Metodi Per inibire batterica Pyomelanin produzione e determinare il corrispondente aumento di sensibilità allo stress ossidativo

Riepilogo

Bacterial pyomelanin production results in increased resistance to oxidative stress and virulence. We report on techniques that can be used to determine inhibition of pyomelanin production and assay the resulting increase in sensitivity to oxidative stress in bacteria, as well as determine antibiotic minimum inhibitory concentration (MIC).

Abstract

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism pathway and contributes to increased oxidative stress resistance. Pyomelanin production in Pseudomonas aeruginosa is reduced in a dose dependent manner through treatment with 2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC). We describe a titration method using multiple concentrations of NTBC to determine the concentration of drug that will reduce or abolish pyomelanin production in bacteria. The titration method has an easily quantifiable outcome, a visible reduction in pigment production with increasing drug concentrations. We also describe a microtiter plate method to assay antibiotic minimum inhibitory concentration (MIC) in bacteria. This method uses a minimum of resources and can easily be scaled up to test multiple antibiotics in one microtiter plate for one strain of bacteria. The MIC assay can be adapted to test the affects of non-antibiotic compounds on bacterial growth at specific concentrations. Finally, we describe a method for testing bacterial sensitivity to oxidative stress by incorporating H₂O₂ into agar plates and spotting multiple dilutions of bacteria onto the plates. Sensitivity to oxidative stress is indicated by reductions in colony number and size for the different dilutions on plates containing H₂O₂ compared to a no H₂O₂ control. The oxidative stress spot plate assay uses a minimum of resources and low concentrations of H₂O₂. Importantly, it also has good reproducibility. This spot plate assay could be adapted to test bacterial sensitivity to various compounds by incorporating the compounds in agar plates and characterizing the resulting bacterial growth.

Introduzione

Pseudomonas aeruginosa is a Gram negative bacterium that produces a variety of pigments including pyomelanin, a red-brown pigment that helps provide protection from oxidative stress^1-4 and binds a variety of compounds, including aminoglycoside antibiotics^5-7. Pyomelanin production is caused by a defect in the tyrosine catabolism pathway^4,8, either through deletions or mutations of the gene encoding homogentisate 1,2-dioxygenase (HmgA)^1,9 or through imbalances in the various enzymes in the pathway¹⁰. Homogentisate accumulates due to inactivation of HmgA, and is secreted and oxidized to form pyomelanin¹¹. Production of pyomelanin can be abolished or reduced in a dose dependent manner through treatment with the herbicide 2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC)¹², which inhibits 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase (Hpd) in the tyrosine catabolism pathway¹³. Hpd is required for the formation of homogentisate, and therefore pyomelanin¹¹.

We describe in detail three techniques that were important in our studies of NTBC treatment of pyomelanin producing strains of P. aeruginosa. These techniques include titration of NTBC to determine the concentrations that will abolish or reduce pyomelanin production in laboratory and clinical pyomelanin producing strains, determination of the minimum inhibitory concentration (MIC) of antibiotics when bacteria are treated with NTBC, and the resulting sensitivity to oxidative stress with NTBC treatment.

The titration assay we developed serves two purposes. First, the assay will allow the user to determine if NTBC can abolish or reduce pyomelanin production in the bacterium being studied and at which concentrations. This will allow the user to determine sensitivity to NTBC, since different strains of bacteria may have different sensitivities to this compound, as observed in P. aeruginosa¹². Second, the NTBC titration assay will allow the user to determine the appropriate concentration of NTBC to use in subsequent assays, such as antibiotic MIC and oxidative stress response assays, if the goal is to abolish or reduce pyomelanin production and determine the effects of pigment reduction.

The titration assay works because a visible difference in pyomelanin production can be seen in strains treated with NTBC and the differences in pyomelanin production are dose dependent¹². Additionally, this technique can be applied to the study of other compounds that may eliminate or enhance pigment production in bacteria.

