part of the spinal cord is performed. This preparation is maintained in artificial cerebro-spinal fluid where gases, concentrations, and temperature are controlled and monitored. The output signal from the respiratory network is recorded by a suction electrode placed on the fourth ventral root. In this manner, stimuli can be directly applied onto the brainstem, and the effect can be recorded directly. The signal recorded is linked to the inspiratory signal sent to the diaphragm via the phrenic nerve, and can be described as bursts (around 8 bursts per minute). Analysis of these bursts (frequency, amplitude, length, and area under the curve) allows precise characterization of the stimulus effect on the respiratory network. The main limitation of this method is the viability of the preparation beyond the early post-natal stages. Thus, this method greatly focuses on the study of the whole network without the peripheral inputs in the newborn rat.

Introduzione

La respirazione è un complesso e vitale attività controllata dal cervello, permettendo diossigeno (O ₂₎ e l'assorbimento di anidride carbonica (CO ₂₎ eliminazione. Il drive respiratorio centrale è generato da una complessa rete situata nel tronco cerebrale in entrambi i mammiferi ^{1, 2} anfibi, rettili, uccelli ^{3 4 5} e pesci. Anche se lo studio di respirazione può essere elaborata in vivo, precise indagini meccanicistiche richiedono l'accesso diretto alla rete di controllo respiratorio. A tal fine, Adrian e Buytendijk sviluppato una ridotta preparazione pesci rossi, in cui elettrodi posti sulla superficie del tronco cerebrale record ritmo generato associato ventilazione gill ^5. Questo approccio è stato in seguito adattato da Suzue nel 1984 ⁶ per l'impiego nei roditori appena nati. L'avvento di questa preparazione ha portato a significativi progressi nella neurobiologia respiratoria. Poiché è relativamente semplice, la tecnica presentato here è suscettibile di una vasta gamma di ricerche di base di comportamenti motori ritmici e le loro origini nei roditori appena nati.

L'obiettivo generale di questo metodo è quello di registrare il correlato neurale di attività inspiratoria, un ritmo respiratorio simile chiamato respirazione fittizia, prodotta dalla rete respiratoria. Questo metodo può essere impiegato in una vasta gamma di obiettivi di ricerca, puntando risposte inspiratori alle variazioni respiratorie o farmacologia in entrambi i selvatici tipo ⁷ e ^{8 animali} transgenici. Dato che gli esperimenti vengono eseguiti a bassa temperatura, senza afferenti sensoriali, e in condizioni in cui le concentrazioni di glucosio e O ₂ ai aCSF sono alti, questioni sono state sollevate per quanto riguarda la rilevanza fisiologica del segnale registrato. Mentre vi sono chiare differenze tra in vivo e in vitro condizioni (ad es., La frequenza di raffiche inspiratori) resta il fatto che la presenza digli elementi fondamentali della rete respiratoria ⁶ permettono di studiare un ritmo robusto associato ad una funzione omeostatica vitale ^9,10.

La logica dietro lo sviluppo e l'utilizzo di questa tecnica è quello di facilitare l'accesso diretto agli elementi del tronco della rete respiratoria, che sono difficilmente accessibili in vivo, soprattutto nei neonati. Il tronco encefalico è posto in condizioni rigorosamente controllate: il ritmo registrato non è modulato da input afferenti periferici dai polmoni o gli organismi carotidei, permettendo lo studio di concentrarsi sul drive respiratorio centrale stessa ^11. Così, questo accesso è utilizzato per applicare stimoli e registrare il segnale di uscita. In contrasto con pletismografia registrazioni, il ritmo respiratorio è modulata da tutti i suoi componenti in tutto il corpo (ad es., Distensione polmonare, chemosensori periferiche), rendendo difficile applicare stimoli precisi.

