Efficiente Espressione cellulari di mammifero e Passo singolo Purificazione di extracellulare glicoproteine ​​per cristallizzazione

Riepilogo

This is a quick, cost-efficient protocol for the production of secreted, glycosylated mammalian proteins and subsequent single-step purification with sufficient yields of homogenous protein for X-ray crystallography and other biophysical studies.

Abstract

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time and cost efficient protocol for secreted protein expression in mammalian cells and one step purification using nickel affinity chromatography. The system is based on large scale transient transfection of mammalian cells in suspension, which greatly decreases the time to produce protein, as it eliminates steps, such as developing expression viruses or generating stable expressing cell lines. This protocol utilizes cheap transfection agents, which can be easily made by simple chemical modification, or moderately priced transfection agents, which increase yield through increased transfection efficiency and decreased cytotoxicity. Careful monitoring and maintaining of media glucose levels increases protein yield. Controlling the maturation of native glycans at the expression step increases the final yield of properly folded and functional mammalian proteins, which are ideal properties to pursue X-ray crystallography. In some cases, single step purification produces protein of sufficient purity for crystallization, which is demonstrated here as an example case.

Introduzione

La comprensione della struttura delle proteine ​​a livello atomico è la chiave per scoprire le basi molecolari dei percorsi e delle malattie biologiche. X-ray cristallografia di proteine ​​è il / metodo applicabile più ampiamente usato per determinare le strutture macromolecolari. La sfida principale di questo metodo è l'ottenimento di una quantità sufficiente di propriamente piegato, proteina pura. Questo diventa un problema particolare quando si lavora con le proteine ​​secrete di mammifero, che subiscono specifiche modificazioni post-traduzionali.

Proteine ​​batteri-espresse sono la fonte primaria di proteine ​​cristallizzate depositate nel Protein Data Bank ^1. Sistemi di espressione batterici sono largamente preferibili perché sono veloci, poco costosi e producono tipicamente alte rese di proteine. Tuttavia, i domini extracellulari di proteine ​​di mammifero espresse in batteri sono spesso non correttamente ripiegate, in cui sono richiesti caso refolding ed estesa purificazione passi per ottenere omogeneamente foproteine ​​lded. Inoltre, molte proteine ​​di mammiferi necessitano di glicosilazione post-traslazionale per ottenere una corretta piegatura ^2. Anche se l'espressione e glicosilazione in cellule di lievito o di insetto in grado di superare il problema ripiegamento, modificazioni post-traslazionali, tra cui glicosilazione, differiscono significativamente da quelle delle cellule di mammifero ^3, producendo proteine ​​con modifiche non corrette o non omogenei.

Le cellule di mammiferi esprimono tutta la macchinario molecolare necessario per garantire un'adeguata modificazioni post-traslazionale e pieghevoli; Tuttavia, questi sistemi di espressione non sono tipicamente preferiti dalla maggior parte laboratori, a causa di rendimenti limitati e costi elevati di reagenti e materiali di consumo. Polietilenimmina (PEI), un reagente di trasfezione standard è relativamente a buon mercato, ma impone una notevole citotossicità e la bassa efficienza di trasfezione, con conseguente aumento dei costi a supporto delle cellule, il DNA, e attrezzature coltura. Molte alternative al PEI sono proibitivi. Ci rivolgiamoquesti problemi descrivendo una combinazione di migliori strumenti di coltura cellulare e chimicamente modificati PEI per il metodo rapido e relativamente poco costoso per l'espressione di proteine ​​secrete mammifero, seguita da purificazione passo singolo. Questo metodo robusto fornisce rendimenti sufficienti per studi funzionali e biochimici ^4, e in alcuni casi, si traduce in proteine ​​suscettibili di cristallizzazione senza ulteriore purificazione.

Questo protocollo descrive diverse tecniche per massimizzare l'espressione e la resa per le proteine ​​di mammiferi secrete nel rene embrionali umane (HEK) 293F cellule coltivate in sospensione. Efficienza di trasfezione (e costo), la produzione di proteine ​​e purificazione sono tutti sempre maggiore seguendo questo protocollo. PEI modificato con l'aggiunta di carbammati per reazione apertura d'anello singolo step (PEI-TMC-25, sintesi e proprietà descritte in dettaglio ref ⁵⁾ migliora notevolmente l'efficienza di trasfezione, riduce la citotossicità da cationicorottura della membrana e di conseguenza riduce i costi di sperimentazione. Inoltre, la vitalità cellulare e l'espressione della proteina sono notevolmente migliorate con l'aggiunta di supplementi di coltura per la fornitura di glucosio e vitamine. È importante sottolineare che per la produzione di proteine ​​glicosilate, il trattamento con kifunensine, un inibitore chimico non tossico di Mannosidase I, produce proteine ​​con definite, glycans immaturi, che possono essere rimossi dal EndoHf endoglicosidasi per produrre proteine ​​con un singolo N-acetilglucosamina al posto di un full-length glicano ⁶ N-linked. Infine, la secrezione di proteine ​​in un mezzo chimicamente definito privo di siero consente purificazione rapida e facile per studi strutturali e biochimici. Single-step acido nitrilotriacetico nichel (Ni-NTA) purificazione resina rimuove la maggior parte dei contaminanti specie nel surnatante e, in alcuni casi, può produrre proteine ​​di purezza sufficiente per cristallizzazione.

