Preparazione facile di Internamente auto-assemblato Lipid particelle stabilizzati da nanotubi di carbonio

Riepilogo

We report on a smart application of carbon nanotubes for kinetic stabilization of lipid particles that contain self-assembled nanostructures in their cores. The preparation of lipid particles requires rather low concentrations of carbon nanotubes permitting their use in biomedical applications such as drug delivery.

Abstract

Vi presentiamo un metodo facile per preparare particelle lipidiche nanostrutturati stabilizzati con nanotubi di carbonio (CNT). A parete singola (incontaminato) e multi-pareti (funzionalizzati) CNT sono utilizzati come stabilizzatori per la produzione di emulsioni (O / W) olio-in-acqua di tipo Pickering. I lipidi cioè, Dimodan U e Phytantriol sono usati come emulsionanti, che in acqua in eccesso di auto-assemblano in fase Pn3m cubica bicontinuous. Questa fase altamente viscoso è frammentato in particelle più piccole che utilizzano un ultrasonicatore sonda in presenza di stabilizzanti tensioattivi convenzionali o CNT come fatto qui. Inizialmente, i nanotubi di carbonio (polvere) vengono dispersi in acqua seguita da un'ulteriore ultrasuoni con il lipide fuso per formare l'emulsione finale. Durante questo processo, i nanotubi di carbonio vengono rivestiti con molecole lipidiche, che a loro volta si presume circondare le goccioline lipidiche a formare un'emulsione particellare che è stabile per mesi. La dimensione media delle particelle lipidiche nanostrutturati CNT-stabilizzati è in submicron range, che regge bene il confronto con le particelle stabilizzata con tensioattivi convenzionali. Piccola dati angolo di raggi X dispersione conferma il mantenimento della fase cubica originale Pn3m nelle dispersioni lipidi CNT-stabilizzati rispetto alla fase lipidica puro (stato bulk). spostamento Blu e abbassamento delle intensità di G caratteristico e bande di CNT osservati in spettroscopia Raman G 'caratterizzano l'interazione tra CNT superficie e lipidi molecole. Questi risultati suggeriscono che le interazioni tra i CNT e lipidi sono responsabili per la loro stabilizzazione reciproca in soluzioni acquose. Poiché le concentrazioni di CNT impiegate per la stabilizzazione sono molto bassi e molecole lipidiche sono in grado di funzionalizzare i nanotubi di carbonio, la tossicità dei CNT dovrebbe essere insignificante mentre la loro biocompatibilità è notevolmente migliorata. Pertanto la presente approccio trova un grande potenziale in varie applicazioni biomediche, per esempio, per sviluppare sistemi nanocarrier ibridi per la consegna di multiple molecole funzionali come in terapia di combinazione o politerapia.

Introduzione

Nel corso degli ultimi decenni, la nanotecnologia è emerso come un potente strumento in particolare nel campo dello sviluppo preclinico della medicina per combattere le malattie noti come il cancro ^1. In questo contesto, le strutture in nanoscala con dimensioni <1.000 nm sono ampiamente esplorato come veicolo di consegna di varie biomolecole attive come la droga, proteine, acidi nucleici, i geni e gli agenti di diagnostica per immagini ^1-4. Queste biomolecole o sono incapsulati all'interno delle nanoparticelle o coniugati sulla superficie delle nanoparticelle e sono rilasciati al sito di azione trigger come pH o ^5,6 temperatura. Anche se estremamente piccole dimensioni, l'ampia superficie di queste nanoparticelle si rivela notevolmente vantaggioso per somministrazione mirata di biomolecole attive. Il controllo della dimensione delle particelle e la biocompatibilità è della massima importanza al fine di ottimizzare l'efficacia terapeutica e quindi l'applicabilità delle nanoparticelle ^7,8.Lipidi ^9-13, polimeri, metalli ^{14,15 16,17} e ^18,19 nanotubi di carbonio sono comunemente impiegati come nanovettori per varie applicazioni biomediche e farmaceutiche.

