Impiegando digitale Droplet PCR per identificare mutazioni BRAF V600E in inclusi in paraffina fissati in formalina Linee cella di riferimento standard

Riepilogo

L'obiettivo di questo video è quello di dimostrare come eseguire l'estrazione del DNA automatizzato da inclusi in paraffina linee cellulari fissate in formalina (FFPE) di riferimento standard e delle gocce digitali PCR (ddPCR) analisi per individuare mutazioni rare in un ambiente clinico. Rilevamento mutazioni nei campioni FFPE dimostra l'utilità clinica di ddPCR in campioni FFPE.

Abstract

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is partitioned into ~20,000 nano-sized, water-in-oil droplets, and PCR amplification occurs in individual droplets. The ddPCR approach is in identifying sequence mutations, copy number alterations, and select structural rearrangements involving targeted genes. Here, we demonstrate the use of ddPCR as a powerful technique for precisely quantitating rare BRAF V600E mutations in FFPE reference standard cell lines, which is helpful in identifying individuals with cancer. In conclusion, ddPCR technique offers the potential to precisely profile the specific rare mutations in different genes in various types of FFPE samples.

Introduzione

L'accumulo di mutazioni genetiche nei principali geni regolatori altera programmazione cellula normale come la proliferazione cellulare, il differenziamento e la sopravvivenza, che porta al cancro ^1. La chinasi RAS-RAF-MAP media le risposte cellulari ai segnali di crescita. Mutazioni BRAF oncogeno possono derivare da mutazioni del driver nel gene BRAF, che possono causare il BRAF oncoprotein a diventare iperattiva ^2. Le mutazioni nel gene BRAF anche tradursi nella segnalazione a valle iperattiva tramite MEK e ERK ^{3, che,} a sua volta, porta alla crescita eccessiva delle cellule e la proliferazione indipendentemente da fattore di crescita-mediata regolazione ^4-6.

Sono disponibili diversi strumenti per la mutazione del DNA profiling, come ad esempio in tempo reale mutazioni BRAF V600E quantitativi fissati in formalina, inclusi in paraffina (FFPE) di riferimento standard di linee cellulari di ddPCR. ddPCR è un metodo basato sulla PCR per la quantificazione assolutaoffrendo una maggiore precisione rispetto ai tradizionali quantitativa real-time PCR ^(qPCR) 7,8. ddPCR fornisce anche una maggiore potenza e precisione la risoluzione per la rilevazione di mutazioni rare nei modelli di DNA, consentendo la ricerca sul cancro più informativo e la diagnosi ^9. Ulteriori vantaggi di ddPCR oltre qPCR convenzionale sono la sua maggiore sensibilità e precisione quando si studia il numero di copie a basso modello ^10-12. Qui, un protocollo per estrarre automaticamente DNA da linee cellulari normali riferimento FFPE, seguiti da determinare la presenza o l'assenza di mutazioni BRAFV600E da ddPCR è dimostrata. L'utilizzo di software per l'analisi dei dati e una rappresentazione grafica dei risultati sono anche descritti. L'intera procedura è relativamente semplice e totalmente dipende dal numero di campioni da profilati e il numero delle macchine convenzionali PCR e ddPCR disponibili.

Il protocollo che segue descrive le procedure standard per la BR AF-V600E positivi di riferimento FFPE linee di cellule normali (HD598, HD593, HD617, HD273 e di tipo selvatico (WT)) viene eseguita in uno strumento completamente automatico che utilizza il protocollo Tissue preparazione sistema (TPS). Successivamente, i campioni di DNA isolati vengono analizzati per la presenza di mutazioni BRAF V600E utilizzando il sistema ddPCR. Analisi mirata mutazione viene eseguita dopo tutti i campioni sono stati profilato e i dati sono stati caricati nel software di analisi dati. A seconda del numero di campioni / gruppi studiati, analisi dei dati può richiedere da una a diverse ore. Il componente sperimentale della metodologia richiede accuratezza nella gestione DNA erological Pipette e pipette, un video JOVE Scienze della Formazione spiegare di più sul contesto di pipettaggio "> pipettaggio in 96 pozzetti, mentre l'analisi dei dati viene eseguita utilizzando il software.

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Protocollo

1. Estrazione del DNA da linee cellulari FFPE di riferimento standard

Nota: Per questa procedura, estrazione del DNA è stata effettuata da linee cellulari standard di riferimento FFPE (HD598, HD593, HD617, HD273 e di tipo selvatico (WT)) utilizzando il tessuto DNA Kit di isolamento FFPE come descritto nel protocollo di seguito. Estrazione del DNA automatizzato è stato ottenuto seguendo le istruzioni del produttore per l'estrazione del DNA totale.

