Costruzione di Engineered Definito umani cardiache tessuti per studiare i meccanismi della terapia cellulare cardiaca

Riepilogo

This manuscript describes the creation of defined engineered cardiac tissues using surface marker expression and cell sorting. The defined tissues can then be used in a multi-tissue bioreactor to investigate mechanisms of cardiac cell therapy in order to provide a functional, yet controlled, model system of the human heart.

Abstract

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that replicate the biofidelity of three-dimensional native human myocardium, while also enabling a controlled level of biological complexity, and allowing non-destructive longitudinal monitoring of tissue contractile function. Initially, human engineered cardiac tissues (hECT) were created using the entire cell population obtained from directed differentiation of human pluripotent stem cells, which typically yielded less than 50% cardiomyocytes. However, to create reliable predictive models of human myocardium, and to elucidate mechanisms of heterocellular interaction, it is essential to accurately control the biological composition in engineered tissues.

To address this limitation, we utilize live cell sorting for the cardiac surface marker SIRPα and the fibroblast marker CD90 to create tissues containing a 3:1 ratio of these cell types, respectively, that are then mixed together and added to a collagen-based matrix solution. Resulting hECTs are, thus, completely defined in both their cellular and extracellular matrix composition.

Here we describe the construction of defined hECTs as a model system to understand mechanisms of cell-cell interactions in cell therapies, using an example of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSC) that are currently being used in human clinical trials. The defined tissue composition is imperative to understand how the hMSCs may be interacting with the endogenous cardiac cell types to enhance tissue function. A bioreactor system is also described that simultaneously cultures six hECTs in parallel, permitting more efficient use of the cells after sorting.

Introduzione

Ingegneria tissutale cardiaca ha avanzato enormemente negli ultimi dieci anni, con più gruppi editoriali risultati completamente funzionale, tessuti battendo realizzati da entrambi i cardiomiociti murini ^1-6 e, più recentemente, umani cellule staminali derivate miociti cardiaci ^7-12. Il campo di ingegneria dei tessuti cardiaco è guidata da due obiettivi primari e sostanzialmente indipendenti: 1) per sviluppare innesti esogeni che possono essere trapiantate in mancanza di cuori per migliorare la funzione ^4-6; e 2) sviluppare modelli in vitro per lo studio fisiologia e malattie, o come strumenti di screening per sviluppo terapeutico ^2,7.

Tridimensionale (3-D) coltura cellulare è considerata essenziale per lo sviluppo di strumenti di screening di nuova generazione, come la matrice 3-D riflette un microambiente cardiaco più naturale di coltura cellulare monostrato 2-D tradizionali; infatti alcuni aspetti della biologia cellulare sono fondamentalmente differenti in 2-D vs 3-D culture ^13,14 . Inoltre, i tessuti cardiaci ingegnerizzati sono costruiti da componenti completamente definite: una matrice extracellulare, e una popolazione di cellule. Per i tessuti cardiaci umani ingegnerizzati tradizionali, mentre la composizione della matrice extracellulare (solitamente fibrina ⁹ o collagene ^7,8,10) è strettamente controllato, la composizione cella di input è meno ben definita, con l'intera miscela di cellule da una differenziazione cardiaca diretto di entrambi le cellule staminali embrionali (ESC ^7,9) o di cellule staminali pluripotenti indotte (IPSC ^10,12) che viene aggiunto ai tessuti. A seconda della linea cellulare specifica e l'efficienza del protocollo differenziazione utilizzato, la percentuale risultante dei cardiomiociti può variare da meno del 25% a oltre il 90%, il fenotipo specifico cardiomiociti (cioè, ventricular-, atrial- o pacemaker-like) può anche variare, anche la frazione non cardiomiociti può essere molto eterogenea ^15,16 e alterare la maturità del differenziata m cardiacoyocytes ^17.

Recenti cardiaco lavoro ingegneria dei tessuti ha tentato di controllare la popolazione di ingresso di cellule, sia con un reporter cardiaco linea di cellule staminali embrionali umane ⁸ o cellule superficie marcatori ¹⁸ viene utilizzato per isolare la componente dei miociti cardiaci della differenziazione. Mentre inizialmente un tessuto composto da sole miociti cardiaci sembra essere l'ideale, questo è infatti il ​​caso; hECTs composte unicamente da miociti cardiaci non riescono a compattare nei tessuti funzionali, con alcuni gruppi di trovare un rapporto 3: 1 di miociti cardiaci: fibroblasti che producono la più alta forza di contrazione ^8. Utilizzando diversi metodi di selezione delle cellule, compresi marcatori di superficie per l'ordinamento delle cellule vive, è possibile creare hECTs con popolazioni cellulari definiti. Mentre marcatori di cellule stromali non cardiaci sono stati disponibili per un certo tempo, come il marcatore CD90 fibroblasti putativo ^19,20, marcatori di superficie di miociti cardiaci sono stati più difficiliper identificare. SIRPα è stato tra i primi marcatori di superficie cardiaci identificati per miociti cardiaci umani ¹⁸ e ha dimostrato di essere altamente selettivo per il lignaggio cardiaco. Recentemente, abbiamo scoperto che in doppio ordinamento per SIRPα ⁺ e CD90 ^- cellule rese cardiomiociti quasi puro, con il CD90 ⁺ popolazione che presenta una fibroblasti simile fenotipo (Josowitz, osservazioni non pubblicate). Sulla base di questi risultati raccolti, qui descriviamo la creazione hECTs con un 3: 1 combinazione di SIRPα ⁺ / CD90 ^- cardiomiociti e fibroblasti CD90 ^+.