In unratto ewborn, il protocollo consiste nel registrare il quarto segnale ventrale root su un tronco isolato e midollo spinale troncato, mantenuto in fluido cerebrospinale artificiale (aCSF). Il ritmo generato dai preparativi del midollo spinale tronco-è composto da singole raffiche lenti che sono collegati al segnale inspiratorio ^9. Isolato preparativi del midollo spinale tronco-sono facilmente registrabili in ratti da post-natale giorno 0-4 (P0 - P4) ^7. Questo approccio è comunemente utilizzato per valutare la risposta ipossica della rete respiratoria, e anche la risposta ai ipercapnia, acidosi o droghe. Un protocollo acuta all'ipossia è presentato qui. Questa stimolazione è ottenuto dal prelievo di O _{2 nel} aCSF; questo approccio è comunemente utilizzato per valutare la tolleranza e la risposta agli insulti ipossici. Il protocollo induce una depressione ritmo dal primo minuto fino alla fine dell'esposizione ipossia (Figura 1) ^12. Questa depressione è invertitadurante la post-ipossica ¹² recupero. Per quanto riguarda il disegno sperimentale, è importante notare che il ponte, si trovano nella parte rostrale del tronco cerebrale, ha un'azione inibitoria sul generatore ritmo ^8. Così, preparazioni di piena del tronco encefalico e del midollo spinale rostrale mostrano un ritmo inferiore. L'inclusione del ponte del campione isolata per la registrazione è determinato secondo il fine dell'esperimento ^13; studio dell'influenza pontino sulla rete midollo allungato richiederebbe registrazioni con e senza il ponte di confrontare i risultati ^14. Inoltre, uno dei vantaggi di questa tecnica è la possibilità di estendere la parte rostrale della preparazione per includere mesencefalico e / o regioni diencefaliche ^15,16, che consenta di valutare l'effetto di queste regioni della rete respiratoria ponto-midollare.

Protocollo

Questo metodo richiede l'utilizzo di soggetti animali, consentite dalla Laval University comitato etico degli animali (protocollo # 2012-170).

1. Impostazione e preparazione

1. Soluzioni
   1. Preparare soluzioni aCSF secondo le seguenti ricette ^7,17. Altre ricette con variazioni di concentrazione sono disponibili in letteratura. Soluzioni memoria Stock a 4 ° C per un massimo di un mese.
      1. Soluzione salina: aggiungere 75,39 g di NaCl (129 mm finale); 2,5 g di KCl (3,35 mM finale); 0,81 g di NaH2PO4 (0,58 mM finale); 2,33 g di MgCl2 (1,15 mM finale); 1,85 g di CaCl2 (1,26 mM). Sciogliere in 800 ml di acqua distillata poi riempire a 1 L con acqua distillata.
      2. Soluzione di bicarbonato: aggiungere 17,65 g di _NaHCO 3 (21 mm finale). Sciogliere in 900 ml di acqua distillata poi riempire a 1 L con acqua distillata. Variazioni della concentrazione di bicarbonato provocheranno variazioni di pH.
      3. Soluzione di glucosio: aggiungi 54.06g di glucosio (30 mM finale). Sciogliere in 400 ml di acqua distillata poi riempire a 500 ml con acqua distillata.
   2. Preparare aCSF diluendo 100 ml di soluzione salina, 100 ml di soluzione di bicarbonato, e 50 ml di soluzione di glucosio in 1 L di acqua distillata. Conservare a 4 ° C fino al momento dell'uso.
   3. Preparare un elettrodo di vetro riscaldando e si estende un tubo di vetro fino a rompersi. Sand giù la punta prima dell'uso. L'elettrodo può essere riutilizzato molte volte finché rimane pulito.
2. Setup sperimentale
   Nota: I dati di set-up sono presentati nella figura 2.
   1. Accendere l'amplificatore, averager, sistema di acquisizione dati, controllo della temperatura e della pompa in movimento. Controllare l'amplificazione del segnale (guadagno = 10.000), la filtrazione (soglia bassa, 10 Hz; soglia alta, 5 kHz), e la frequenza di campionamento della conversione da analogico a digitale del segnale grezzo (2,5 kHz).
   2. Riempire una bottiglia con aCSF e bolla con CarboGen (95% O ₂ , 5% di CO _2). Inducono una bubbled- e riscaldato aCSF flusso nella camera di registrazione (volume 5 ml) a 4 ml / min. Mantenere la temperatura nella camera di registrazione a 26 (± 1) ° C. pH deve essere 7,4 in queste condizioni standard.
   3. Conservare 50 ml di RT e CarboGen-bolle aCSF in una siringa da 50 ml in prossimità della camera di dissezione.
   4. Accendere il computer e avviare il software di registrazione.

