Generazione di culture geneticamente modificate pelle organotipiche Uso devitalizzate derma umano

Riepilogo

The goal of this paper is to provide a comprehensive and detailed protocol on how to generate genetically modified human organotypic skin from epidermal keratinocytes and devitalized human dermis.

Abstract

Colture organotipiche permettono la ricostituzione di un ambiente 3D critico per interazioni di contatto cellula-cellula e cellula-matrice che imita la funzione e la fisiologia dei loro omologhi dei tessuti in vivo. Questo è esemplificato da culture pelle organotipiche che riassume fedelmente la differenziazione epidermica e il programma di stratificazione. Cheratinociti epidermici primari umani sono geneticamente manipolabile attraverso retrovirus in cui i geni possono essere facilmente overexpressed o abbattuti. Questi cheratinociti geneticamente modificati possono poi essere utilizzati per rigenerare epidermide umana in colture organotipiche della pelle che forniscono un modello potente per studiare percorsi genetici di crescita epidermico impattante, la differenziazione e la progressione della malattia. I protocolli qui presentati descrivono metodi per preparare derma umano devitalizzati nonché manipolare geneticamente cheratinociti umani primari per generare culture organotipiche pelle. Pelle umana rigenerata può essere utilizzato in downstrapplicazioni EAM come il profilo di espressione genica, immunostaining, e immunoprecipitazioni cromatina seguiti da sequenziamento ad alta produttività. Così, la generazione di queste culture organotipiche pelle geneticamente modificati consentirà la determinazione di geni cruciali per mantenere l'omeostasi della pelle.

Introduzione

L'epidermide umana è un epitelio stratificato che si collega al derma sottostante attraverso una matrice extracellulare noto come l'epidermide zone.The membrana basale non serve solo come una barriera impermeabile per evitare la perdita di umidità, ma anche come una prima linea di difesa per proteggere la corpo dalle sostanze estranee e tossiche ^1. Lo strato basale, che è lo strato più profondo dell'epidermide, contiene le cellule staminali epidermiche e progenitrici che danno luogo alla progenie differenziata che formano il resto dell'epidermide ^2. Come le cellule progenitrici epidermiche differenziano migrano verso l'alto per formare il primo strato di cellule differenziate note come strato spinoso ^3. Nello strato spinoso, cellule attivano l'espressione di cheratine 1 e 10, che quindi fornisce la forza di resistere allo stress fisico per gli strati differenziati dell'epidermide. Come le cellule strato spinoso ulteriormente differenziano, si muovono verso l'alto nell'epidermide a perm strato granulare che è caratterizzata dalla formazione di keratohyalin e lamellari granuli così come proteine ​​strutturali che vengono assemblati sotto la membrana plasmatica. Poiché le cellule procedere nel processo di differenziazione, le proteine ​​sotto la membrana plasmatica sono trasversali collegati tra loro, mentre i granuli vengono estrusi lamellari dalle cellule per formare una barriera lipidica ricco chiamato strato corneo ^4.

Malattie che coinvolgono alterazioni nella crescita epidermico e impatto differenziazione ~ 20% della popolazione ^5. Così, la comprensione dei meccanismi di questo processo è di grande importanza. Dal momento che la manifestazione di molte di queste malattie è subordinato cellula-cellula o cellula-matrice contatto, colture organotipiche dove l'epidermide umana è ricostituito in un ambiente 3D sono stati creati ^6-10. Questi metodi tipicamente comportano l'uso di cheratinociti primari o trasformati seminate su matrice extracellulare come devitalizzati umanaderma, Matrigel o collagene.

Per comprendere gene meccanismi di regolamentazione che sono importanti nella crescita e differenziazione epidermica, cheratinociti possono essere geneticamente manipolati tramite vettori retrovirali per atterramento o iperespressione di geni nella cultura 2D e poi ricostituito in 3D. Questi metodi sono stati ampiamente utilizzati per caratterizzare i geni coinvolti nella epidermica staminali e cellule progenitrici auto-rinnovamento e la differenziazione, nonché la progressione di neoplasia ^11-21. Qui, è previsto un protocollo approfondito su come modificare l'espressione genica in colture organotipiche epidermiche attraverso l'uso di retrovirus.

