Analisi miRNA nel tumore alla prostata tessuti cliniche

Riepilogo

Here we describe a simplified protocol for microRNA (miRNA) expression analyses in archived Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded (FFPE) or fresh frozen prostate cancer (PCa) clinical tissues employing quantitative real-time PCR (RT-PCR) and in situ hybridization (ISH).

Abstract

Una sfida importante nel cancro della prostata (PCa) gestione clinica è rappresentata dal inadeguatezza di biomarcatori attualmente utilizzati per lo screening delle malattie, la diagnosi, la prognosi e il trattamento. Negli ultimi anni, microRNA (miRNA) sono emersi come biomarcatori alternativi promettenti per la diagnosi del cancro alla prostata e la prognosi. Tuttavia, lo sviluppo di miRNA come biomarcatori efficaci per il cancro alla prostata si basa molto sul loro rilevamento accurato nei tessuti clinici. miRNA analisi nel cancro alla prostata campioni clinici è spesso difficile a causa della eterogeneità del tumore, gli errori di campionamento, contaminazione stromale ecc L'obiettivo di questo articolo è quello di descrivere un flusso di lavoro semplificato per miRNA analizza FFPE archiviati o cancro alla prostata congelato campioni clinici freschi utilizzando una combinazione di quantitativa real-time PCR (RT-PCR) e ibridazione in situ (ISH). All'interno di questo flusso di lavoro, ottimizziamo le metodologie esistenti per l'estrazione miRNA da FFPE e congelato tissu prostataes e espressione analisi da Taqman-sonda basato miRNA RT-PCR. Inoltre, si descrive un metodo ottimizzato per ISH analizza il rilevamento formiRNA in tessuti prostatici con acido nucleico bloccato (LNA) - sonde based. Il nostro protocollo miRNA ISH ottimizzato può essere applicato alle diapositive di cancro alla prostata di tessuto o microarray di tessuti di cancro alla prostata (TMA).

Introduzione

Il cancro della prostata è un tumore maligno maschio comunemente diagnosticato che è una delle principali cause di mortalità per cancro correlati tra gli uomini. Negli Stati Uniti, si stima che 220,800 nuovi casi e 27.540 decessi saranno presentate nel 2015 ^1.

Il cancro della prostata è una malattia eterogenea con malattia molto variabile corso- tumori possono essere indolenti o molto aggressivo. Una sfida importante nel cancro della prostata gestione clinica è rappresentata dal inadeguatezza dei metodi attualmente in uso / biomarcatori per lo screening della malattia, la diagnosi, la prognosi e il trattamento ^2. Metodi di screening attuali includono l'antigene prostatico specifico (PSA) e un esame rettale digitale (DRE) seguito da biopsie prostatiche ^3. Antigene prostatico specifico (PSA) è il biomarcatore cancro alla prostata più diffuso che ha rivoluzionato in modo significativo la gestione clinica e miglioramento dei tassi di sopravvivenza ^4. Tuttavia, a causa dei limiti intrinseci di PSA compreso lack di specificità, screening di PSA-ha causato oltre diagnosi e sopra il trattamento della malattia. In considerazione di ciò, intensi sforzi sono orientati verso la ricerca di alternative biomarcatori del cancro alla prostata, in particolare quelli che possono prevedere l'aggressività della malattia e guidare le decisioni terapeutiche migliori ^4,5. Nel corso degli ultimi anni, microRNA (miRNA) sono emersi come promettenti alternative biomarcatori del cancro alla prostata.