2. Dissection

1. Pesare e determinare visivamente il sesso dell'animale (i maschi hanno un ano-genitale distanza più lunga, mentre le femmine hanno un breve tratto ano-genitale, i maschi genitali sono spesso oscuro mentre genitali femminili sono di colore rosa).
2. Anestetizzare i roditori neonati da una delle seguenti opzioni: cryoanesthesia (immergere completamente l'animale in ghiaccio per 4 - 5 min ^18), iniezione (equitensine a 4 ml / kg) ^{19 o} inalazione di anestetici volatili (isoflurano ²⁰ o etere ^21). Confirm un piano adeguata di anestetici dall'assenza di un ritiro riflesso zampa.
3. Posto l'animale in panchina, faccia ventrale giù. Sezione della parte rostrale della testa coronale con un bisturi a livello di bregma (visibile attraverso la pelle e il cranio). Eseguire questo passaggio subito dopo che l'animale è anestetizzato.
4. Sezione coronale il corpo con un bisturi sotto i membri anteriori.
5. Togliere la pelle, i muscoli, tessuti grassi e viscere con le forbici chirurgiche e sottili e pinze. Dal momento che le ossa sono morbidi a questa età, essere prudenti per non danneggiare il sistema nervoso. Eseguire questo passaggio in panchina.
6. Posizionare la preparazione nella camera dissezione. Utilizzare il aCSF memorizzato nella siringa per ossigenare preparazione. Da questo punto alla fine della registrazione, utilizzare un microscopio.
7. Sulla faccia dorsale del preparato, tagliare il cranio e vertebre dal rostrale alla parte caudale lungo l'asse medio con forbici chirurgiche e sottili e pinze. Aprire il cranio taglioe vertebre, al fine di esporre il tessuto nervoso. Utilizzare il aCSF strored nella siringa per ossigenare la preparazione.
8. Con le pinze, rimuovere la membrana aracnoidea, un sottile tessuto che ricopre la superficie del tessuto nervoso. Conservare la pia madre e vasi sanguigni contro il tessuto nervoso. Utilizzare il aCSF memorizzato nella siringa per ossigenare preparazione.
9. Posizionare la preparazione con il dorso rivolto verso il basso, e con attenzione abbassare il tronco encefalico e del midollo spinale tagliando i nervi e tessuto connettivo con le forbici mentre si tiene la preparazione sul posto. Un approccio dorsale è anche possibile. Mantenere le radici e nervi più a lungo possibile. Togliere le ossa per isolare il tronco encefalico e del midollo spinale. Utilizzare il aCSF memorizzato nella siringa per ossigenare preparazione.
10. Rimuovere il cervelletto e rimanendo strutture rostrali da loro sezionamento con il bisturi. Utilizzare il aCSF memorizzato nel ago per ossigenare preparazione.
11. Opzionalmente seconda sperimenprogettazione tal, rimuovere il ponte con il bisturi da una sezione anteriore coronale alla inferiore arteria cerebellare ^22. Notare che mantenendo tutta ponte rallenterà il ritmo in ratti e completamente inibirla in topi. Preparazioni che includono solo la parte caudale del ponte mostrano una attività respiratoria simile con una frequenza stabile alla radice C4.

3. Registrazione

1. Mettere il preparato in camera di registrazione, ventrale a faccia in su. Fissare la preparazione con perni nella parte più bassa del midollo spinale e rostrale-maggior parte del tronco cerebrale.
2. Utilizzando una siringa collegata all'elettrodo dal suo ago, indurre una depressione nell'elettrodo (diametro punta di vetro: 150 - 225 micron) tirando il pistone della siringa, per riempire parzialmente l'elettrodo con aCSF.
3. Utilizzando un micromanipolatore, posizionare accuratamente l'elettrodo vicino ad una delle quarte radici ventrali. Altre radici ventrali potrebbero anche presentare una delle vie respiratorie come l'attività (e.g., XII nervo cranico, C1 radice ventrale).
4. Inducono una depressione nel serbatoio dell'elettrodo tramite la siringa estraendo lo stantuffo per aspirare delicatamente il rootlet nervo. Quindi spostare accuratamente l'elettrodo di applicare contro il midollo spinale.
   Nota: Idealmente la dimensione del rootlet corrisponde alla dimensione dell'apertura elettrodo e crea una tenuta tra i compartimenti interni ed esterni dell'elettrodo così. Poiché gli amplificatori differenziali sono comunemente utilizzati per tali registrazioni, ogni apertura tra l'interno dell'elettrodo e la camera di registrazione riduce la qualità del segnale e rende difficile per eliminare il rumore di fondo.
5. Avviare la registrazione.
6. Registra il ritmo prodotto dalla preparazione in condizioni di normossia (cioè, aCSF gorgogliare con CarboGen: 95% O ₂ e 5% CO ₂₎ per almeno 20 minuti per determinare i parametri di base della preparazione.
7. Passare la perfusione da CarboGen-bolle aCSF astimolo aCSF (cioè, con il 95% gorgogliare _N 2 e 5% di CO _{2 per} ipossia stimolo) per 15 min. Alter durata dell'esposizione a seconda del protocollo sperimentale. Registrare la durata dell'esposizione sulla registrazione degli animali e scheda tecnica. Utilizzare tubi in acciaio inossidabile tra il flacone e la camera aCSF quando possibile per evitare la diffusione di gas verso l'esterno del tubo.
8. Accendere la perfusione torna a aCSF CarboGen-bolle standard per almeno 15 minuti per una registrazione di recupero. Registrare questo sulla registrazione degli animali e scheda tecnica.
9. Terminare la registrazione.