Inoltre, le applicazioni nanocarrier basate su nanostrutture auto-assemblate lipidi hanno una grande importanza in molte altre discipline, tra cui industrie alimentari e cosmetiche ^20,21. Per esempio, sono usati in proteine ​​di cristallizzazione ^22, la separazione di biomolecole ^23, come stabilizzanti alimentari esempio, in dolci ^24, e nella fornitura di molecole attive come nutrienti, aromi e profumi ^25-31. Autoassemblati nanostrutture lipidi non solo hanno la capacità di rilasciare molecole bioattive in modo controllato e mirato ^32-38 ma sono anche in grado di proteggere le molecole funzionali dalla chimica ed enzimatica degradazione ^39,40. Anche se planare doppio strato fluido è la più commsulla nanostruttura formata da molecole lipidiche anfifiliche in presenza di acqua, altre strutture quali esagonale e cubico sono anche comunemente osservati ^20,41,42. Il tipo di nanostruttura formata dipende struttura forma molecolare lipidi ', la composizione lipidica in acqua, nonché dalle condizioni fisico-chimiche impiegate come temperatura e pressione ^43. L'applicabilità di nanostrutture lipidi non planari soprattutto quella di fasi cubiche, è limitato a causa della loro elevata viscosità e consistenza dominio non omogenea. Questi problemi vengono superati disperdendo le nanostrutture lipidi in grande quantità di acqua per formare emulsioni contenenti micron o particelle micronizzate lipidi olio-in-acqua (O / W). In questo modo, un prodotto adatto a bassa viscosità può essere preparato mantenendo la struttura auto-assemblati lipidico originale all'interno delle particelle disperse. La formazione di queste particelle internamente autoassemblati (abbreviato come ISAsomes ⁴⁴ > Eg, cubosomes da fasi cubiche e hexosomes da fasi esagonali) richiede generalmente una combinazione di una fase di ingresso ad alta energia e l'aggiunta di stabilizzanti quali tensioattivi o polimeri. Recenti ricerche in questa direzione dimostra l'applicazione di varie particelle solide ⁴⁵ compresi nanoparticelle di silice ^46, argilla ^47-49 e nanotubi di carbonio ^{50 per la} stabilizzazione delle emulsioni suddetti, opportunamente definito come Pickering ^{51 o} emulsioni Ramsden-Pickering ^52.

Negli ultimi anni, a base di carbonio nanostrutture, come i nanotubi di carbonio a parete singola (SWCNTs), nanotubi a parete multipla carbonio (MWCNT) e fullereni hanno ricevuto una grande attenzione come nuovi biomateriali ^53,54. Le preoccupazioni principali sono la loro tossicità ^55-58, insolubilità in acqua ⁵⁹ e quindi la loro biocompatibilità ^56. Un modo efficace per affrontare questi problemi è la funzione di superficielizzazione utilizzando molecole non tossici e biocompatibili come lipidi. In presenza di acqua, lipidi interagiscono con CNT in modo che la superficie idrofobica del CNT è schermata dalla parte acquosa polare che i gruppi di testa idrofili lipidici aiuto loro solubilità o dispersione in acqua ^60,61. I lipidi sono componenti integranti organelli cellulari così come alcuni materiali alimentari, quindi la loro decorazione dovrebbe idealmente diminuire la tossicità in vivo di CNT. Applicazioni biomediche basate su nanotubi di carbonio in modo indipendente ^18,19 e nanostrutture lipidi ^9-13 sono in fase di sviluppo estensivo ma le applicazioni che combinano le proprietà dei due non sono ancora ben esplorati-.