I microRNA (miRNA) costituiscono una classe evolutivamente conservata di piccoli RNA non codificanti che sopprimono l'espressione genica livello post-trascrizionale tramite interazioni sequenza-specifiche con le regioni 3'non tradotte (UTR) del target mRNA affini. Si stima che il> 60% di mRNA sono conservate bersagli di miRNA ^6. geni miRNA sono localizzati nelle regioni intergeniche o all'interno introni o esoni di proteine ​​/ non-codificanti proteine ​​geni ^7. Questi geni sono preferenzialmente trascritti dalla RNA polimerasi II in primamiRNA ry (pri-miRNA, lunga diversi kilobasi) che ad anello a forma di gambo strutture secondarie forma a gomito. Questi pri-miRNA vengono trasformati in miRNA precursori (pre-miRNA, lungo 60-75 nucleotidi) che vengono esportati al citoplasma e successivamente trattati in miRNA maturi (lunghi 18-25 nucleotidi) ^8-10. miRNA regolano processi cellulari chiave, tra cui la proliferazione, lo sviluppo, la differenziazione e l'apoptosi ^11. Gli studi suggeriscono una disregolazione diffuso di profili di espressione dei miRNA in diversi tumori umani tra cui il cancro alla prostata ^12-15. Sono stati riportati i profili di espressione di miRNA ad essere ampiamente disregolazione nel cancro della prostata primari e metastatici. MiRNA Altered sono stati collegati con la progressione del cancro alla prostata, l'aggressività e la ricorrenza mettendo in evidenza il potenziale prognostico di miRNA ^12,14,16-19. Un crescente corpo di evidenze indicano che i miRNA svolgono ruoli importanti meccanicistici nell'iniziazione cancro alla prostata, lo sviluppo, il progressoioni e metastasi. Nel complesso, miRNA stanno emergendo come biomarcatori alternativi promettenti per la diagnosi del cancro alla prostata e la prognosi in grado di distinguere tra tessuti e gli aiuti normali e tumorali nella stratificazione di tumori della prostata ^12. Inoltre, miRNA sono obiettivi importanti per lo sviluppo di terapie efficaci contro il cancro alla prostata ^20.

A causa delle loro piccole dimensioni e la resistenza all'attività RNasi endogena, miRNA sono biomarcatori stabili che possono essere facilmente rilevati nei tessuti fissati in formalina ²¹ e ²² biopsie prostatiche. Inoltre, i profili di espressione di miRNA sono stati confrontati in tessuti congelati e fissati in formalina e sono stati trovati per essere fortemente correlato ^21. Tuttavia, miRNA profiling in cancro alla prostata tessuti clinici è spesso difficile a causa della eterogeneità del tumore, gli errori di campionamento, contaminazione stromale ecc Lo sviluppo dei miRNA come biomarcatori efficaci per il cancro alla prostata pesantemente relies sul loro rilevamento accurato nei tessuti clinici. Qui si descrive un flusso di lavoro semplificato utilizzato nel nostro laboratorio per miRNA profilatura in FFPE archiviati o cancro alla prostata congelato campioni clinici freschi. Ci avvaliamo di una combinazione di quantitativa real-time PCR e ibridizzazione in situ per miRNA le analisi di campioni clinici, con l'ex producendo maggiori informazioni quantitative e la seconda per visualizzare l'espressione differenziale delle potenziali biomarcatori miRNA in una vasta gamma di tessuti. All'interno di questo flusso di lavoro, ottimizziamo le metodologie esistenti per l'estrazione miRNA da FFPE e tessuti della prostata congelati, espressione analizza da Taqman-sonda basato miRNA RT-PCR e miRNA in situ tecnica di ibridazione con acido nucleico bloccato (LNA) -based sonde ^23. Sonde basato LNA-offrono una maggiore sensibilità e specificità rispetto al DNA o RNA sonde based e consente il rilevamento affidabile di tutte le sequenze di miRNA, indipendentemente dal loro contenuto GC e permettono anche discriminazione delle famiglie miRNA. Il nostro protocollo miRNA ISH ottimizzato può essere applicato alle diapositive di cancro alla prostata di tessuto o microarray di tessuti di cancro alla prostata (TMA), con quest'ultimo che offre il potenziale di accelerare miRNA biomarcatore scoperta.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocollo

Campioni freschi cancro alla prostata congelato fissati in formalina, inclusi in paraffina (FFPE) o sono stati ottenuti dalla SFVAMC. Campioni di pazienti con cancro alla prostata sottoposti a prostatectomia radicale a SFVAMC. Consenso informato scritto è stato ottenuto da tutti i pazienti e lo studio è stato approvato dal Comitato UCSF per la ricerca umana. In alternativa, tessuti di cancro alla prostata microarray sono stati acquistati da fonti commerciali e utilizzati per le analisi da miRNA ISH. Informazioni clinicopatologica e follow-up per i pazienti affetti da cancro alla prostata analizzati sono stati raccolti.

1. I campioni di tessuto

1. Tagliare campioni di tessuto del cancro della prostata in 10 sezioni micron utilizzando un microtomo e macchia con H & E seguendo il protocollo del produttore.
2. Commenta vetrini colorati per l'identificazione del cancro alla prostata foci così come adiacente normale epitelio ghiandolare.
   Nota: Una scheda certificata patologo dovrebbe rivedere le diapositive H & E macchiato e mark per tumore e aree normali. Utilizzare le diapositive contrassegnate come guide in successive sezioni per miRNA analisi da tumore vs aree normali.