La capacità di progettare un tessuto cardiaco umano completamente definita è essenziale non solo per la creazione di solidi strumenti di screening, ma anche per lo sviluppo di sistemi modello per indagare cellulo emergente e le terapie cardiache gene-based. In particolare, numerose terapie cellulari per insufficienza cardiaca, utilizzando tipi di cellule tra cui le cellule staminali mesenchimali (MSC) ²¹ , le cellule staminali cardiache ²² e cellule mononucleari del midollo osseo ^23-25, sono stati testati in studi clinici. Mentre molti dei risultati iniziali sono stati promettenti ^21,23,25, il vantaggio iniziale, spesso diminuisce nel tempo ^26-29. Una tendenza simile è stata riportata in murini ingegnerizzato tessuto cardiaco, che mostrano un significativo beneficio funzionale a causa di supplementazione di MSC, ma il beneficio non è sostenuta durante la coltura a lungo termine ^1. Alla base le prestazioni sub-ottimali è la nostra limitata conoscenza dei meccanismi che regolano terapie cellulari. Una più profonda comprensione di come le cellule terapeutico esercitare la loro influenza benefica, nonché possibili conseguenze negative delle interazioni miociti-nonmyocyte, consentirebbe lo sviluppo di terapie migliorate ottenendo benefici clinicamente significativi e sostenuti, con effetti collaterali minimi, per i pazienti con insufficienza cardiaca.

Qui, descriviamo l'uso di hECTs definite a Esamate meccanismi di terapia cellulare. La composizione del tessuto controllato è essenziale per identificare i fattori specifici che influenzano le prestazioni dei cardiomiociti. Direttamente integrazione hECTs con il tipo di cellule terapeutiche di interesse (ad esempio, MSC), può rivelare gli effetti sulle prestazioni dei miociti cardiaci, come abbiamo dimostrato in crediti ECTS ratto ^1.

Il seguente protocollo multi-step inizia con diretto differenziazione delle cellule staminali cardiache, seguita dalla realizzazione del bioreattore multi-tessuto, e concludere con una descrizione di costruzione dei tessuti e analisi funzionale. I nostri esperimenti vengono eseguiti utilizzando la linea NIH-approvato H7 cellule staminali embrionali umane (hESC). Tuttavia, i seguenti protocolli sono anche stati testati utilizzando una linea hESC aggiuntivo e tre linee di cellule staminali pluripotenti indotte (hiPSC) con risultati simili. Abbiamo scoperto che l'efficienza nella differenziazione dei cardiomiociti e il successo in hect fabbricazione può essere linea cellulare dipendente, in particolare folinee r hiPSC derivati ​​da singoli pazienti. Seguendo questo protocollo, due piatti 6 pozzetti sono placcati con un totale di 1,68 milioni di hESC (140.000 cellule per pozzetto), che produce circa 2,5 milioni di miociti dopo differenziazione per 20 giorni e l'ordinamento, abbastanza per fare sei tessuti definiti.

Protocollo

Nota: eseguire tutte le manipolazioni di cellule in condizioni asettiche con una classe II cappa di sicurezza biologica HEPA filtrata e sterilizzare tutte le soluzioni da filtrandoli attraverso un filtro 0,2 micron. Esegui creazione tessuti e collaudo funzione sia stesse condizioni asettiche o una cappa a flusso laminare.