1. Utilizzando un microtomo e il blocco FFPE originale, preparare manualmente sezioni fresche prima di estrazione del DNA e analisi, secondo le procedure stabilite. Assicurarsi che l'ingresso campione per la sezione di tessuto (s) analizzato non superi uno spessore totale di 10 micron e che la superficie non supera 600 mm ² per una singola sezione.

1.2 Protocollo di TPS

Nota: I volumi indicati nella tabella 1 corrispondono al minimo richiesto per elaborare 48 campioni, e la proceduraindicato è in conformità con le linee guida TPS. Prima di iniziare l'esperimento sistemarsi i campioni FFPE nell'e-tubo per centrifugazione a 600 xg, per evitare la perdita dei campioni nel corso del programma automatico.

1. Accendere lo strumento isolamento del DNA automatizzato e il computer. Aprire il software di controllo Esegui e inserire un vassoio di caricamento automatico nella zona di piano di carico TPS.
2. Versare il reagente nelle loro depressioni corrispondenti, come mostrato in Figura 1.
   1. Posizionare i 4 campioni (BRAF WT, BRAF V600E 50%, 5% e 1%) nei rack vettore campione.
   2. Posizionare le scatole di punta nelle vaschette nelle colonne 2 e 3 e consultare i suggerimenti per la presenza di più di un filtro per ogni suggerimento, che interrompe la corsa.
   3. Assicurare corretta miscelazione del tampone di lisi e tampone di lavaggio invertendo loro 3-5 volte e caricarle nelle rispettive depressioni nella colonna 4 (Figura 1).
   4. Dopo l'inversione per poche volte o Vort miteexing, caricare il tampone di eluizione, sfere magnetiche, e di buffer FFPE nelle piccole depressioni nella colonna 5, lasciando 1 slot vuoto dove indicato (Figura 1, Tabella 1).
   5. Caricare un 2 ml profondo pozzetti (DWP) sul supporto piastra (Figura 1).
3. Effettuare le seguenti operazioni finali prima di iniziare una corsa:
   1. Stappare tutti i tubi e le depressioni dei reagenti. Confermare che dispone di sufficiente capacità nella bottiglia rifiuti liquidi. Verificare che la bottiglia rifiuti solidi è vuota e foderato con un sacchetto. Verificare che la piastra di punta di espulsione è centrata nel gruppo dei rifiuti.
   2. Chiudere il coperchio anteriore.
4. Avviare il software. Aprire il file NA_Prep_Main_MLSTARlet.med.
5. Fare clic su "Start". Lo stato dello strumento passa dal minimo a correre.
6. Inserire il numero di campioni per questa esecuzione. Scegliere il metodo desiderato per questa esecuzione (DNA = 0). Inserire la posizione della prima alta volume punta, selezionando "1" se tutti i vassoi sono pieni. Inserire la posizione della prima punta volume standard, selezionando "1" se tutti i vassoi sono pieni.
   Nota: Lo strumento quindi eseguire attraverso passaggi automatizzati senza l'intervento dell'utente. Un flusso di lavoro dettagliato è illustrato nella figura 2. Una volta che l'esperimento è finito, rifiuti reagenti e punte sono iniettati nella piletta.
7. Quantificare DNA genomico purificato utilizzando un metodo fluorimetrico.
   Nota: campioni di DNA che contengono una concentrazione minima di 3,3 ng / ml sono sottoposti a ddPCR analisi (sezione 2).

2. DNA Mutazione Profiling: ddPCR protocollo

Nota: Il protocollo per mutazione del DNA profiling consiste di 3 fasi principali: 1) generazione Droplet, 2) Convenzionale amplificazione PCR, 3) la lettura di gocce e 4) mutazione del DNA profiling.

2.1. Generazione Droplet

Nota: ddPCR Supermix èconsigliato per ddPCR, come questa miscela contiene reagenti necessari per la generazione di goccioline.