Antibiotic MICs are used to determine the sensitivity of bacteria to antibiotics. There are several methods to determine MICs, including agar dilution plates and broth dilutions¹⁴. Broth dilutions can be performed in small test tubes or in a 96-well microtiter plate. The microtiter plate method of MIC determination described herein will allow the user to test a wide range of antibiotics using a minimum of resources. The assay provides reproducibility as well as flexibility in the number of antibiotics and strains tested by this method. Additionally, with the incorporation of NTBC in the assay, the user can determine if elimination or reduction of pyomelanin production alters antibiotic sensitivity in bacteria that produce pyomelanin.

Bacterial response to oxidative stress can be tested in several ways. The most common methods described are either viable counts of bacteria subjected to oxidative stress for a period of time¹, or oxidative stress disc diffusion assays¹⁵. These methods tend to use high concentrations of oxidative stressors to examine the effects of oxidative stress in bacteria and results can be quite variable between biological replicates. The viable count assay also tends to use more agar plates than the other methods. The spot plate assay we describe uses low concentrations of H₂O₂ and allows the user to test the oxidative stress response of multiple strains using a minimum of plates. The assay is also consistently reproducible between technical and biological replicates. As pyomelanin is involved in resistance to oxidative stress, the incorporation of NTBC in the assay allows the user to determine the effects of elimination of pyomelanin production on oxidative stress resistance.

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Protocollo

1. Preparazione della Cultura Media, antibiotici, e 2- [2-nitro-4- (trifluorometil) benzoile] -1,3-cicloesandione (NTBC)

1. Rendere brodo LB (1% triptone, estratto di lievito 0,5%, 0,25% di NaCl in H _{2 O)} e aliquota in volumi appropriati. Sterilizzare in autoclave. Conservare a temperatura ambiente.
2. Rendere 100 ml LB agar (1% triptone, estratto di lievito 0,5%, 0,25% NaCl, 1,5% agar in H _{2 O)} in 250 ml beute. Sterilizzare in autoclave e conservare a temperatura ambiente. Assicurarsi che l'agar viene fuso prima di versare in piastre.
   NOTA: Boccette contenenti 100 ml di LB agar produrrà 4 piatti. La quantità di LB agar può essere modificato per corrispondere al numero di lastre necessarie per il dosaggio.
3. Fai la PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na ₂ HPO _4, 2 mM KH ₂ PO ₄₎ ^16. Sterilizzare in autoclave o filtrazione e conservare a temperatura ambiente.
4. Preparare le soluzioni madre di antibiotici per gentamicina, kanamicina, und tobramicina.
   1. Preparare opportune concentrazioni azionari antibiotici per P. aeruginosa ceppi contenenti 100 mg / ml gentamicina, 30 mg / ml di kanamicina, e 10 mg / ml tobramicina. Sciogliere gli antibiotici in acqua, sterilizzare il filtro (0,2 micron), e conservare a 4 ° C. Modificare gli antibiotici e le concentrazioni seconda batterio studiata.
5. Preparare le soluzioni madre NTBC. Disciogliere 10 mg di NTBC in 400 ml di DMSO. Questo produce una concentrazione di 75,9 NTBC mM. Store Solutions NTBC azionari a -20 ° C. Soluzioni scongelare a temperatura ambiente, se necessario.
   NOTA: diverse fonti di NTBC hanno differenze di solubilità. Determinare il veicolo appropriato per sciogliere il NTBC in base alle raccomandazioni del costruttore e regolare Passo 1.5 di conseguenza.