Protocollo

Il protocollo pelle umana è stata effettuata in conformità con le linee guida della University of California, Ricerca Comitato Etico di San Diego. La pelle umana può essere ottenuto da campioni chirurgici scartati o comprato da banche della pelle (pelle banca è elencato nella tabella Materiali / Equipment). La posizione in cui la pelle è realizzata o età del donatore non è critico per l'esperimento finché le proteine ​​membrana basale (collagene / laminina) nel derma non sono degradati.

1. Preparazione di devitalizzate derma umano

1. Alla ricezione di pelle umana, posizionare il tessuto nella cappa coltura tissutale per scongelare (~ 3-5 min). A seconda delle dimensioni della pelle, posizionare il tessuto scongelato in un monouso tubo da 50 ml o 125 ml sterile bottiglia. La dimensione tipica della pelle da parte della banca pelle è di 0,75 mq.
2. Riempire il serbatoio pieno al 75% con 4x la penicillina e streptomicina (penna / strep) in PBS 1x. Agitare energicamente per5 min e smaltire il liquido. Ripetere questa operazione altre 3 volte.
3. Dopo l'ultimo lavaggio, trasferire il tessuto in una nuova provetta / bottiglia e aggiungere 4x fresco pen / strep / PBS per riempire 75% del contenitore. Incubare questa miscela in un incubatore di coltura tissutale a 37 ° C per 2 settimane per consentire la separazione del derma dell'epidermide.
4. In condizioni sterili, utilizzare una pinza a staccarsi l'epidermide dal derma. Il derma è completamente bianco, mentre l'epidermide avranno colorazione a seconda della razza del donatore (Figura 1A). Eliminare l'epidermide secondo il protocollo dell'istituzione per affrontare con i tessuti umani.
5. Posizionare il derma in un tubo o bottiglia e lavarlo in 4x penna / strep diluito in PBS 1x con vigorosi tremanti (5 min lavaggi per 4 volte). Dopo l'ultimo lavaggio, trasferire il derma in una nuova provetta / bottiglia in 4x penna / strep diluito in PBS 1x e conservare a 4 ° C fino al momento dell'uso. Derma possono essere conservati a 4 ° C per un massimo di un anno.

2. modificare geneticamente cheratinociti umani primari

NOTA: utilizzare le cellule phoenix amphotropic cresciute nei media DMEM completo [DMEM + 10% siero bovino fetale (FBS) + pen / strep] per la produzione di virus per infettare cheratinociti umani primari. Geni imballaggio virali che codificano proteine ​​come gag-pol e busta sono stabilmente integrati nel genoma della cellula Phoenix che consente la produzione di virus quando trasfettate con un vettore retrovirale. Phoenix cellule possono essere transfettate con alta efficienza che consente un'elevata produzione titolo virale. Virus prodotto da questa linea di confezionamento può infettare una grande varietà di cellule di mammiferi compreso umana.