1. Semina di H7 hESC in preparazione differenziazione cardiaca

1. (Giorno 1) Preparazione della matrice di membrana basale
   1. Scongelare 150 ml aliquota di hESC matrice membrana basale qualificata su ghiaccio durante la notte a 4 ° C.
2. (Giorno 0-4) placcatura di hESC su piastre rivestite
   1. Diluire la matrice scongelata in 12 ml di ghiacciata DMEM / F12 e mescolare bene.
   2. Trasferire 1 ml della soluzione / F12-matrice DMEM in ciascun pozzetto di una piastra di coltura tissutale 6-trattati bene. Ogni aliquota di matrice può cappotto due 6 pozzetti.
   3. Incubare le piastre rivestite a temperatura ambiente per almeno 1 ora.
      Nota: Innostra esperienza, piatti rivestiti sigillati con paraffina può essere conservato in soluzione di matrice a 4 ° C per 10 giorni prima dell'uso.
   4. A circa il 75% di confluenza, dissociare il H7 hESC dal 10 centimetri piatto con 6 ml del reagente di dissociazione non enzimatica. Dopo 5 min, raschiare delicatamente le cellule dalla superficie coltura usando un raschietto cellulare e getta e trasferire la sospensione cellulare ad una sterile 15 ml provetta da centrifuga.
   5. Rimuovere 0,5 ml della soluzione di dissociazione con le cellule dal tubo 15 ml e ad una nuova sterile 15 ml di tubo (lasciando 5,5 ml del reagente di dissociazione di dissociare ulteriormente la hESC) per la linea di cellule staminali propagazione.
   6. Pellet 0,5 ml di cellule a 300 xg per 5 min a 20 ° C. Rimuovere il surnatante e risospendere delicatamente in 8 ml di mezzi di cellule staminali pluripotenti contenente 1% di penicillina-streptomicina poi trasferire in un nuovo, spalmati, 10 centimetri piatto di coltura di tessuti e di mantenere 37 ° C e 5% di CO ₂ per mantenere la linea di cellule staminali.
      Nota: Tenere i supporti di cellule staminali pluripotenti in ghiaccio durante i cambi di media.
   7. Nel frattempo, aggiungere 5,5 ml di 10 mM inibitore ROCK Y-27632 al 5,5 ml di dissociazione soluzione rimanente e continuare ad incubare a temperatura ambiente per un'altra 5-10 min. Mescolare delicatamente le cellule con un 5 ml pipetta sierologica. Continuare ad incubare fino ad ottenere una sospensione di cellule singole, quindi agglomerare le cellule a 300 xg per 5 min a temperatura ambiente.
   8. Risospendere le cellule in 5 ml di mezzi di cellule staminali pluripotenti ed eseguire una conta delle cellule utilizzando un emocitometro.
   9. Seme ciascun pozzetto del piatto 6 pozzetti ad una densità di 140.000 cellule per pozzetto. Seme due piastre da 6 pozzetti per creare un totale di sei tessuti definiti. Smaltire le cellule residue dopo la placcatura.
   10. Riempire i bene a 1 ml con supporto di cellule staminali pluripotenti e incubare a 37 ° C, 5% di CO _2. Ventiquattro ore dopo, rimuovere il supporto e aggiungere 2 ml di mezzi di cellule staminali pluripotenti fresco ad ogni pozzetto (Figura 1A ).
   11. Controllare la confluenza delle piastre ogni giorno e iniziare la differenziazione una volta che le cellule raggiungono circa il 75% di confluenza (Figura 1B - D).

2. (giorno 4-24) Differenziazione delle cellule staminali embrionali umane a cardiomiociti ^30,31