2. NTBC titolazioni di Ceppi batterici

1. Impostare le culture durante la notte dei ceppi da testare. Aggiungere 2 ml di brodo LB a 16 x 150 mm provettas (uno per ceppo) e inoculare con 1 isolato colonia da ogni ceppo. Incubare per una notte a 37 ° C con aerazione su un rotatore coltura tissutale in un incubatore dell'aria.
2. Il giorno seguente, preparare titolazioni di NTBC in LB brodo. Utilizzare una prima serie 0-900 micron NTBC da ceppi diversi hanno differenze nella sensibilità al NTBC.
   1. Aggiungere 1 ml di brodo LB per 4 a 5 provette (16 x 150 mm) per ceppo.
   2. Aggiungere la soluzione di riserva NTBC (75,9 mm) per le provette (16 x 150 mm) in un intervallo di concentrazioni. Vedi Tabella 1 per le concentrazioni di NTBC e corrispondenti volumi delle scorte di aggiungere ad 1 ml di brodo LB.
3. Misurare il _diametro esterno 600 delle culture durante la notte. Lavare le culture prima di OD ₆₀₀ letture per eliminare pyomelanin presente nei media.
   1. Lavare le culture centrifugazione 1 ml di coltura in una microcentrifuga a 16.000 xg per 2 min. Rimuovere il surnatante e tutte le cellule senza bloccare in pellet conun micropipettatore e risospendere il pellet cellulare solido in 1 ml LB.
4. Inoculare tubi di titolazione a _OD 600 0.05. Calcolare la quantità di coltura lavato necessari per inoculare le provette.
   NOTA: Utilizzare le culture lavati per vaccinazioni da pyomelanin non dovrebbe essere presente.
5. Incubare le provette titolazione per circa 24 ore a 37 ° C con aerazione usando un tessuto coltura rotatore in un incubatore dell'aria.
6. Fotografa i tubi di titolazione e confrontare produzione di pigmenti all'interno e tra i ceppi per determinare la quantità di NTBC da utilizzare per MIC e lo stress ossidativo saggi. Utilizzare OD ₆₀₀ letture per determinare la quantità di pyomelanin in cella libera supernatante di coltura e per determinare la densità cellulare.
   NOTA: Il rapporto di _OD 600 pyomelanin nella cultura surnatante in cellule può essere calcolato per quantificare le differenze nella produzione pyomelanin dopo il trattamento con NTBC.

3. antibiotico minima inibizioneConcentrazione tory (MIC) Assay in piastre con 96 pozzetti