1. 1 ° giorno: Il giorno prima trasfezione, le cellule fenice seme in un 6-pozzetti ad una densità di 800.000 cellule per pozzetto nei media DMEM completo.
2. Giorno 2: Il giorno della transfezione, utilizzare 3 mg di vettori retrovirali per pozzetto. Aliquotare 3 mg di vettore retrovirale in una provetta da 1,5 ml. Utilizzare un mix di 100 μ; l DMEM più 6 ml di reagente di trasfezione per ogni 3 mg di vettore. Mescolare 6 ml di reagente di trasfezione con 100 microlitri DMEM in una provetta da 1,5 ml. (I vettori retrovirali che vengono utilizzati sono elencati nella tabella attrezzature / materiali).
   1. Incubare per 5 minuti e aggiungere il composto di 106 microlitri nel tubo pre-aliquotati contenente 3 mg di vettore retrovirale. Mescolare e incubare a temperatura ambiente per 30 min. Aggiungere questa intera miscela gocce a ciascun pozzetto di cellule Phoenix.
3. 3 ° giorno: Il giorno dopo la trasfezione, rimuovere il supporto dalle cellule phoenix e aggiungere 2 ml di fresco supporto completo DMEM. Lo stesso giorno, seminare cheratinociti umani primari in 6 pozzetti ad una densità di 75.000 cellule per pozzetto. Mantenere i cheratinociti in un mezzo di siero cheratinociti gratuito (KCSFM) con antibiotici (penna / strep).
   NOTA: cheratinociti umani primari sono stati acquistati. Le cellule possono essere acquistati da una varietà di fornitori (elencati nella tabella Materiali / Equipment).
4. 4 ° giorno: Harconferire al supporto dalle cellule trasfettate fenice, che ora contiene particelle virali. Far passare il materiale attraverso un filtro da 0,45 micron con una siringa (per rimuovere tutte le cellule fenice contaminanti) e posizionare 2 ml sulle cheratinociti (placcato a 75.000 cellule / pozzetto del giorno precedente: vedere il punto 2.3). Aggiungere hexadimethrine bromuro (5 mg / ml) per i media per aiutare a mediare il processo di infezione. Titoli virali sono ~ 1 x 10 ⁷ TU / ml.
   1. Spin piastre da 6 pozzetti in una centrifuga a 200 xg per 1 ora a RT. Dopo lo spin, rimuovere i supporti contenenti virus e lavare le cellule una volta con PBS 1x prima di aggiungere KCSFM.
5. 5 ° giorno: infettare la stessa partita di cheratinociti di nuovo come al punto 2.4.
   NOTA: Selezionare i cheratinociti usando un farmaco, se vi è un marcatore sul vettore retrovirale ed espandere per l'uso in analisi a valle o applicazioni come colture organotipiche.

3. Configurazione Culture pelle organotipiche

1. Costruire ilcassetta organotipica da materiali comuni che si trovano in laboratorio o le cassette può essere personalizzato attraverso un negozio di fabbricazione di metallo (Figura 2A - F). Per rendere queste cassette da una piastra di coltura tissutale 3.5 cm, utilizzare un bisturi per rimuovere un 1,0 cm x 1,0 cm quadrato dal centro del coperchio di un piatto 3.5 cm (Figura 2A-B). Fate questo in condizioni di sterilità.
   1. Attaccare pioli quadrati sul fondo della cassetta (coperchio di 3.5 cm piatto) utilizzando smalto trasparente (Figura 2C). Lasciare 5 minuti per lo smalto si asciughi e capovolgere la cassetta sopra in modo che poggi sui pioli quadrati (Figura 2D). Posizionare la cassetta in un piatto 6 centimetri.
      NOTA: Piazza pioli possono essere acquistati da una varietà di arti e botteghe artigiane.
2. Preparare terreno di crescita dei cheratinociti (KGM) composto da 66% DMEM, il 22% F12 Ham, 100 unità / ml di penicillina, 100 mg / ml di streptomicina, il 10% FBS, 2,67 mg / ml di adenina, 40 ng / ml idrocortisone, 10 ng tossina colerica ml /, 4,94 mg / ml di insulina, 5 mg / ml transferrina, 1.36 ng / ml triiodo-L-tironina, 10 ng / ml EGF, e 10 ug / ml cloridrato ciprofloxacina. Filtrare il mezzo attraverso un filtro e conservare 0,22 micron a 4 ° C fino al momento dell'uso.
3. Prendere il derma dalla 4x pen / strep + soluzione PBS e lavare 2 volte in KGM e incubare in KGM a 37 ° C per due giorni prima dell'uso.
4. Tagliare il derma con un bisturi a 1,5 cm x 1,5 cm pezzi di dimensioni e quindi posizionare sul vassoio organotipica. Posizionare il derma con la parte superiore del derma rivolte verso l'alto. La parte superiore del derma sarà il lato che viene a contatto con i cheratinociti (Figura 1B).
5. Posizionare il derma pretagliati sul foro quadrato della cassetta organotipiche con il lato superiore del derma rivolti verso l'alto (Figura 3A).
6. Capovolgere l'intera cassetta organotipica contenente oltre il derma con pinze (Figura 3B). Scongelare la soluzione matrice extracellulare sul ghiaccio. Usare un ago e la siringa a tirar fuori 100 ml di soluzione di matrice extracellulare per cassetta. Aggiungere 5 gocce al fondo del derma (lato lucido) e agitare leggermente per assicurare una distribuzione derma (Figura 3B).
7. Lasciare 5 minuti per la soluzione matrice extracellulare commerciale a solidificare completamente (Figura 3C). Dopo la solidificazione, utilizzare pinze per capovolgere il cassetto sopra. Aggiungere 4 ml di KGM al piatto 6 cm.
8. Posizionare 0,5-1 milioni di cheratinociti geneticamente modificati sulle cassette organotipiche contenenti il derma (Figura 3D).
   1. Trypsinize cheratinociti mettendo 4 ml di 0,05% tripsina su piastre di 10 cm per 5 minuti e spegnere con 4 ml di mezzi DMEM completo.
   2. Contare i cheratinociti utilizzando un emocitometro e poi spin down a 200 xg per 5 min. Risospendere 0.5-1 milioni cellule (a seconda del numero di cellule disponibili) in 90 μl di KGM e posizionare tutte le cellule sulle derma.
      NOTA: È importante posizionare lo stesso numero di celle sul derma nello stesso esperimento per garantire che eventuali differenze rilevate spessore dell'epidermide rigenerata non è dovuta a differenze nel numero iniziale di cellule. Posizionamento di meno di 0,5 milioni di cellule sul derma può portare a poveri stratificazione e la differenziazione.
9. Modificare i media KGM sulle culture organotipiche ogni altro giorno. Tessuto raccolto 1-14 giorni dopo il posizionamento dei cheratinociti sulle derma. Stratificazione e la differenziazione completa dell'epidermide avviene di solito dopo giorno 5.