2. Le analisi di espressione di miRNA Quantitative Real-time PCR

Nota: Questo flusso di lavoro prevede le seguenti fasi: cattura microdissezione laser, isolamento di RNA totale (compresi i miRNA e mRNA), il saggio dei miRNA maturi utilizzando i saggi di espressione TaqMan MicroRNA come dettagliato nelle sezioni seguenti.

1. RNA Estrazione
   1. Isolamento di miRNA da cancro della prostata FFPE tessuti
      1. Microdissezione laser (LCM)
         Nota: Eseguire i passi 2.1.1.1.1- 2.1.1.1.4 in una cappa.
         1. Preparare vetrini di tessuto (10 sezioni micron) per LCM. Deparrafinize sezioni di tessuto di immersione in xilene (2x), per 10 minuti ciascuno, quindi reidratare i tessuti incubando i vetrini per 5 minuti ciascuna in etanolo graduata (100%, 95%, 90%, 80%, 70%) seguita da distillata acqua(5 minuti).
         2. A seguito di reidratazione, sezioni macchia con ematossilina per 30 secondi seguiti da acqua.
         3. Inserire tessuti in etanolo graduata (70%, 95% 90%, 80%, 70%) (5 min ciascuna) e xilene (5 min).
         4. Scivoli asciutti in una cappa aspirante e quindi inserire nello strumento LCM per microdissezione.
         5. Eseguire microdissections con il sistema LCM conformemente alle istruzioni del produttore ^24. Usa patologo marcato diapositive come guide per l'identificazione di cancro alla prostata foci così come il tessuto normale adiacente. Utilizzare il raggio laser ad una 10-20 impulsi diametro micron con una potenza di 70-90 mW.
         6. Cattura aree di interesse con impulsi laser infrarossi sui tappi LCM. Combina le celle da 2-5 tappi per l'estrazione di miRNA per campione. Per garantire l'integrità di RNA estratto, immediatamente elaborare cellule catturate per l'estrazione miRNA.
         7. In alternativa, le cellule Lisare nel buffer di estrazione miRNA (secondo il protocollo del produttore) e store lisati a -80 ° C.
      2. miRNA Estrazione e analisi da LCM microdissezione tessuti
         1. Estratto RNA totale da tessuti FFPE microdissezione utilizzando un kit commerciale seguendo le istruzioni del produttore.
            Nota: La resa di RNA da cattura laser miscrodissection è tipicamente basso. Pertanto, l'RNA viene eluito in volumi bassi (20-30 mL) e utilizzato per la profilazione espressione utilizzando Taqman microRNA saggi di espressione seguito le istruzioni del produttore (anche descritto nella sezione 2.2). Ottimizzazione di ingresso dell'RNA per PCR real time il rilevamento dei miRNA maturi suggerisce che 5 ml di RNA eluizione è ottimale per ogni reazione di trascrizione inversa specifici miRNA-. Come un controllo endogeno, è usato RNU48 / RNU24. Per le reazioni di controllo, 2 microlitri del RNA eluito viene utilizzato per la reazione di trascrizione inversa.
   2. Isolamento di miRNA da cancro della prostata congelati tessuti