1. Impostare le culture durante la notte dei ceppi da testare in LB con e senza NTBC.
   NOTA: Questo protocollo è descritta utilizzando il livello rappresentativo di 300 micron NTBC. Il livello adeguato di NTBC da utilizzare è determinato nel passo 2.6.
   1. Aggiungere 300 micron NTBC a 2 ml LB. Aggiungere un volume equivalente di veicolo (DMSO) a 2 ml LB per la condizione non NTBC.
   2. Utilizzando stuzzicadenti sterili, inoculare provette con uno isolato colonia di batteri. Ci sarà una cultura con NTBC e una cultura senza NTBC per ogni ceppo. Incubare per una notte a 37 ° C con aerazione usando un tessuto coltura rotatore in un incubatore dell'aria.
2. Il giorno seguente, fare LB + NTBC e soluzioni maestri LB + DMSO per l'impostazione del test MIC. Aggiungere NTBC ad una concentrazione di 600 mM come questa saranno diluiti due volte quando si aggiunge inoculo, ottenendo una concentrazione finale di 300 mM.
   1. Per provare uno antibiotic per un ceppo, aggiungere 600 micron NTBC a 2 ml di LB e mescolare per rendere la soluzione principale NTBC. Aggiungere un volume equivalente di veicolo (DMSO) a 2 ml LB e mescolare per rendere la soluzione maestro non NTBC. Utilizzare queste soluzioni per la creazione di soluzioni madre di antibiotici, nonché per la creazione di una serie di diluizioni in piastre da 96 pozzetti.
      NOTA: Le formulazioni in soluzione maestri produrrà soluzione in più per tenere conto di errori di pipettamento. Le soluzioni master può essere aumentato o giù come richiesto a seconda del numero di antibiotici e ceppi testati.
3. Preparare le soluzioni antibiotiche nelle soluzioni maestri LB + NTBC o LB + DMSO.
   NOTA: La concentrazione di antibiotico in queste soluzioni dovrebbero essere il doppio della concentrazione finale desiderata. Soluzione abbastanza dovrebbe essere fatto per trasferire 100 ul di quattro pozzi in una piastra da 96 pozzetti.
   1. Preparare gentamicina +/- soluzione madre NTBC a 64 mg / ml. Per rendere questa soluzione, aggiungere 0,288 ml di gentamicina magazzino (100 mg / ml) per 450ul LB + NTBC o soluzione maestro LB + DMSO.
      NOTA: la concentrazione massima di gentamicina per P. aeruginosa PAO1 è 32 mg / ml.
   2. Rendere la kanamicina +/- soluzione di riserva NTBC a 256 mg / ml. Per rendere questa soluzione, aggiungere 3,84 ml di kanamicina magazzino (30 mg / ml) per 450 microlitri soluzioni maestri LB + NTBC o LB + DMSO.
      NOTA: la concentrazione massima di kanamicina per P. aeruginosa PAO1 è di 128 mg / ml.
   3. Preparare tobramicina +/- soluzione madre NTBC a 8 mg / ml. Per rendere questa soluzione, aggiungere 0,36 ml di tobramicina magazzino (10 mg / ml) per 450 microlitri soluzioni maestri LB + NTBC o LB + DMSO.
      NOTA: Per P. aeruginosa PAO1, la massima concentrazione di tobramicina è 4 mg / ml.
      NOTA: Gli antibiotici e le concentrazioni possono essere regolati per i batteri da testare.
4. Aggiungere 100 ml di ogni soluzione antibiotica 2x a quattro pozzi in una piastra da 96 pozzetti. Mettere queste soluzioni in fila A. Per example, gentamicina deve essere posto in A1 a A4, kanamicina deve essere posto in A5 attraverso A8 e tobramicina deve essere posto in A9 attraverso A12. Vedere Figura 1A per un diagramma di una piastra a 96 pozzetti impostato.
   NOTA: più antibiotici possono essere testati in un piatto, ma solo ceppo devono essere testati per piastra di eliminare il rischio di contaminazione incrociata da altri ceppi.
5. Aggiungere 50 ml di soluzione di maestro LB + NTBC o LB + DMSO alle righe B attraverso H della piastra a 96 pozzetti. Assicurarsi che un piatto è LB + NTBC e un piatto è LB + DMSO. Vedere la Figura 1A.
   1. Utilizzare LB + NTBC per gli antibiotici in LB + NTBC. Utilizzare LB + DMSO per gli antibiotici in LB + DMSO.
6. Utilizzando un micropipettatore eseguire due diluizioni seriali piega degli antibiotici trasferendo 50 ml di soluzione dalla fila A alla fila B. Mix la soluzione, modificare i puntali, e trasferire 50 ml di soluzione da riga B a remare C. Ripetere l'operazione per il remainirighe ng. Dopo diluizione fila G, rimuovere 50 ml di soluzione da quella riga e scarti. Utilizzare fila H come nessun controllo antibiotico per la crescita batterica. Vedere la Figura 1B.
   NOTA: ogni bene nelle righe da A a G ora contiene 50 ml di antibiotici in LB + NTBC o LB + DMSO a 2X la concentrazione finale desiderata. Fila H contiene LB + NTBC o LB + DMSO con antibiotici.
7. Misurare il _diametro esterno 600 delle culture durante la notte. Lavare tutte le culture prima di OD ₆₀₀ letture per eliminare pyomelanin presente nei media.
   1. Lavare le culture centrifugazione 1 ml di coltura in una microcentrifuga a 16.000 xg per 2 min. Rimuovere il surnatante con un micropipettatore e risospendere il pellet cellulare in 1 ml LB.
8. Diluire le culture durante la notte per 2.75x10 ⁵ CFU / ml in LB.
   NOTA: Si supponga che una OD ₆₀₀ unità è l'equivalente di 1x10 ⁹ CFU / ml per P. aeruginosa. OD di CFU / ml conversioni può essere different in altri batteri.
9. Aggiungere 50 ml di coltura batterica diluito nel pozzetto.
   NOTA: Le culture coltivati ​​in NTBC dovrebbero essere aggiunti ai pozzetti contenenti NTBC e culture cresciute in DMSO dovrebbero essere aggiunti ai pozzetti contenenti DMSO. Vedere la Figura 1B.
   1. Aggiungi ai batteri di tre pozzi per ogni ceppo e la concentrazione di antibiotico. Aggiungere 50 ml di LB alla quarta e di agire come un controllo per la contaminazione batterica. Vedere la Figura 1B.
   2. Utilizzare un micropipettatore multicanale per inoculare i pozzi. Assicurarsi che pipetta suggerimenti sono vicino al fondo dei pozzetti quando si aggiunge inoculo per prevenire la contaminazione dei pozzi vicini.
      NOTA: L'aggiunta di coltura batterica ai pozzetti diluire le concentrazioni di antibiotici e NTBC due volte.
10. Coprire le piastre a 96 pozzetti con parafilm e incubare circa 24 ore a 37 ° C. Incubare le piastre a 96 pozzetti staticamente, in un incubatore dell'aria.
11. Esaminarele piastre per la crescita batterica nei pozzetti. La MIC è la più bassa concentrazione di antibiotico in cui nessuna crescita batterica è visibile per tutte tre repliche di ciascun ceppo.
    1. Esaminare visivamente la piastra per la crescita o leggere utilizzando un lettore di set piatto di _OD 600.

