Interfacciamento 3D Engineered neuronali Culture a Micro-Electrode Array: Un innovativo<em&gt; In Vitro</em&gt; Modello sperimentale

Riepilogo

In this work, a novel experimental model in which 3D neuronal cultures are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are built by seeding neurons in a scaffold made up of glass microbeads on which neurons grow and form interconnected 3D structures.

Abstract

Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the gold-standard experimental model to study basic neurophysiological mechanisms involved in the formation and maintenance of neuronal cell assemblies. However, in vitro studies have been limited to the recording of the electrophysiological activity generated by bi-dimensional (2D) neural networks. Nonetheless, given the intricate relationship between structure and dynamics, a significant improvement is necessary to investigate the formation and the developing dynamics of three-dimensional (3D) networks. In this work, a novel experimental platform in which 3D hippocampal or cortical networks are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are realized by seeding neurons in a scaffold constituted of glass microbeads (30-40 µm in diameter) on which neurons are able to grow and form complex interconnected 3D assemblies. In this way, it is possible to design engineered 3D networks made up of 5-8 layers with an expected final cell density. The increasing complexity in the morphological organization of the 3D assembly induces an enhancement of the electrophysiological patterns displayed by this type of networks. Compared with the standard 2D networks, where highly stereotyped bursting activity emerges, the 3D structure alters the bursting activity in terms of duration and frequency, as well as it allows observation of more random spiking activity. In this sense, the developed 3D model more closely resembles in vivo neural networks.

Introduzione

In vitro bidimensionali (2D) reti neurali accoppiati a micro-elettrodi Array (MEA) arethe modello sperimentale gold-standard adottato per studiare l'interazione tra la dinamica neuronale e la connettività di base. Durante lo sviluppo, i neuroni ricreano reti complesse che mostrano ben definedspatio-temporalpatternsof attività ^1,2 (cioè, scoppi, esplosioni di rete, attività chiodare casuale). MEA registrare l'attività elettrofisiologica da molti siti (da decine a migliaia di microelettrodi), che consente un esame approfondito delle dinamiche espresse a livello di rete. Inoltre, l'uso di colture dissociate rende possibile progettare-reti ingegnerizzati. È facile capire in questo modo le relazioni funzionali tra dell'attività elettrofisiologica registrata ei parametri dell'organizzazione network come densità cellulare ^3, grado di modularità ^4,5, presenza di eterogenea pop neuronaleulations ^6, ecc, tuttavia, tutti gli studi in vitro su cellule in coltura dissociate sono basati su reti neuronali 2D. Questo approccio porta a semplificazioni rispetto al sistema in vivo (intrinsecamente 3-dimensionale, 3D): (i) in un modello 2D, somata e coni di crescita sono appiattite e la conseguenza assoni-dendriti non può diffondere in tutte le direzioni ^7. (ii) 2D in vitro reti mostra stereotipata dinamiche elettrofisiologiche dominati da scoppio attività che comporti la maggior parte dei neuroni della rete ^8.