      1. Omogenize congelati tessuti della prostata resezione dalla macinazione dei tessuti in azoto liquido con un mortaio e pestello. Trasferire il tessuto omogeneizzato in una provetta con una spatola raffreddato. Mantenere la malta / pestello e spatola alla stessa temperatura per immersione in azoto liquido tessuto omogeneizzato così può essere facilmente trasferiti.
      2. Aggiungere guanidina isotiocianato-fenolo commerciale reagente (1 ml / 0,1 g di tessuto) al tessuto omogeneizzato ed incubare a temperatura ambiente per 5 min.
         Nota: i tessuti omogeneizzate della guanidina commerciale isotiocianato-fenolo reagente possono essere conservati a -80 ° C per diversi mesi.
      3. Aggiungere cloroformio per l'omogeneizzato (0,2 ml di cloroformio / ml) e si agita energicamente per 30 sec. Incubare i campioni a temperatura ambiente per 3-5 min seguita da centrifugazione a 10.000 xg per 20 min a 4 ° C.
      4. Trasferire la fase acquosa superiore ad una provetta sterile da 1,5 ml fresco RNasi-free.
      5. Aggiungere un volume uguale di alcool isopropilico. Mescolare e incubare per 10 min a RT seguita da centrifugazione a 12.000 xg per 20 min a 4 ° C per sedimentare il RNA.
      6. Aspirare il surnatante e lavare il pellet di RNA con 1 ml di etanolo al 70%. Centrifugare a 12,000 xg per 10 minuti a 4 ° C.
      7. Con attenzione aspirare il surnatante. Pellet di RNA a secco a temperatura ambiente per 5-10 minuti. Sciogliere RNA in 50-100 acqua priva di nucleasi microlitri.
      8. Eseguire la quantificazione di RNA utilizzando uno spettrofotometro NanoDrop e determinare l'integrità dell'RNA con un bioanalizzatore. Regolare le concentrazioni di RNA a 10 ng / ml. Utilizzare 10-50 ng RNA per miRNA- reazione cDNA specifico seguito da PCR in tempo reale le analisi (paragrafo 2.2).
2. PCR quantitativa in tempo reale per miRNA analisi di espressione
   Nota: miRNA maturi Assay utilizzando un protocollo RT-PCR in due fasi come descritto sotto.
   1. Reverse trascrizione (RT)
      1. Reverse trascrivere cDNA da RNA utilizzando un kit di trascrizione inversa miRNA in conformità con le istruzioni del produttore.Utilizzare 10-50 ng di RNA totale con miRNA primer specifico dal kit MicroRNA Assays e RT. Utilizzare RNU48 / RNU24 / RNU6B come controlli. Diluire cDNA 1: 5 a 1:10 (seconda dall'abbondanza del miRNA analizzati) e utilizzare in tempo reale di rilevamento PCR come descritto nel passaggio seguente.
   2. Real-time PCR per il rilevamento di miRNA maturo
      1. Amplifica prodotti di PCR di campioni di cDNA utilizzando i saggi MicroRNA con una master mix universale veloce secondo le istruzioni del produttore. Normalizzare campioni a RNU48 / RNU24 / controllo RNU6B. Utilizzare il metodo comparativo Ct (ciclo soglia) per calcolare le relative variazioni nell'espressione genica su Fast Real Time PCR sistema. Analizzare ogni campione in triplicato.