4. Spot Assay Piastra per Stress ossidativo risposta

1. Impostare le culture durante la notte dei ceppi da testare in LB con e senza NTBC come descritto al punto 3.1.
2. Il giorno successivo, preparare piastre di agar LB contenenti _H 2 O _{2 come} fattore di stress ossidativo. Una gamma di _H 2 O ₂ concentrazioni da 0 a 1 mm è un buon punto di partenza.
   1. Sciogliere i palloni LB agar. Supporti Raffreddare a circa 50 ° C a temperatura ambiente.
   2. Aggiungere H ₂ O ₂ direttamente ai media raffreddati alle concentrazioni desiderate. Fiaschi Swirl per mescolare. Vedere la Tabella 2 per le concentrazioni di _H 2 O 2e volumi di H _{2 O 2} concentrato da aggiungere. Questi valori sono basati su 100 ml di LB agar.
   3. Versare in piastre subito dopo l'aggiunta H ₂ O ₂ e fiamme la superficie per rimuovere bolle. La resa è di 4 piastre per 100 ml di LB agar. Segnare i piatti con la concentrazione _di H 2 O _2.
   4. Posizionare le piastre scoperto in una cappa a flusso biologico con il ventilatore acceso per 30 minuti per rimuovere l'umidità in eccesso dalle piastre.
      NOTA: Utilizzare le lastre lo stesso giorno in cui vengono preparati. In caso contrario si potrebbe causare dati incoerenti.
      NOTA: fattori di stress ossidativo, come il paraquat può essere sostituito per _H 2 O 2 in questo saggio. Le concentrazioni utilizzate per altri fattori di stress ossidativi possono variare rispetto a quelli utilizzati per _H 2 O 2.
3. Lavare e misurare il _diametro esterno 600 delle culture durante la notte come descritto al punto 3.7.
4. Normalizzare la _OD 600 di tutta la cu durante la notteltures al valore più basso per il set di ceppi testati. P. aeruginosa ha generalmente un _diametro esterno 600 di circa 2,5 quando cresciuto durante la notte in LB + NTBC o LB + DMSO.
   1. Determinare il volume della cultura necessaria per diluire la coltura al OD più basso ₆₀₀ in un volume totale di 1 ml. Ad esempio, se una coltura ha un _diametro esterno 600 del 3 e l'OD più basso ₆₀₀ per il set di ceppi è 2.5, eseguire il seguente calcolo: (2,5) (1 ml) = (3) (x). x = 0,833 ml. 0,833 ml di coltura saranno collocati in una provetta per microcentrifuga.
   2. Calcolare la quantità di LB + NTBC (300 micron) o LB + DMSO necessaria a portare il volume cultura di 1 ml. Per l'esempio nel passaggio 4.4.1, la quantità di LB + NTBC o LB + DMSO aggiunto alla cultura sarebbe 0.167 ml (1 ml di volume totale - 0.833 ml cultura). Fai soluzioni stock di LB + NTBC e LB + DMSO da utilizzare per queste diluizioni in base al volume necessario per diluire tutti i ceppi.
   3. Mescolare la cultura e LB + NTBC o LB + DMSO nel vortex.
5. Per mantenere le culture in una concentrazione costante di NTBC o DMSO, eseguire dieci diluizioni seriali di piegatura delle culture durante la notte normalizzati in PBS + NTBC o PBS + DMSO.
   1. Fai soluzioni stock di PBS + NTBC e PBS + DMSO. Per una serie di diluizioni di un ceppo, mescolare 300 pM NTBC o un volume equivalente di DMSO con PBS per ottenere un volume totale di 720 microlitri. Scala questi stock alto o in basso a seconda di quante ceppi vengono testati.
   2. Tubi Label microcentrifuga per ¹⁰ -1 attraverso diluizioni ¹⁰ -7 seriali. Aggiungere 90 ml di PBS + NTBC o PBS + DMSO ai tubi appropriati. Usa PBS + NTBC per i ceppi cresciuti in LB + NTBC e utilizzare PBS + DMSO per i ceppi cresciuti in LB + DMSO.
   3. Aggiungere 10 ml di cultura alla competente 10 ^-1 provetta di diluizione. Mescolare nel vortex e trasferire 10 ml di diluizione 10 ^-1 al tubo di diluizione 10 ^-2. Ripetere l'operazione fino a quando tutte le diluizioni sono stati perfoconfermate. Cambiare puntali tra diluizioni.
6. Spot 5 ml di 10 ^-3 attraverso 10 ^-7 diluizioni su LB + H _{2 O 2 piastre} in duplicato per ogni ceppo. Utilizzare una punta della pipetta se i punti sono placcati da più diluito al meno diluito (10 ^{-7 a} 10 ^-3). Non ribaltare la piastra fino a quando il liquido si è asciugata nella piastra.
7. Incubare le piastre per 24-48 ore a 37 ° C (incubatore aria), a seconda del ceppo.
   NOTA: P. aeruginosa PAO1 avrà buone colonie dimensioni su LB dopo 24 ore di incubazione. Incubare ceppi fino colonie hanno approssimativamente la stessa dimensione PAO1.
8. Fotografare i piatti utilizzando una fotocamera CCD sopra un transluminator. Facoltativamente, modificare le foto per il contrasto e la coltivazione alla stessa dimensione. Contare il numero di colonie in ogni posto per determinare le variazioni di sensibilità allo stress ossidativo.