Risultati

Il primo passo nella generazione di pelle umana organotipica è rimuovere l'epidermide dal derma. I due settimana incubazione della pelle a 37 ° C in 4x pen / strep / PBS dovrebbe consentire la separazione del derma dall'epidermide (Figura 1A). Se la separazione dell'epidermide e del derma è difficile posizionare il tessuto a 37 ° C a 4x penna / strep / PBS per un'altra settimana e poi provare di nuovo peeling con pinze.

Una delle chiavi per rigenerare il ...

Discussione

La manipolazione genetica in pelle umana colture organotipiche offrono molti vantaggi a comunemente studiato 2D cellule in coltura e modelli di mouse. Culture 2D mancano i tre cellula-cellula e cellula-matrice extracellulare interazioni dimensionali si trovano in tessuti e organi intatti. Recenti studi hanno anche trovato enormi differenze tra le colture di cellule tumorali della pelle 2D e 3D con le cellule in coltura 3D che mostra molto di più somiglianze di espressione genica per la pelle umana primaria tumori ^...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Human skin	New York Firefighters Skin Bank	http://www.cornellsurgery.org/pro/services/burn-surgery/skin-bank.html
PEN/STREP	GIBCO	15140-122
amphotropic phoenix cell lines	ATCC	CRL-3213
FUGENE 6 transfection reagent	Promega	E2691
Keratinocyte Media (KCSFM)	Life Technologies	17005042
DMEM	GIBCO	11995
Ham's F12	Cambrex	12-615F
FBS	GIBCO	10437-028
Adenine	Sigma	A-9795
Cholera Toxin	Sigma	C-8052
Hydrocortisone	Calbiochem	3896
Insulin	Sigma	I-1882
EGF	Invitrogen	13247-051
Transferrin	Sigma	T-0665
Ciprofloxacin Hydrochloride	Serologicals	89-001-1
cautery	Bovie Medical Corporation	AA01
Matrigel	Corning	354234
Keratin 1 antibody	Biolegend	PRB-149P
square pegs	Arts and crafts stores
human neonatal keratinocytes	ATCC	PCS-200-010
human neonatal keratinocytes	Cell Applications	102K-05n
MSCV retroviral vector	Clontech	634401
LZRS retroviral vector	Addgene
pSuper.Retro.Puro Retroviral vector	Oligoengine	VEC-PRT-0002
hexadimethrine bromide	Sigma	H9268-5G