1. Per evitare la contaminazione, seguire le precauzioni standard, ad esempio indossando guanti, utilizzando una cappa pulita PCR, pipette pulite, e tubi basso contenuto proteico vincolante.
2. Assicurarsi che la concentrazione minima di campione di DNA genomico umano è di 3,3 ng / ml. Nota: La quantità di concentrazione del campione di DNA purificato varia in base all'analisi di rilevamento della frequenza di mutazione%.
3. Montare miscele di reazione a piastre PCR da 96 pozzetti. Scongelare ed equilibrare i componenti di reazione di RT. Preparare le reazioni PCR combinando 2X ddPCR supermix (10 ml) e 20 primer (avanti e indietro, 900 nm) e sonda (250 Nm), con ogni campione di DNA purificato (66ng / 2 ml), portare a 20 ml con acqua distillata (come secondo il protocollo generatore di gocce)
4. Agitare accuratamente la miscela di garantire l'omogeneità e centrifugare brevemente per raccogliere il contenuto al fondo della provetta prima di dispensare. Carico 20 & #181; l sulla cartuccia per la formazione di goccioline.
5. Il funzionamento del generatore di gocce, per protocollo consigliato dal produttore
   1. Inserire la cartuccia nel supporto con la tacca nella cartuccia posizionato sul lato superiore sinistro del titolare. Aggiungere 20 ml di miscela di reazione contenente campioni in mezzo, e 70 ml di olio di generatore nei pozzetti inferiori.
   2. Fissare la guarnizione nella parte superiore della cartuccia. Assicurarsi che la guarnizione sia saldamente agganciato su entrambe le estremità del titolare; altrimenti, pressione sufficiente per la generazione di goccioline non sarà raggiunto.
   3. Aprire il generatore gocciolina premendo il tasto verde sulla parte superiore dello strumento e inserire la cartuccia. Quando la porta è nella posizione corretta, sia la potenza (sinistra a destra) e il supporto (destra centro) spie sono verdi.
   4. Premere il pulsante in alto sullo strumento nuovo per chiudere la porta e avviare la generazione delle gocce. Nota: Dopo aver premuto il button, un collettore si posizioni sopra i pozzi di scarico, disegno e campioni di olio attraverso i canali microfluidica, dove vengono create le goccioline. Goccioline confluiscono goccia pozzo, dove si accumulano. La spia delle gocce (a destra) lampeggia in verde dopo 10 secondi per indicare che la generazione delle gocce è in corso.
   5. Quando la generazione delle gocce è completo, tutti gli indicatori 3 luci cambiano a verde fissa; aprire la porta premendo il pulsante, e rimuovere il supporto dall'unità. Rimuovere la guarnizione usa e getta dal supporto e scartarla. Nota: I primi pozzetti della cartuccia contengono goccioline, ed i pozzetti medio e basso sono quasi vuoto, con una piccola quantità di olio residuo.

2.2. Preparazione per la PCR

1. Per ciascun campione, Pipettare 40 ml del contenuto goccioline dall'alto bene le cartucce in un singolo pozzetto di una piastra a 96 pozzetti PCR raccomandata indicata nella protocollo dello strumento del produttore. Note: Usando una pipetta multicanale è ideale per trasferire le goccioline emulsioni. Lento e dolce l'aspirazione di goccioline si consiglia di ridurre al minimo delle gocce di taglio durante i trasferimenti.
2. Sigillare la piastra PCR con pellicola subito dopo il trasferimento gocce per evitare l'evaporazione. Utilizzare piastra del foglio perforabili che sono compatibili con la pellicola sigillante PCR e gli aghi nel lettore gocciolina. Seguire le istruzioni riportate nel manuale di istruzioni sigillante piatto PCR.
3. Impostare la temperatura della piastra sigillante a 180 ° C e il tempo di 5 sec.
4. Toccare la freccia per aprire lo sportello del vassoio. Posizionare il blocco di supporto sul vassoio con il lato di 96 pozzetti rivolto verso l'alto. Posizionare la piastra a 96 pozzetti sul blocco di supporto e assicurarsi che tutti i pozzetti della piastra sono allineati con il blocco di supporto.
5. Coprire la piastra a 96 pozzetti con 1 foglio di pellicola di sigillo perforabile. Una volta che la piastra a 96 pozzetti è fissato sul blocco di supporto e coperto con la pellicola di sigillo perforabile, toccare il pulsante di tenuta. Il vassoio si chiudee saldatura a caldo avvierà.
6. Quando termosaldatura è completa, la porta si apre automaticamente; rimuovere la piastra dal blocco calore per cicli termici e quindi rimuovere il blocco di calore.
7. Assicurarsi che tutti i pozzetti della piastra sono sigillate verificando che le depressioni del foglio sono evidenti su ogni bene. Una volta sigillato, il piatto è pronto per cicli termici.
8. Una volta che le goccioline vengono rimossi, premere i fermi sul supporto della cartuccia per aprirlo. Rimuovere la cartuccia vuota e disfarsene.
9. Eseguire convenzionale amplificazione PCR seguendo i parametri descritti nella tabella 2.