Recentemente, diverse soluzioni sono state sviluppate per consentire la costruzione di in vitro 3D dissociato reti neuronali. L'idea comune consiste nella creazione di un ponteggio in cui i neuroni possono crescere in modo 3D. Tale impalcatura può essere realizzato con gel polimerici e solidi matrici porose ^9-13. Sfruttando le proprietà meccaniche dei polimeri, è possibile incorporare all'interno delle cellule these strutture definendo un blocco omogeneo di culture 3D di neurosfere ^11. La caratteristica principale di questo approccio è la proprietà meccanica rigida delle neurosfere ^9,12. Tuttavia, questi materiali hanno limitato la porosità, e non garantisce la migrazione delle cellule all'interno della matrice. Per ovviare a questo inconveniente, una possibile soluzione consiste nel tagliare la matrice in moduli 'unità'. Purtroppo, la dimensione e la forma delle particelle diversità potrebbe ostacolare l'imballaggio in strutture stratificate regolare. In ^7, Cullen e colleghi hanno progettato un costrutto neuronale 3D fatta di neuroni e / o astrociti all'interno di un ponteggio a matrice extracellulare bioattivi. Tale tessuto neurale progettata consentito in Studi in vitro per studiare e manipolare le risposte neurobiologiche all'interno di micro-ambienti 3D. Questo modello consisteva di neuroni e glia distribuiti in tutta la matrice extracellulare (ECM) e / o ponteggi idrogel (spessore 500-600 micron). In questo condition, una vitalità cellulare ottimale (superiore al 90%) è stato trovato placcando le cellule ad una densità finale di circa 3.750 - 5.000 cellule / ^mm3. Si deve notare che tale valore di densità è di gran lunga inferiore a quello nella condizione in vivo, in cui la densità delle cellule della corteccia cerebrale mouse è circa 90.000 cellule / ^mm 3 ^14. Per superare questa limitazione Pautot e collaboratori ¹⁵ realizzato un sistema 3D in vitro dove la densità cellulare e la connettività di rete sono controllati per assomigliare in condizioni in vivo consentendo imaging in tempo reale della rete. In pratica, questo metodo si basa sul concetto che dissociata neuroni in coltura sono in grado di crescere su microsfere di silice. Queste perle forniscono una superficie di crescita abbastanza grande per i corpi cellulari neuronali di aderire e per i loro arborizzazioni per crescere, maturare, estendere, e definire contatti sinaptici con altri neuroni. Questo metodo sfrutta le proprietà di assemblaggio spontanei di perline monodisperse a form 3D strati array esagonale contenenti sottoinsiemi distinti di neuroni su livelli diversi con connettività vincolata tra i neuroni in diverse sfere. La densità cellulare ottenuta con questo metodo è stato di circa 75.000 ^cellule / mm3.

Recentemente, abbiamo adattato il metodo di Pautot di MEA ^16: i risultati ottenuti mostrano che l'attività elettrofisiologica 3D presenta un repertorio più ampia di attività rispetto a quello espresso dalle reti 2D. Culture mature 3D mostrano una dinamica rafforzata cui sia scoppio rete e casuale coesistono attività picco. Analogamente, Tang-Schomer e collaboratori ¹⁷ realizzato uno scaffold poroso a base di proteina di seta che mantiene una cultura corticale primaria in vitro per alcuni mesi, e registrato l'attività elettrofisiologica mediante un elettrodo di tungsteno.

In questo lavoro, le procedure sperimentali per costruire reti neuronali 3D accoppiati a MEA sarà descritta.

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Protocollo

Il protocollo sperimentale è stato approvato dalla cura degli animali Legislazione Europea (2010/63 / UE), dal Ministero della Salute italiano, secondo la DL 116/1992 e dalle linee guida dell'Università di Genova (Prot. N. 13130, maggio 2011). Sono stati fatti tutti gli sforzi per ridurre il numero di animali per il progetto e per ridurre al minimo la loro sofferenza.