1. (Giorno 4-7, differenziazione Giorno 0-3) Mesoderma induzione
   1. Preparare RPMI differenziazione dei media I (tabella 1) mediante la combinazione di 500 ml RPMI 1640 con 10 ml di B27 supplemento (senza insulina) e 5 ml di soluzione madre di penicillina-streptomicina (10.000 UI / ml di penicillina; 10.000 mg / ml di streptomicina). Aliquota, sul ghiaccio, in provette da 50 ml e conservare a 4 ° C.
   2. (Giorno 4, differenziazione Giorno 0) Preparare i media induzione mesoderma con l'aggiunta di 2,4 ml di CHIR99021 piccolo inibitore di GSK3 molecola (10 mM magazzino, 6 micron concentrazione finale) a 12 ml di mezzi di differenziazione RPMI I. rimuovere il supporto di cellule staminali pluripotenti da ogni pozzetto unND sostituirlo con 2 ml di media mesoderma di induzione per pozzetto. Riportare la piastra per l'incubatore.
      Nota: morte cellulare significativa verifica in genere con l'aggiunta di CHIR99021 (Figura 1E). Il monostrato si riprenderà, ma è importante risciacquare le cellule morte via con il risciacquo DMEM / F12.
   3. (5 ° giorno, differenziazione Giorno 1) Preparare i media mesoderma induzione freschi come descritto sopra. Rimuovere i vecchi media da ciascun pozzetto e lavare una volta con 1 ml di DMEM / F12 per pozzetto. Aggiungere 2 ml di media mesoderma induzione fresco in ogni pozzetto.
      Nota: risciacquo ogni giorno dalle 0-10 giorni aumenta notevolmente la resa e la purezza dei miociti cardiaci.
   4. (Giorno 6, differenziazione Giorno 2) Rimuovere il supporto di induzione cardiaci e lavare una volta con 1 ml DMEM / F12 per pozzetto. Sostituire il risciacquo con 2 ml RPMI differenziazione dei media I (non piccole molecole aggiunto, ma ancora con la B27 (senza insulina) supplemento) e tornare alla incubatore.
2. (Giorno 7-13, differenziazione Day 3-10) Cardiac Mesoderma induzione
   1. (7 ° giorno, differenziazione Giorno 3) Preparare i media mesoderma induzione cardiaco con l'aggiunta di 6 ml di piccola molecola inibitore Wnt IWR-1 (10 mM magazzino, 5 mM finale) a 12 ml di RPMI mezzi differenziazione I.
   2. Rimuovere il supporto da ogni pozzetto, lavare una volta con 1 ml DMEM / F12 per pozzetto e sostituirlo con 2 ml di mezzi mesoderma induzione cardiaco per pozzetto.
   3. (Giorno 8, differenziazione Giorno 4) Preparare ulteriori 12 ml di mezzi di induzione mesoderma cardiaca come descritto sopra. Rimuovere il supporto aggiunto il giorno prima, lavare una volta con 1 ml DMEM / F12 per pozzetto e sostituirlo con 2 ml di media differenziazione mesoderma cardiaco fresco per bene e tornare alla incubatore.
   4. (Giorno 9-10, differenziazione Giorno 5-6) In entrambe le giornate, rimuovere i media mesoderma induzione cardiaci e risciacquare bene con ciascuno 1 ml di DMEM / F12.
   5. Aggiungere 2 ml di fresca mezzi differenziazione RPMI I (non piccole molecole aggiunto, ma ancora con la B27 (senza insulina) supplemento)a ciascun pozzetto e riportare la piastra per l'incubatore.
3. Cardiaca miociti Organizzazione / maturazione (Giorno 11-24, differenziazione Giorno 7-20) HES-derivato
   1. Preparare il supporto RPMI differenziazione II (Tabella 1) mediante la combinazione di 500 ml RPMI 1640 con 10 ml di B27 supplemento (con insulina) e 5 ml di soluzione madre di penicillina-streptomicina. Aliquota, sul ghiaccio, in provette da 50 ml e conservare a 4 ° C.
   2. (Giorno 11, differenziazione Giorno 7) Rimuovere RPMI mezzi differenziazione (senza insulina) da ogni pozzetto e risciacquare con 1 ml DMEM / F12. Sostituire con 2 ml di nuova differenziazione dei media RPMI II (con l'insulina) in ciascun pozzetto e tornare alla incubatore.
      Nota: deve prima essere osservato battito spontaneo tra i giorni 7 e 10. Se battito non viene rispettata in questo periodo, in genere indica scarsa efficienza differenziazione. Il protocollo può essere continuato fino al giorno 15 in uno sforzo per osservare battitura, ma se non battitura è osservato da giorno 15 è meglio start una nuova differenziazione.
   3. (Giorno 12-24, differenziazione Giorno 8-20) Ogni giorno, rimuovere i vecchi media differenziazione e sostituirlo con 2 ml di fresco RPMI differenziazione dei media II per pozzetto per permettere la maturazione delle cellule e l'organizzazione del monostrato pestaggio (Figura 1F, video figura 1 ).
      Nota: A seconda della morte cellulare residuo, può essere necessario risciacquare con 1 ml di DMEM / F12 attraverso la differenziazione giorno 10.

3. (Giorno 24, differenziazione Giorno 20) Isolamento dei miociti cardiaci e fibroblasti-like