In questo lavoro, ci avvaliamo di due diversi tipi di lipidi e tre tipi di nanotubi di carbonio, di cui SWCNTs sono nella forma originaria, mentre MWCNT vengono funzionalizzati con idrossile e gruppi carbossilici. Abbiamo usato concentrazioni molto basse di CNT per preparare le dispersioni cuistabilità dipende da diversi fattori ad esempio, il tipo di lipidi, tipo di CNT, rapporto di lipidi per CNT utilizzato, nonché sui parametri sonicazione impiegate come potenza e durata. Questo protocollo video fornisce dettagli tecnici di un metodo di stabilizzazione cineticamente nanoparticelle lipidiche utilizzando vari CNT-stabilizzatori.

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Protocollo

Attenzione: CNT utilizzati in questo lavoro sono sotto forma di nanoparticelle che possono avere rischi aggiuntivi rispetto ai loro omologhi di massa. L'inalazione di grafite, sia naturali che sintetici, può causare pneumoconiosi ⁶² simile a pneumoconiosi dei lavoratori del carbone. Inoltre, vi sono preoccupazioni relative alla tossicità di nanostrutture a base di carbonio e alcuni dei precedenti studi suggeriscono tossicità acuta e cronica associata con l'inalazione di CNT ^63-68. Quindi, evitare l'inalazione di polvere fine CNT e gestire con grande cura. Se inalato, portare all'aria aperta. Se la respirazione è difficile, utilizzare l'ossigeno puro al posto e cercare di consultazione medica. formulazioni in soluzione / dispersione dei CNT sono piuttosto sicuro da maneggiare.

Attenzione: I lipidi e tensioattivi utilizzati in questo studio sono materiali per alimenti, e quindi non pericolosi in generale, ma sono irritanti per gli occhi e la pelle, e anche altamente infiammabile. Quindi, si prega di utilizzare tutte le pratiche di sicurezza adeguate, come l'uso di itcontrolli gineering (cappa) e dispositivi di protezione individuale (occhiali, guanti, camice da laboratorio, pantaloni a figura intera, scarpe chiuse), durante la manipolazione o la preparazione dei campioni di nanoparticelle. In caso di contatto con la pelle o con gli occhi, lavare immediatamente la pelle o con gli occhi con abbondante acqua per almeno 15 minuti. Consultare un medico se necessario.

1. Preparazione di lipidi / massa d'acqua Fasi

Attenzione: Conservare i lipidi in frigorifero a 4 ° C. lipidi Pure grado devono essere conservati in congelatore (-20 ° C). li aliquota in piccole fiale di vetro per evitare la contaminazione di tutto il magazzino e la comodità di gestione. Altri prodotti chimici tra CNT e tensioattivi possono essere conservati a temperatura ambiente, ma tenerli lontano dalla luce diretta del sole.