1. Preparazione dei Materiali e supporti

1. Costruire lo stampo per costruire le PDMS (Poly-dimetil-silossano) vincolo mediante un CNC (Computer Numerical Control) fresatrice. Tale stampo è realizzato in policarbonato con cilindro centrale in politetrafluoroetilene (PTFE). Questo materiale consente una più facile estrazione della maschera quando il PDMS è indurito.
   NOTA: Il design dello stampo è stata eseguita da Computer-Aided-Design (CAD) e poi consegnato alla fresatrice CNC.
2. Preparare l'elastomero PDMS. PDMS è un polimero organico. Esso è composto da due elementi, Un agente di indurimento e un polimero. Mescolare con un rapporto volumetrico 1:10, una parte di agente indurente e nove parti di polimero. Mettere i due componenti in una capsula di Petri, agitare e inserire la miscela nella camera a vuoto per 10 minuti per eliminare le bolle d'aria. 3 g di PDMS sono sufficienti per un vincolo.
3. Costruire il vincolo PDMS. Inserire il materiale PDMS nel modellatore e metterla in forno per 30 minuti a 120 ° C. Il vincolo PDMS ha la forma di un cilindro ideale, con un diametro esterno e interno di 22,0 mm e 3,0, rispettivamente, e un'altezza di 650 micron.
4. Il giorno prima della placcatura, coppia la maschera per l'area attiva delle matrici Micro-elettrodo (MEA) per mezzo di una pinzetta allo stereomicroscopio e sterilizzare la maschera PDMS in forno a 120 ° C.
5. Sterilizzare le microsfere di vetro (diametro nominale di 40 ± 2 micron; diametro medio certificato di 42,3 ± 1,1 micron) in etanolo al 70% per 2 ore in un flaconcino conica e ruotare every 30 minuti per esporre tutte le microsfere.
6. Rimuovere la soluzione di etanolo dal flaconcino e lavare le microsfere due volte con acqua sterilizzata.
7. Condizionare la parte centrale della zona MEA delimitata dalla maschera PDMS (diametro pari a 3,0 mm) con 24 ml di soluzione mista di poli-D-lisina e laminina a 0,05 ug / ml.
8. Rivestire le microsfere con proteine ​​di adesione, laminina e Poly-D-lisina a 0,05 mg / ml e lasciare per una notte in incubatore a 37 ° C, per ottenere una rete neuronale stabile e duratura.
9. Rimuovere i fattori di adesione sia dalla superficie del vetro del MEA e dalle microsfere di vetro. Aspirare circa il 95% della soluzione di rivestimento con una pipetta e applicare una piccola volume- 24μl- di acqua sterile sulla superficie MEA. Aspirare ancora più del 95% dell'acqua e lasciare che il MEA secca sotto il cofano laminare per 1 ora prima della placcatura cellule.
   NOTA: Nel caso di microsfere invece, aspirare il rivestimentosoluzione e fare un primo lavaggio con acqua sterilizzata e un secondo con il mezzo basale e il suo supplemento come B27, per condizionare la superficie di vetro in cui verranno piastrate neuroni. Non lasciate che le microsfere asciugare. Lasciarli in sospensione nel mezzo di coltura all'interno del flacone.
10. Distribuire, mediante una pipetta -200 μl-, la sospensione di microsfere trattate (circa 32.000) su una piastra multipozzetto con inserto di membrana (diametro dei pori 0,4 micron) in cui si auto-assemblano formare uno strato uniforme.
11. Riempire ciascun pozzetto della membrana con 0,5 ml di terreno e metterlo in incubatrice (T = 37,0 ^{° C,} CO ₂ = 5%) fino a quando i neuroni sono pronte per essere placcato (3.2).