1. Separa celle dal monostrato
   1. Rimuovere i supporti di differenziazione e lavare una volta con 1 ml di PBS.
   2. Dissociare il monostrati di 1 ml di soluzione dissociazione enzimatica (0,04% tripsina / EDTA 0,03%) a ciascun pozzetto.
   3. Spostare piastra in incubatore per 10 minuti. Nel frattempo, aggiungere 12 ml di inibitore ROCK a 6 ml di soluzione tripsina neutralizzazione.
   4. Gently aggiungere 1 ml di soluzione tripsina di neutralizzazione contenente l'inibitore ROCK a ciascun pozzetto della piastra per neutralizzare la soluzione tripsina.
   5. Usando una pipetta sterile, mescolare delicatamente ogni pozzetto di spezzare i gruppi di cellule.
   6. Trasferire tutti i 12 ml dal 6 pozzetti in una provetta da centrifuga da 15 ml.
      Nota: Dal momento che due 6 pozzetti sono utilizzati in questo protocollo, saranno necessari due tubi da 15 ml.
   7. Trasferimento 3 ml di PBS per un pozzetto della piastra, e quindi sequenzialmente trasferire gli stessi 3 ml per ogni successivo e per raccogliere le cellule residue sul piatto. Trasferire le restanti 3 ml dalla finale e nella stessa 15 ml tubo da centrifuga contenente le cellule.
   8. Pellet a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C.
2. Preparare cellule per Live cellulare Ricerca per FACS
   1. Preparare il buffer di colorazione con l'aggiunta di 5 ml di siero fetale bovino al 45 ml di PBS su ghiaccio con 50 ml di inibitore ROCK.
   2. Rimuovere il surnatante dal pel cellularelasciare (a 3.1.8) e risospendere in 1,2 ml di tampone colorazione.
   3. Trasferire 200 microlitri della sospensione cellulare a un nuovo, pre-raffreddata, 50 ml tubo da centrifuga su ghiaccio. Questo sarà il controllo della colorazione negativa.
   4. Trasferire il restante 1 ml di sospensione cellulare per un nuovo, pre-raffreddata, 50 ml tubo da centrifuga su ghiaccio e aggiungere 2 microlitri SIRPα-PE / Cy7 (diluizione 1: 500) e 4 ml di CD90-FITC (1: 250 diluizione) . Mescolare delicatamente la sospensione cellulare con una pipetta e ritornare al ghiaccio.
   5. Incubare sia il controllo negativo e campione, su un agitatore bilanciere, su ghiaccio, a 4 ° C per 1 ora.
   6. Preparare provette per il prelievo del campione con l'aggiunta di 3 ml di RPMI supporto (con insulina) per due 15 ml provette da centrifuga. Aggiungere 3 ml di inibitore ROCK a ciascuna provetta e memorizzare sul ghiaccio.
   7. Agglomerare le cellule colorate a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C e lavare due volte con almeno 10 ml di PBS ghiacciato per risciacquo.
   8. Aggiungere 1 ml di DAPI (1 mg / ml) per 5 ml di tampone colorazione. Delicatamenterisospendere il pellet campione con 1-3 ml di tampone colorazione DAPI contenenti usando una pipetta di trasferimento.
   9. Aggiungere 500 microlitri di tampone colorazione (senza DAPI aggiunto) per il controllo negativo.
   10. filtrare delicatamente sia il controllo negativo e campione attraverso un colino 40 micron cella per rimuovere grumi di cellule e di trasferire al polistirolo tubi FACS sul ghiaccio. Immediatamente portare i campioni al cell sorter.
   11. Simili a cellule vive stabilito metodi di ordinamento ^18, usa il controllo negativo per impostare le porte, selezionare per le cellule vive (DAPI negativo) e raccogliere sia la FITC ⁺ (vale a dire, CD90 ⁺ fibroblasti) e PE / Cy7 ⁺ (vale a dire, SIRPα ⁺ cardiomiociti ) le popolazioni in modo indipendente a 20 psi (Figura 2).
       Nota: Dopo aver impostato i cancelli, il controllo negativo può essere fissato in 4% PFA per determinare l'efficienza differenziazione dalla colorazione per troponina cardiaca-T.
       Nota: Alcuni ricercatori preferiscono utilizzare unisotipo di controllo piuttosto che il controllo senza macchia per impostare le porte al fine di compensare il legame degli anticorpi non specifico. Un controllo cosiddetta fluorescenza meno uno (FMO) è un'altra possibilità. A causa della chiara distribuzione bimodale del FITC, DAPI e segnali PE-Cy7, abbiamo gated dalla popolazione positiva, prudenzialmente puntando lontano nel cancello di positivo, che forse esclude alcuni veri positivi, ma aiuta a ridurre al minimo eventuali falsi positivi.
3. Cellulare riaggregazione in preparazione Tissue Engineering
   1. Dopo l'ordinamento delle cellule, pellet entrambi i tubi di raccolta e risospendere in 1 ml di DMEM contenente 10% di siero bovino neonatale, 1% di penicillina-streptomicina e 0,2% amfotericina B ( "NBS media").
   2. Ricombinare il SIRPα ⁺ e cellule CD90 ⁺ in un rapporto 3: 1 e piastra le cellule combinati in una cultura non-tessuto trattato capsula di Petri con una densità di 2 milioni di cellule per 60 centimetri ² (10 centimetri piatto). Aggiungere 10 ml di supporti NBS e 101; l di inibitore ROCK Y-27632.
   3. Mettere sospensione cellulare nel tessuto culturale incubatore per 48 ore per permettere riaggregazione delle cellule in piccoli gruppi.