Analisi 3. miRNA Espressione di ibridazione in situ (ISH)

1. Pre-trattamento dei tessuti
   1. Tagliare 5 sezioni micron da blocchi di tessuto di cancro alla prostata FFPE utilizzando un microtomo.
   2. Fix sezioni di tessuto incubando i campioni a 56 ° C per 1 ora.
      Nota: Le diapositive possono essere conservati a temperatura ambiente per diverse settimane per miRNA analisi.
   3. Deparrafinize tessuti immergendo i vetrini con xilene (2x), per 15 minuti ciascuno.
   4. Reidratare i tessuti incubando i vetrini per 5 minuti ciascuna in etanolo graduata (100% (2x), 95%, 90%, 80%, 70%) seguito da acqua distillata (5 min).
   5. Fissare i vetrini con 4% paraformaldeide in PBS a temperatura ambiente per 20 min.
   6. Lavare i vetrini con PBS (2x) a temperatura ambiente per 5 minuti ciascuna.
   7. Trattare i vetrini con 10 ug / ml proteinasi K a 37 ° C per 10 min in proteinasi pre-riscaldato tampone K (5 mM Tris-HCL pH 7,4, 1 mM EDTA, 1 mM NaCl).
   8. Dopo il trattamento proteinasi-K, sciacquare i vetrini con lo 0,2% glicina in PBS per 30 sec.
   9. Lavare i vetrini in PBS (1x) a temperatura ambiente per 5 min.
   10. Fissare i vetrini con 4% paraformaldeide in PBS per 15 min.
   11. Sciacquare i vetrini conPBS per 5 min.
2. Ibridazione
   1. Pre-ibridare i vetrini con soluzione pre-ibridazione per 3-4 ore a 55 ° C in una camera umidificata. Utilizzare tessuto salviettine imbevute di laboratorio nel 50% formammide / 50% 5x SSC per mantenere la camera umidificata.
   2. Utilizzare 5 'sonde marcate con digossigenina ad una concentrazione di 20-50 nM in tampone di ibridazione. Diluire sonda specifica per miRNA (20-50 nM) e una piccola sonda di controllo U6 RNA nucleare (20 nM), calore a 90 ° C per 4 minuti, posizionarlo su ghiaccio, e aggiungere al ghiaccio tampone di ibridazione freddo (2-4 ng / ml ).
   3. Rimuovere la soluzione pre-ibridazione, aggiungere soluzione di ibridazione (sonda + tampone di ibridazione, 100 ml per vetrino), incubare per 12-16 ore a temperatura di ibridazione specifica sonda (temperatura di ibridazione = sonda-Tm 21 ° C). Eseguire ibridazioni in una camera umidificata (50% formammide / 50% 5x SSC).
3. Lavaggio Steps
   1. Lavare i vetrini con 2x SSC per 10 minuti a 45 ° C.
   2. Lavare tscivola con 1,5x SSC per 10 minuti a 45 ° C.
   3. Lavare i vetrini con 0.2x SSC (2x) a 37 ° C per 20 minuti ciascuno.
   4. Incubare i vetrini con la soluzione 1x di blocco per 1-2 ore a temperatura ambiente
4. Rilevamento
   1. Incubare i vetrini con 1: 100 PBS diluito anticorpo anti-digossigenina AP-coniugato per 1-4 ore o una notte a 4 ° C.
   2. Lavare i vetrini con PBS (3x) a temperatura ambiente per 10 minuti ciascuno.
   3. Lavare le diapositive (2x) con fosfatasi alcalina tampone (100 mM Tris pH 9,5, 50 mM MgCl _2, 100 mM NaCl, 0.1% Tween-20) a temperatura ambiente per 5 minuti ciascuna.
   4. Incubare i vetrini in substrato BM Viola AP al buio a temperatura ambiente per 1-20 ore.
   5. Risciacquare i vetrini con PBS contenente 0,1% di Tween-20 e lavaggio (2x) in acqua.
   6. Montare le diapositive utilizzando un mezzo di montaggio acquoso ed esaminare al microscopio.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Risultati

Profilo di espressione di miR-203 nel cancro della prostata primario LCM campioni clinici mediante RT-PCR analisi (Figura 1)

RT-PCR analisi di espressione relativa miR-203 in LCM prostata primaria tessuti tumorali e le regioni adiacenti normali appaiati è stata effettuata come descritto in Saini et al. ¹⁵ RNU48 è stato utilizzato come controllo. La tabella seguente riassume l'espressione relativa miR-203 nei tessuti tumorali del cancro alla prostata...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussione

In questo articolo, si descrive un flusso di lavoro semplificato per miRNA profilatura in FFPE archiviati o cancro alla prostata congelato tessuti clinici freschi. Nel cancro della prostata, diversi studi suggeriscono un ruolo importante dei microRNA nel cancro alla prostata iniziazione, la progressione e la metastasi. Tuttavia, risultati contrastanti sono spesso ottenuti su uno specifico miRNA ²² in quanto l'estrazione miRNA e analisi metodi differiscono ampiamente. In considerazione degli elementi di pr...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microtome	Leica Biosystems	RM2255
Arcturus Autopix for LCM	Arcturus/ Life Technologies	LCM1621/LCM1110	Alternatively, Arcutus Xt system from Life Technolgies can be used.
CapSure Macro LCM Caps	Life Technologies	LCM0211
miRNeasy FFPE Kit	Qiagen	217504
7500 Fast Real-time PCR System	Applied Biosystems/ Life Technologies	4351106
Taqman MicroRNA Reverse Transcription kit	Applied Biosystems/ Life Technologies	4366596
Taqman Fast Universal PCR master mix	Applied Biosystems/ Life Technologies	4352042
DIG labeled LNA probe for U6	Exiqon	99002-01
BM Purple AP substrate	Roche	11442074001
Pre-hybridization solution	Biochain	K2191050-1
Hybridization solution	Biochain	K2191050-2
Blocking solution	Biochain	K2191050-8
AP-conjugated anti-digoxigenin antibody	Biochain	K2191050-7
Aqueous mounting media	Vector Laboratories	H-5501
Trizol (guanidine isothiocyanate-phenol reagent)	Life Technologies	15596-018
Harris hematoxylin	Statlab	SL200
Eosin	Statlab	SL201