4. Analisi statistica

1. Dal segnale integrato, calcolare la frequenza del numero di burst per minuto (espressa in burst / min), l'ampiezza come differenza tra la linea di base e il picco del burst (espressa in mV), la durata di scoppio della durata da l'inizio e la fine del burst (espresso in s), l'area di scoppio come l'area sotto la curve del burst sul segnale integrato (espressa in mV · s) (Figura 3).
2. Calcolare la frequenza, ampiezza, durata scoppiare e zona scoppiare sotto normossia (baseline), ipossia (stimolo) e post-ipossia condizioni (post-stimolo) di recupero come la media degli ultimi 5 minuti delle registrazioni per ogni condizione. Non analizzare la prima porzione di ciascuna condizione perché c'è un ritardo tra l'accensione e perfusione aCSF omogeneizzazione nella camera di registrazione.
3. Express poi stimolo (cioè, ipossia) e post-stimolo (cioè, dopo ipossia) valori di recupero come percentuale dei valori di base per la registrazione corrispondente. Esprimere i risultati come media ± SD

Risultati

Come accennato nell'introduzione, uno dei vantaggi più importanti di questa tecnica è l'accesso diretto al tronco cerebrale applicare vari stimoli. Come esempio, ipossia stato applicato qui. Figura 1. AB mostra una registrazione completa protocollo, con entrambe le condizioni normossia e ipossia. Figura 1.CE visualizza il ritmo registrata in condizioni di normossia (cioè, aCSF gorgogliare con 95% O ₂ e 5% CO ₂ a 26 ° C). Come già illustrato in...

Discussione

Quantificazione accurata dell'attività respiratoria può essere impegnativo. Infatti, la respirazione è una funzione che può essere sia automatica e volontaria, e che è modulata in base all'ambiente, le esigenze del corpo, lo stato emotivo ed il comportamento. Il vantaggio di questa tecnica è l'isolamento degli elementi neurali responsabili della produzione del comando respiratoria. Così, registrazioni elettrofisiologiche di preparati midollo spinale e tronco-pletismografia sono tecniche complementari ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sylgard	Sigma Aldrich	761036-5EA	Use under hood
NaCl	Bioshop	SOD002
KCl	Bioshop	POC888
CaCl2	Bioshop	CCL444
MgCl2	Bioshop	MAG510
NaHCO3	Bioshop	SOB999
NaH2PO4	Bioshop	SPM306
D-glucose	Bioshop	GLU501
Carbogen	Linde	343-02-0006
Temperature Controller	Warner Instruments, Hamden, CT, USA	TC-324B
Suction electrode	A-M Systems, Everett, WA, USA	model 573000
Differential AC amplifier	A-M Systems, Everett, WA, USA	model 1700
Moving averager	CWE, Ardmore, PA, USA	model MA-821
Data acquisition system	Dataq Instruments, Akron, OH, USA	model DI-720
LabChart software	ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA
Prism sofware	Graphpad, La Jolla, CA, USA
Dissection chamber	Plastic box (e.g. petri box) will do
Recording chamber	Home made
Base	Kanetec, Bensenville, IL, USA	MB
Micromanipulator	World Precision Instrument Inc, Sarasota, FL, USA	KITE-R
Base	Kanetec, Bensenville, IL, USA	MB
Peristaltic pump	Gilson, Middleton, WI, USA	MINIPULS 3
Faraday Cage	Home made
Computer