4. cardiache umane Tissue Engineering

1. Realizzare il bioreattore Multi-tessuto
   Nota: per integrare le illustrazioni in figura 3A, file CAD con schemi di progettazione bioreattori dettagliate sono disponibili su richiesta dagli autori.
   1. Macchina del maestro stampo PDMS con la perforazione di sei fori equidistanti di 0,5 mm di diametro in un parallelepipedo 9 x 33 x 3,25 millimetri di politetrafluoroetilene.
   2. L'utilizzo di un fresa, macchina di un fotogramma di polisulfone misura 25 x 35 x 11 mm ^3. Lo scopo del telaio è di mantenere i montanti PDMS (costruite dal calco sopra) in allineamento con i pozzetti nella piastra di base.
   3. Utilizzando una fresa a 1 mm, macchina 6 pozzetti (6 x 1 x 1 mm ^3), 4 mm disparte, in 20 x 40 x 5 mm ³ pezzi di poli neratetrafluoroetilene per formare la piastra di base.
   4. Miscelare la base elastomerica e agente indurente per polidimetilsilossano (PDMS) in un 10: 1 w / w rapporto e aggiungere allo stampo politetrafluoroetilene personalizzato (fase 4.1.1) per creare due file di sei posti di forza in grado di rilevare, e incubare durante la notte e sotto vuoto a 80 ° C. Dopo la polimerizzazione, rimuovere delicatamente il PDMS dallo stampo master e marcare attentamente le cime di ogni post con un pennarello nero permanente per una maggiore contrasto e automatizzato di monitoraggio dopo deformazione in tempo reale.
      Nota: Politetrafluoroetilene è abbastanza morbido e può essere danneggiato facilmente. Prestare attenzione durante la pulizia dello stampo maestro prima di PDMS fusione per garantire la longevità del sistema e della geometria PDMS messaggio coerente. Un conduttori 0,5 mm può essere utilizzato per pulire i fori per i posti dopo ogni utilizzo, ma fare attenzione a non raschiare l'interno dei fori.
      Nota: Un'alternativa è degassare il PDMS sotto vuoto per diverse ore a temperatura ambiente, poi lasciare la cura miscela a pressione ambiente.Questo può portare ad un minor numero di bolle di gas residui che formano nei PDMS durante il processo di polimerizzazione.
   5. Sterilizzare tutti i componenti in autoclave a vapore.
      Nota: Lo stampo PDMS master (fase 4.1.1) e il telaio polisulfone (fase 4.1.2) sono entrambi riutilizzabili. Il PDMS posti creati dal cast (fase 4.1.4) è anche riutilizzabile, ma solo per circa 10 impieghi. Tuttavia, più PDMS messaggi possono essere creati in base alle esigenze utilizzando lo stampo maestro.
2. Raccogliere le cellule cardiache Reaggregated
   1. Rimuovere le cellule reaggregated dal termostato e trasferire tutti i 10 ml di media riaggregazione in una provetta da centrifuga da 50 ml.
   2. Lavare la piastra con 3 ml di PBS e trasferire il risciacquo allo stesso 50 ml tubo da centrifuga contenente il supporto riaggregazione.
   3. Aggiungere 3 ml di 0,04% tripsina / EDTA 0,03% al piatto da 10 cm e tornare alla incubatore per 5 min.
   4. Dopo 5 minuti, esaminare il piatto con un microscopio composto invertito a 10X di ingrandimento per garantire la completa dissociazione delle cellulezione dal piatto. Se alcuni gruppi residui sono ancora attaccate, agitare delicatamente la piastra per staccare i grumi. Se i cluster rimangono attaccati, tornare alla incubatore per altri 2-3 minuti. Non incubare più di dieci minuti o significativa la morte delle cellule possono verificarsi.
   5. Una volta che tutte le cellule sono staccati, aggiungere 3 ml di soluzione tripsina neutralizzazione. Mescolare delicatamente la soluzione di neutralizzazione con la soluzione tripsina-cellula e trasferimento al tubo da centrifuga da 50 ml contenente i mezzi di riaggregazione e risciacquare una volta con PBS.
   6. Risciacquare l'intera piastra con 5 ml di PBS e trasferimento stesso tubo 50 ml contenente le cellule.
   7. Agglomerare le cellule a 300 xg per 5 min a temperatura ambiente.
   8. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 1 ml di NBS dei media, poi il trasferimento in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga.
   9. Pellet a 300 xg per 5 min a temperatura ambiente e rimuovere il surnatante. Le cellule cardiache (cellule CD90 ⁺ stromali e SIRPα ⁺ myocYtes) sono ora pronti per la costruzione dei tessuti.
3. (Opzionale) raccogliere le cellule supplementari di interesse
   Nota: Oltre ai tessuti definiti contenente esclusivamente SIRPα ⁺ cardiomiociti e fibroblasti-like CD90 ^+, è possibile aggiungere celle aggiuntive di interesse per interrogare loro effetto sulla funzione del tessuto. Per esempio hanno dimostrato MSC di ratto per migliorare la funzione di ratto ingegnerizzato tessuto cardiaco ^1. Il seguente passaggio facoltativo descrive la raccolta di cellule supplementari per il sistema definito.