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Risultati

Titolazioni NTBC

Le titolazioni NTBC sono stati utilizzati per determinare se NTBC è stata in grado di ridurre la produzione pyomelanin in P. aeruginosa, e anche identificare la concentrazione di NTBC che elimina o riduce pyomelanin produzione per uso in test aggiuntivi. Ci possono essere variazioni nei livelli di pyomelanin prodotto in diverse repliche, ma tendenze generali rimanere costante. Il saggio di titolazione NTBC potrebbe anche essere modificato per testare altri...

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Discussione

The NTBC titration method described in this protocol will allow the user to determine if NTBC can reduce or eliminate pyomelanin production in bacteria, and determine the concentration of NTBC required. The most critical step in the NTBC titration assay is determining the range of NTBC concentrations to use in the assay. Different strains of P. aeruginosa have different sensitivities to NTBC, and laboratory strains may be more sensitive to NTBC than clinical isolates¹² (Figure 2). The...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC)	Sigma-Aldrich	SML0269-50mg	Also called nitisinone.  Soluble in DMSO.
H2O2	Sigma-Aldrich	216763-100ML	30 wt. % in H2O.  Stabilized.
Gentamicin	Gold Bio	G-400-100	Soluble in H2O.  Filter sterilize.
Kanamycin	Fisher Scientific	BP906-5	Soluble in H2O.  Filter sterilize.
Tobramycin	Sigma-Aldrich	T4014-100MG	Soluble in H2O.  Filter sterilize.