Protocollo

1. Produzione di milligrammo quantità di DNA plasmidi per larga scala trasfezione transiente

1. Clonare la proteina di interesse in un alto numero di copie di mammifero vettore di espressione mediante clonazione sito di restrizione, o altra tecnica appropriata.
   1. Per ottenere risultati ottimali, utilizzare pHLsec ⁷ vettore, che ha un built-in C-terminale 6His-tag, un promotore forte sequenza di Kozak e un segnale di secrezione ottimizzato.
2. Trasforma il plasmide sulle cellule competenti.
   1. Aggiungere 20 ml di cellule competenti di E. coli su 1 pg di DNA plasmidico e incubare in ghiaccio per 30 min.
   2. Cellule shock termico a 42 ° C per 35 secondi, poi incubare in ghiaccio per 2 minuti.
   3. Aggiungere 300 ml di mezzo di crescita microbica (SOC) e incubare a 37 ° C per 45 minuti, agitando a 220 rpm.
   4. Cellule piastra sulla piastra di agar con un'appropriata selezione antibiotica.
      1. Utilizzare 100 mg / ml carbenicillina se il plasmide è nel vettore pHLsec.
3. Colonie culturali in 250 ml di Luria Broth (LB) Supporto integrato con 100 mg / ml antibiotico (carbenicillina) O / N a 37 ° C, agitando a 220 giri al minuto.
4. Purificare il DNA dalla cultura con Hi-Speed ​​plasmidi Maxi Kit secondo il protocollo del produttore.
   1. Eluire DNA in tampone EB (10 mM Tris-Cl, pH 8,5), invece di tampone TE.
   2. Aliquota il plasmide purificato in quantità necessaria per la trasfezione e conservare a -20 ° C.

2. Su larga scala, Cultura e transitoria Transfection di 293F Cells

1. Supplemento 1 L 293F media con 10 ml di glutammina e 5 ml Pen / Strep (entrambi 100x). Conservare a 4 ° C. 5 ml Pen / Strep è una forza sufficiente in condizioni di libero-siero e la concentrazione di antibiotico ridotto migliora la vitalità delle cellule durante la trasfezione, che migliora le rese di proteine.
2. Cultura cellule 293F in 300 ml media in 1 L policarbonato sconcertato beute con tappo ventilatos a 37 ° C con 8% di CO _2, agitando in uno standard di coltura tissutale incubatore.
3. Diluire le cellule per 5 x 10 ⁵ / ml densità un giorno prima trasfezione.
4. Il giorno della trasfezione, supplemento mezzo di coltura aggiungendo 10% del volume di 2% w / v Boost cellulare in 293F media.
   1. Misurare la concentrazione di glucosio usando un monitor di glucosio in base alle istruzioni del produttore e utilizzare integratori come necessario per ottenere una concentrazione di glucosio di 500 mg / dL.
5. Aggiungere kifunensine (1 mg / ml concentrazione finale) in questa fase per controllare glicosilazione delle proteine.
6. Calcolare il volume di DNA richiesto per 1 ug plasmide per 1 x 10 ⁶ cellule. In condizioni sterili, diluire DNA in mezzo privo di siero 5 ml.
7. Calcolare il volume di reagente trasfezione richiesto per 1 mg plasmide per 2 ml reagente di trasfezione. In condizioni sterili, diluire il reagente trasfezione (PEI-TMC-25) in mezzo privo di siero 5 ml.
8. Aggiungerereagente di trasfezione in soluzione di DNA con incrementi di 1 ml, mescolando delicatamente. Incubare per 30 minuti a RT per complessi DNA-reagente per formare. Quindi aggiungere la soluzione sulle celle in maniera goccia a goccia.
9. Consentono alle cellule trasfettate di esprimere proteine ​​per 72-96 ore. Supplemento con ~ media il 10% del volume Boost cellulare al giorno o, se necessario, per mantenere il glucosio lettura 400-600 mg / dl.