   1. Raccogliere il tipo di cellula supplementare di interesse (ad esempio, le cellule staminali mesenchimali) con 0,25% tripsina / EDTA 0,1%.
   2. Agglomerare le cellule a 300 xg per 5 min a temperatura ambiente poi risospendere in 5 ml di appropriati mezzi di coltura cellulare per il tipo cellulare di interesse. Ad esempio per MSC, utilizzare DMEM integrato con 20% siero fetale bovino, 1% di penicillina-streptomicina e 0,2% anfotericina-B alla cultura cells.
   3. Eseguire una conta di cellule utilizzando un emocitometro, poi pellet di nuovo le cellule a 300 xg per 5 min a temperatura ambiente.
   4. Rimuovere il surnatante, risospendere in 1 ml di mezzi di coltura cellulare e trasferire in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga.
   5. Agglomerare le cellule a 300 xg per 5 min a temperatura ambiente.
   6. Rimuovere il surnatante. Le cellule supplementari sono ora pronti per la costruzione dei tessuti.
      Nota: se le cellule supplementari vengono aggiunti ad una concentrazione del 10% del numero totale di cellule nel tessuto, poi per i tessuti definiti, ciò richiederà 50.000 cellule supplementari per tessuti come ogni tessuto contiene 500.000 cellule cardiache (sia cellule stromali CD90 ⁺ e miociti SIRPα ^+).
4. Creare le umane Engineered cardiache tessuti
   Nota: Conservare tutte le soluzioni su ghiaccio e le celle a temperatura ambiente. Tutti i volumi elencati di seguito si intendono per tessuti. Tipicamente, circa sei tessuti possono essere costruiti da due 6-ben plAtes di differenziazioni cardiaci.
   1. Diluire 60,0 ml di 5 mg / ml di collagene stock da 3,125 mg / ml con 1,5 ml di 1 M NaOH, 9,6 microlitri di PBS 10x e 24,9 microlitri di acqua sterile deionizzata ultrapura.
      passaggio fondamentale: evitare l'introduzione di bolle d'aria per ogni soluzione durante la preparazione come bolle d'aria interferiscono con la formazione di tessuto corretta.
   2. Aggiungere 12,0 ml di MEM sia 10x e 0,2 N HEPES pH 9 alla miscela collagene diluita per creare il mix collagene. Aggiungere entrambe le soluzioni lungo la parete della provetta 15 ml centrifuga al fine di evitare l'introduzione di bolle d'aria nella miscela di collagene.
   3. Aggiungere la matrice membrana basale ad una concentrazione finale di 0,9 mg / ml alla miscela di collagene e memorizzare sul ghiaccio per creare il mix tessuto finale. La concentrazione finale di collagene dovrebbe essere di 2 mg / ml.
   4. Aggiungere 500.000 delle cellule reaggregated al mix di tessuto (miociti + concentrazione dei fibroblasti è di 20 milioni / ml) e riempire ad un volume finale di 25 pl peril tessuto sia con mezzi NBS cell-free o 50.000 cellule del tipo di cellula supplementare di interesse (ad esempio, hMSCs) e mescolare bene per formare una sospensione di cellule ancora.
      Nota: Il numero di cellule integrati varierà da per diverse applicazioni. Qui il 10% supplementazione viene utilizzato.
   5. Con cura, pipetta 25 microlitri della sospensione cellulare in ciascuna delle sei pozzetti della piastra di base bioreattore, senza introdurre bolle d'aria nel pozzo.
   6. Premere due file di sensori di forza PDMS su entrambi i lati del telaio polisulfone, formando 6 coppie di perni contrapposti, poi invertire la cornice in cima alla piastra di base in modo che una coppia di montanti entra ciascun pozzetto contenente la sospensione cellulare.
      Nota: Il telaio polisulfone include schede per aiutare nella allineamento delle PDMS.
   7. posizionare con cura il bioreattore, piastra di base verso il basso, in un piatto 60 mm, quindi inserire il piatto senza la sua copertina di un piatto 10 cm e posizionare il coperchio 10 centimetri sulla parte superiore, e spostare l'intero gruppo bioreattore aalla cultura incubatore tessuti, aspettare due ore per il tessuto di gel.
   8. Dopo 2 ore, togliere il bioreattore dal termostato e aggiungere 14 ml di NBS media per l'intero gruppo, sufficienti a coprire la piastra di base. Rientro in incubatrice, e cambiare la metà dei media ogni giorno.
   9. Quarantotto ore dopo, rimuovere con attenzione la piastra di base, spostando leggermente entrambi i lati della piastra di base dal telaio di qualche millimetro alla volta, cambiare i mezzi di comunicazione, per poi tornare il bioreattore, tessuti rivolto verso il basso, ai media.
   10. Continuare a cambiare la metà dei terreni di coltura NBS ogni giorno.
       Nota: le contrazioni spontanee del tessuto può essere osservato a partire da 3 giorni dopo la costruzione dei tessuti, generando forze di contrazione misurabili fin dal giorno 5 a 7.