2. Dissezione degli embrioni e la dissociazione di tessuto

1. Casa ratti femmina adulti (200-250 g) ad una temperatura costante (22 ± 1 ° C) e umidità relativa (50%) sotto una pianificazione luce-buio normale (light-on 7 AM-7 PM) nelstabulario. Assicurarsi che il cibo e l'acqua sono liberamente disponibili.
2. Anestetizzare un topo femmina incinta dopo 18 giorni di sviluppo (E18) utilizzando 3% isoflurano. Poi, sacrifica l'animale per dislocazione cervicale.
3. Rimuovere ippocampi da ogni embrione di ratto e metterli in una soluzione salina bilanciata ghiacciata di Hank senza ^Ca 2 + e Mg ^2+. Al giorno 18 di ippocampo di sviluppo e dei tessuti della corteccia sono molto morbidi e non hanno bisogno di essere tagliato in piccoli pezzi. Ulteriori dettagli possono essere trovati ^18,19.
4. Dissociare il tessuto 0,125% di soluzione di tripsina / Hank contenente lo 0,05% di DNAsi per 18-20 minuti a 37 ° C.
5. Rimuovere la soluzione surnatante con una pipetta Pasteur e fermare la digestione enzimatica aggiungendo mezzo con siero fetale bovino 10% (FBS) per 5 min.
6. Rimuovere il mezzo con FBS e lavare una volta con il mezzo con il suo complemento, 1% L-glutamina, gentamicina 10 ug / ml. Rimuovere di nuovo il supporto con un pip Pasteurette e riempire nuovamente con una piccola quantità (500 ml) di mezzo di crescita con il suo complemento, 1% L-glutamina, gentamicina 10 ug / ml.
7. Dissociare il precipitato di tessuto meccanicamente con una pipetta Pasteur stretta fino una sospensione lattiginosa di cellule è evidente. Non è necessario centrifugare la sospensione cellulare.
8. Diluire il piccolo volume di sospensione cellulare con il terreno di coltura per ottenere un volume finale di 2,0 ml. Contare il concentrazione cellulare ottenuto con una camera emocitometro. Diluire la concentrazione a 1: 5 per ottenere la concentrazione desiderata di cellule 600-700 cellule / microlitro.

3. cellule placcatura

1. Cellule piastra ad una densità di circa 2.000 cellule / mm ² sulla zona attiva del MEA, definiti dal vincolo PDMS per creare una rete neuronale 2D.
   NOTA: Ogni ippocampo contiene circa 5 x 10 ⁵ cellule, (1 x 10 ⁶ per un singolo embrione). Sezionare 6 embrioni per ottenere un importo totale di 6 x 10⁶ cellule in 2 ml, e una concentrazione stimata di 3.000 cellule / microlitro. Diluire la concentrazione a 1: 5 per ottenere la concentrazione desiderata e piastra di cellule circa 600-700 cellule / ml. Se l'area MEA delimitata dal vincolo PDMS è di circa 7.065 mm ^2, e il numero totale di cellule piastrate 600 cellule / ml x 24 ml = 14.400 cellule, la densità finale di 2.038 cellule / mm ^2.
2. Posizionare i dispositivi MEA nel incubatore umidificato con _CO2 nell'atmosfera (5%) a 37 ° C.
3. Distribuire 160 microlitri della sospensione con una concentrazione cellulare di 600-700 cellule / microlitro (circa 100.000 cellule) sulla superficie del monostrato microsfere posizionato all'interno delle piastre multipozzetto per completare la fase preliminare per la costruzione della cultura tridimensionale. Mettere le piastre a pozzetti multipli nell'incubatore con umidificata CO ₂ nell'atmosfera (5%) a 37 ° C.

Edilizia 4. 3D Rete neuronale

1. 6-8 ore dopo la placcatura, trasferire la sospensione (microsfere con neuroni) dalle piastre multipozzetto attentamente all'interno dell'area delimitata dal vincolo PDMS utilizzando una pipetta impostato per un volume di circa 30-40 ml. Dopo ogni trasferimento, attendere circa mezzo minuto, per consentire le microsfere di auto-assemblarsi in una struttura compatta esagonale.
2. Una volta che tutti gli strati sono depositati e spontaneamente assemblati, riempire con una grande goccia di circa 300 ml di mezzo della parte superiore dell'area delimitata dal vincolo PDMS.
3. Mettere la struttura 3D accoppiato al MEA in incubatore (T = 37,0 ^{° C,} CO ₂ = 5%) per 48 ore prima di aggiungere un volume finale (circa 1 ml) di crescita terreno di coltura con il suo supplemento.
   NOTA: Si consideri il numero totale di perline su piastre multipozzetto con inserto membrana (30.000) e il numero di perle su un singolo strato sul dispositivo MEA (6000). La struttura 3D risultante è composta da 5 strati di microbeads e cellule. Tenendo conto che la rete neuronale 3D non è geometricamente perfetta, la struttura 3D risultante potrebbe essere composta di 5-8 strati.
4. Il giorno dopo la placcatura, aggiungere con attenzione il volume finale del mezzo (circa 900 ml) all'interno dell'anello MEA. Mantenere le culture 3D in un umidificata CO ₂ nell'atmosfera (5%) a 37 ° C per 4-5 settimane. Sostituire la metà del mezzo una volta alla settimana.