3. Purificazione

1. Decantare cultura in un pallone centrifuga, centrifugare per 20 minuti a 1300 xg per pellet cellule e quindi raccogliere il surnatante. Se necessario, girare una seconda volta e / o l'uso del filtro 0,22 micron per chiarire surnatante.
2. Aggiungere 10% del volume 10x Ni-NTA tampone di legame (1,5 M NaCl, 0,5 MK ₂ HPO _4, 0,1 M Tris pH 8,5, 50 mM imidazolo).
3. Preparare una colonna gravità aggiungendo 2 ml di Ni-NTA slurry in una colonna e equilibrante con 10 volumi di colonna (CV) di 1x tampone di legame. Se possibile, fare tutti i passi di colonna in una camera a 4 ° C. Alternatively, proteine ​​freddo e tutti i buffer sul ghiaccio prima del passaggio della colonna, e mantenere proteine ​​e raccolti a flusso continuo su ghiaccio.
   Nota: Ni-NTA slurry è del 50% in volume di resina e indicato capacità legante della produzione è di 50 mg / ml. Ni-NTA sfere possono essere ricaricate per molteplici usi
4. Flusso surnatante sulla resina e raccogliere flow-through. Ripetere questo passaggio.
5. Lavare con 10 CV di tampone di lavaggio (300 mM NaCl, 50 mM K ₂ HPO _4, 20 mM imidazolo pH 8).
6. Eluire la proteina in 5 CV di tampone di eluizione (NaCl 300 mM, 50 mM K ₂ HPO _4, 250 mM imidazolo pH 8).
7. Se è richiesta deglycosylation:
   1. Per un volume finale di 0,5 ml, concentrato eluato a 0,43 ml utilizzando un concentratore centrifugazione. Se precipita modulo, sedimentare i detriti per centrifugazione a 16.000 xg e 4 ° C.
   2. Aggiungere 50 ml di 500 mM Na-citrato pH 5,5.
   3. Aggiungere 20 ml di EndoHf (1 x 10 ⁶ U / ml). Incubare a temperatura ambiente per 2 ore.
      None: L'enzima funziona in modo ottimale a 37 ° C, che può causare la proteina concentrata per aggregare. Estendere l'incubazione RT, se deglicosilazione, valutata mediante SDS-PAGE o immunoblotting, è incompleta. L'enzima non ha attività a 4 ° C.
   4. Per rimuovere EndoHf: Lavare amilosio resina 3x in tampone fosfato (PBS) o tampone di stoccaggio definitivo. Incubare proteine ​​con resina per 1 ora a 4 ° C. Spin 5 min a 1000 xg per far sedimentare perline e raccogliere il surnatante.
   5. Concentrato di proteine ​​utilizzando appropriato filtro centrifugazione peso molecolare cutoff e buffer di scambio nel buffer di memoria (150 mM NaCl e 20 mM HEPES pH 7.5).

Risultati

Qui di seguito i risultati di questo sistema di espressione applicata ad un dominio secreto 13 kDa immunoglobuline (Ig) dalla proteina di attivazione del recettore umano espresso sulle cellule mieloidi (2 hTREM2, residui 19-132). TREM2 è una proteina transmembrana di tipo I che contiene un singolo dominio extracellulare Ig che ha due ponti disolfuro e due siti di glicosilazione N-linked. A differenza di molte altre proteine ​​dominio Ig ^8, TREM2 non era suscettibile di ripiegamento da corpi di inclusione...

Discussione

Cellule HEK 293F offrono produzione robusta di proteine ​​che richiedono modificazioni post-traslazionali. Questo sistema permette l'espressione rapida e scalabile di proteine ​​ripiegate in modo nativo contenenti disolfuri, glicosilazione e fosforilazione che altrimenti assente utilizzando più strumenti di espressione di routine. Inoltre, questo sistema può essere utilizzato per l'espressione e la purificazione di complessi multi-proteici semplicemente co-trasfezione di plasmidi multipli. Oltre TREM2,...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Culture Flasks	GeneMate	F-5909B
293 Freestyle Media	Gibco/Life Technologies	12338-018
GlutaMAX	Gibco/Life Technologies	35050-061	Use in place of Glutamine
Hype 5 transfection reagent	Oz Biosciences	HY01500
293fectin transfection reagent	Life Technologies	12347019
PEI transfection reagent	Sigma-Aldrich	408727
Maxiprep Kit	Qiagen	12162
Ni-NTA Superflow	Qiagen	30430
Endo Hf	NEB	P0703L
Amylose Resin	NEB	E8021S
Cell Boost R05.2	HyClone	SH30584.02	Cell Culture Supplement
GlucCell	CESCO Bioengineering	DG2032	Glucose Monitoring System
Opti-MEM	Life Technologies	519850.91	Serum Free Medium for DNA transfection
Luria Broth (LB Media)	Life Technologies	10855-001
GC10 Competent Cells	Sigma-Aldrich	G2919