Risultati

Per ottenere miociti cardiaci, una versione leggermente modificata dei metodi di differenziazione Boheler e Lian viene utilizzata ^30,31. È indispensabile che la differenziazione inizia durante il log-fase di crescita delle cellule, ma anche che la popolazione di partenza è sufficientemente confluenti di ottenere un numero utilizzabile di celle dopo ordinamento (circa il 75% è ottimale). Tipicamente, per H7 hESCs, placcatura con una densità di 140.000 hESC per pozzetto di un piatto 6 pozzetti in essenziali...

Discussione

Costruzione di tessuti umani ingegnerizzati definiti cardiaci (hect) in grado di fornire un modello più coerente e affidabile della funzione dei miociti cardiaci umana. Criticamente, tutti componenti cellulari ed extracellulari nel sistema sono noti e possono essere manipolati come desiderato, eliminando così l'influenza confondenti di altri tipi di cellule sconosciuti risultanti dal processo di differenziazione. Per bilanciare la crescita cellulare rapida e ad alto rendimento, è preferibile che la differenziazio...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell Culture	Company	Catalog Number	Comments
Amphotericin B	Sigma-Aldrich	A2411	Prepare a 2.5 mg/ml stock in DMSO and filter-sterilize
B27 with Insulin	Life Technologies	17505055
B27 without Insulin	Life Technologies	A1895601
CHIR99021	Stemgent	04-0004	Create 6 μM stock, then aliquot and store at -20 °C.
Essential 8 Media	Life Technologies	A1517001
H7 Human Embryonic Stem Cells	WiCell	WA07
hESC Qualified Matrix, Corning Matrigel	Corning	354277	Thaw on ice at 4 °C overnight then aliquot 150 μl into separate tubes and store at -20 °C.
IWR-1	Sigma-Aldrich	I0161	Create 10 mM stock and aliquot. Store at -20 °C
Neonatal Calf Serum	Life Technologies	16010159
Non-enzymatic Dissociation Reagent: Gentle Cell Dissociation Reagent	Stem Cell Technologies	7174
Penicillin-Streptomycin	Corning	30-002-CI
RPMI 1640	Life Technologies	11875-093	Keep refrigerated
Y-27632 (ROCK Inhibitor)	Stemgent	04-0012	Resuspend to a 10 mM stock concentration, aliquot and store at -20 °C. Avoid freeze thaw cycles.
Cell Sorting	Company	Catalog Number	Comments
4’,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI)	Life Technologies	D1306
CD90-FITC	BioLegend	328107
Enzymatic Dissociation Reagent: Cell Detach Kit I (0.04 % Trypsin/ 0.03% EDTA, Trypsin neutralization solution and Hanks Buffered Salt Solution)	PromoCell	C-41200
Fetal Bovine Serum	Atlanta Biologics	S11250
SIRPα-PE/Cy7	BioLegend	323807
Tissue Construction	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin/0.1% EDTA	Fisher Scientific	25-053-CI	Optional: For collection of supplemental cells of interest
10x MEM	Sigma-Aldrich	M0275-100ML
10x PBS Packets	Sigma-Aldrich	P3813
Collagen, Bovine Type I	Life Technologies	A10644-01	Keep on ice
DMEM/F12	Life Technologies	11330057
Dulbecco’s Modified Eagles Medium (DMEM), High Glucose	Sigma-Aldrich	D5648
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Dow Corning	Sylgard 184
Sodium HEPES	Sigma-Aldrich	H3784
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich	221465
Materials	Company	Catalog Number	Comments
1.5 ml microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	NC0536757
15 ml polyproylene centrifuge tube	Corning	352096
5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube	Corning	352235	With integrated 35 μm cell strainer
50 ml polyproylene centrifuge tube	Corning	352070
6-well flat bottom tissue-culture treated plate	Corning	353046
Cell Scraper, Disposable	Biologix	70-2180
Polysulfone	McMaster-Carr
Polytetrafluoroethylene (Teflon)	McMaster-Carr
Equipment	Company	Catalog Number	Comments
Dissecting Microscope	Olympus	SZ-61	Or similar, must have a mount for the high speed camera to attach
Electrical Pacing System	Astro-Med, Inc	Grass S88X Stimulator
High Speed Camera	Pixelink	PL-B741U	Or similar, but must be capable of 100 frames per second for accurate data acquisition
Plate Temperature Control			Used to maintain media temperature during data acqusition.
Custom Materials	Company	Catalog Number	Comments
LabView Post-tracking Program			available upon request from the authors