2.3 lettura Droplet (come da protocollo consigliato dal produttore)

Nota: Dopo l'amplificazione PCR del target di acido nucleico nelle goccioline, lo strumento lettore gocciolina analizza ogni gocciolina singolarmente usando un sistema di rilevamento ^2-colore 13. Noi di solito impostato per rilevare un FAMd VIC fluorofori giornalista.

1. Fai clic su "Sistema Flush" per innescare il lettore droplet e renderlo pronto per l'analisi ddPCR.
2. Caricare la piastra nel lettore droplet e cliccare su "start". Il lettore gocciolina aspira ogni campione, singulates le goccioline, e torrenti in fila davanti a un rilevatore a 2 colori. Il rivelatore legge le goccioline enumerare campioni positivi e negativi.
3. Quando la lettura delle gocce, aprire la porta e rimuovere il supporto targa dall'unità. Rimuovere la piastra PCR a 96 pozzetti dal supporto e scartarla.
4. Per una corretta manutenzione, sostituire l'olio lettore di droplet e svuotare il contenitore di raccolta in base alle esigenze. Aggiungere 50 ml di candeggina al 10% per la bottiglia degli scarti per evitare la crescita microbica.

2.4 DNA mutazione del profilo (come da protocollo consigliato dal produttore)

Nota: le goccioline PCR-positivi e PCR-negativi sono contate per fornire quantific assolutozione di destinazione mutazioni BRAF V600E DNA in forma digitale, utilizzando software di analisi dei dati.

1. Fare clic su Imposta per inserire le informazioni relative ai campioni, saggi, ed esperimenti.
2. Nella finestra di installazione, caricare una piastra (filename.qlp), quindi fare clic su Analizza per aprire e analizzare i dati. L'interfaccia di analisi dei dati è suddiviso in tre finestre: Tabella Risultati, ben Selector e dati oggetto di trattamento / grafico di visualizzazione.
3. Nella finestra dati elaborati, i dati di concentrazione per ogni target appaiono nei pozzetti nella mappa piastra e sono riportati nella tabella dei risultati. Clicca Concentrazione per visualizzare i dati Terreni di concentramento.

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Risultati

Per la nostra analisi ddPCR, abbiamo studiato le linee di cellule normali di riferimento mutazione FFPE BRAFV600E. Il lettore droplet si connette a un software portatile di analisi dei dati del computer in esecuzione. Ogni singola goccia viene definita sulla base dell'ampiezza fluorescente come positivo o negativo. Il software fornito dal produttore permette anche un taglio definito dall'utente da immettere per definire la soglia tra le goccioline positivi e negativi. Il numero di goccioline positivi e ...

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Discussione

Qui, si evidenzia l'applicabilità di ddPCR e isolamento del DNA da campioni di linee cellulari normali di riferimento FFPE una specifica valutazione mutazione del gene. In questo studio, TPS DNA metodo di isolamento automatico viene utilizzato, che può essere facilmente adattato, automatizzato, e può ospitare fino a 48 campioni diversi contemporaneamente, consentendo per esperimenti su scala più ampia e bassa variabilità. Uno dei limiti di isolamento del DNA nel presente lavoro è che ogni campione FFPE è unic...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hamilton MICROLAB STARlet IVD instrument	Siemens	10701001	Automated DNA isolation instrument
QX200 Droplet Generator	Bio-Rad	772BR1119
QX200 Droplet Reader	Bio-Rad	771BR1497
Conventional PCR machine capable of ramp-time adjustment		621BR17718
PX1 PCR plate sealer	Bio-Rad	770BR1575
QuantaSoft software	Bio-Rad
DNA isolation kit
VERSANT Tissue Preparation Reagents Box 1	Siemens	10632398
VERSANT Tissue Preparation Reagents Box 1	Siemens	10632399
CO-RE tips	Siemens
ddPCR mutation analysis
ddPCR Supermix	Bio-Rad	BR186-3010	2X concentration
DG8 cartridge	Bio-Rad	BR186-4008
Droplet Generator oil	Bio-Rad	BR-186-3005
Gasket	Bio-Rad	BR186-3006
Droplet reader oil	Bio-Rad	BR-186-3004