5. Microscopia confocale Acquisizione

1. Fissare i campioni biologici alla fase del microscopio in un supporto. Posizionare il laser (Argon, 496-555 nm), la velocità di scansione (400 Hz) di acquisire l'immagine, il guadagno e offset (-0,3%) di PMT per ogni immagine di catturare il filtro per le emissioni di banda corretta e in ordine per evitare la saturazione e per aumentare il rapporto segnale-rumore. La Sezione I risultati sono riportati i valori utilizzati per acquisire le immagini di figura 4.
2. Per l'acquisizione del z impili sequenza, abetest selezionare, il valore della posizione z della parte superiore e lo strato inferiore del campione, e quindi selezionare il passo di rendere l'acquisizione.

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Risultati

. In questa procedura sperimentale, un ruolo importante è giocato dalle microsfere che definiscono l'impalcatura meccanica per la crescita della rete neuronale 3D Figure 1A e B mostra la disposizione delle microsfere (diametro nominale di 40 ± 2 micron; diametro medio certificata di 42.3 ± 1.1 micron) nel piano. La particolarità di tali strutture è che microsfere spontaneamente auto-assemblano definendo una geometria esagonale compatto (Figura 1B e C). L'impalcatura così g...

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Discussione

In questo lavoro, un romanzo sperimentale in vitro piattaforma costituita da 3D progettato colture neuronali accoppiati a MEA per elettrofisiologia rete è stata presentata. L'uso di microsfere come impalcatura per consentire la conseguenza neuritica lungo la z -axis è stata adattata per essere integrato con il MEA planare. In questo modo, i risultati ottenuti micro-sistema in vitro modello 3D valida ed affidabile per studiare le dinamiche emergenti elettrofisiologici ^16.

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Laminin	Sigma-Aldrich	L2020	0.05 µg/ml
Poly-D-lysine	Sigma-Aldrich	P6407	0.05 µg/ml
Trypsin	Gibco	25050-014	0.125% diluted 1:2 in HBSS w\o CA++, MG++
DNAase	Sigma-Aldrich	D5025	0.05% diluted  in Hanks solution
Neurobasal	Gibco Invitrogen	21103049	culture medium
B27	Gibco Invitrogen	17504044	2% medium supplent
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F-2442	10%
Glutamax-I	Gibco	35050038	0.5 mM
gentamicin	Sigma-Aldrich	G.1272	5 mg/L
Poly-Dimethyl-Siloxane (PDMS)	Corning Sigma	481939	curing agent and the polymer
Micro-Electrode Arrays	Multi Channel Systems (MCS)	60MEA200/30-Ti-pr	MEA with: Electrode grid 8x8; Electrode spacing and diameter 200 and 30 µm, respectively; plastic ring without thread
Microbead	Distrilab-Duke Scientific	9040	1 gr Glass Part. Size Stds 40 µm
Transwell	Costar Sigma	CLS 3413	multiwell plates with membrane insert (6.5 mm diameter porous 0.4 µm)
HBSS w\o Ca++ ,Mg++	Gibco Invitrogen	14175-052
Hanks Buffer Solution	Sigma	H8264
Teflon	Sigma	430935-5G	polytetrafluoroethylene
Rat	Sprague Dawley	Wistar Rat
Confocal Microscopy Upright	Leica	TCS SP5 AOBS
20.0x0.50 WATER objective	Leica	Leica HCX APO L U-V-I
40.0x0.80 WATER objective	Leica	Leica HCX APO L U-V-I
25.0x0.95 WATER objective	Leica	HCX IRAPO L