1. Mantenere lipidi, cioè, Dimodan U (DU) e Phytantriol (PT) a temperatura ambiente per 15-20 minuti prima di aprire il coperchio della bottiglia / flacone per evitare la formazione di condensa.
   (Nota: DU è un gliceridi distillato composto da 96% monogliceridi e laresto sono digliceridi e acidi grassi liberi. Due componenti principali di monogliceridi a DU sono linoleate (62%) e oleato (25%). Da qui la parte idrofoba di DU contiene principalmente catene di C18 (91%), l'esatta composizione delle quali è il seguente; C18: 2 (61,9%), C18: 1 (24,9%), e C18: 0 (4,2%), dove C18 indica 18C-catena e il numero dopo i due punti indica il numero di legami C = C. PT è una miscela di isomeri ottici 3,7,11,15-tetrametil-1,2,3-hexadecanetriol. Esso non contiene un gruppo funzionale di estere, ma si compone di coda phytanyl molto ramificato con un headgroup tri-idrossi. Entrambi DU e PT formano fasi cubiche in presenza di acqua in eccesso, che è anche il caso per i nuclei di particelle lipidiche stabilizzati ^{13, 45).}
2. Sciogliere i lipidi mettendo fiale in un bagno di acqua calda o acqua bicchiere contenente mantenuto al di sopra di 60 ° C (riscaldamento agitatore magnetico: 230 V, 50 Hz, 630 W o simili da essere usato per riscaldare l'acqua in un becher).
3. In alternativa fiale di calore con generatori di calore collettivi. Non riscaldare il lipide contenente flaconi direttamente sulla piastra calda per evitare gradiente di temperatura e successiva decomposizione dei lipidi.
4. Pesare 500 mg di lipide fuso, in provetta precedentemente pesato (con tappo a scatto conica, 1,5 ml), con una pipetta Pasteur di vetro con un bulbo in lattice.
5. Aggiungere 500 ml di acqua ultrapura (acqua resistività = 18,2 MW · cm) alla provetta sopra.
6. Miscelare i componenti manualmente per 15 minuti con piccolo (su misura) spatola. Fare una tale spatola appiattendo la punta di un ago della siringa (0,9 mm x 40 millimetri di lunghezza cannula) utilizzando una pinza.
7. Centrifugare la miscela di lipidi / acqua per 10 minuti ad una velocità di 2.000 x g. Ancora mescolare manualmente per 10 min, quindi equilibrare per 24 ore. Prima che caratterizza gli esempi, agitare per 5 minuti e poi lasciare a RT.
8. Per garantire la formazione di una fase di equilibrio lipidico durante l'intero tubo, effettuare circa 10 cicli di gelo-disgelo e inte rmittently effettuare una fase di centrifugazione come sopra definito. Sia la forma altamente viscosi fasi lipidiche bulk DU e PT rendendo difficile gestire manualmente (Figura 1).
   Nota: il protocollo di cui sopra (sezione 1) è necessaria solo se si vorrebbe confrontare il comportamento nanostrutturale (tipo reticolare e le dimensioni di auto-assemblaggio) di particelle disperse con la fase lipidica sfuso e / o usarlo come un controllo per confermare la mantenimento di nanostruttura originale.

Figura 1. Preparazione di O / W emulsione particolato con consistenza fluida dalla fase lipidica altamente viscosi utilizzando il metodo di alta energia (ultrasuoni) e utilizzando diversi CNT-stabilizzanti, vale a dire SWCNT, MWCNT-OH, MWCNT-COOH (figura riprodotto da riferimento [50] con il permesso della Royal Society of Chemistry)._upload / 53489 / 53489fig1large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

2. Preparazione di tensioattivi stabilizzata lipidi Particelle

1. Preparare un 0,2% (w / w) tensioattivo (F127 Pluronic) in acqua.
   1. Sciogliere 200 mg di tensioattivo (bianco soffice polvere) in 100 ml di acqua ultrapura per agitazione per 20-30 min (su una piastra magnetica utilizzando una barra agitatore magnetico). F127 Pluronic è un tensioattivo non ionico ed è comunemente utilizzato per stabilizzare emulsioni. Si tratta di un copolimero a tre blocchi di PEO ₉₉ -PPO ₆₇ -PEO _99, e, quindi, richiede molto tempo per sciogliere in acqua.
2. Aggiungere 500 mg di DU fuso o PT (utilizzando una pipetta Pasteur di vetro) ad un flacone di vetro (scintillazione sodico-calcico dotato di un foglio di tappo urea foderato, 20 ml).
3. Aggiungere 9,5 g della soluzione F127 0,2%.
4. Sulla macchina ultrasuoni della sonda, strettamente morsetto la fiala per la storta stare mascella (Storta Montaggio Stand conbasamento, morsetto, base, stelo, in gomma 3 mascella e Morsetto doppio), in modo che possa sopportare le vibrazioni generate mediante sonicazione.
5. Inserire la sonda lega di titanio solido 13 mm (lunghezza del diametro x 139 mm) attaccato alla cella di sonicatore. Regolare l'altezza e la posizione del flacone per garantire che i suoi lati e sul fondo non toccano alla sonda. Una distanza di 0,5 cm tra la punta della sonda e il fondo del flacone di vetro dà buoni risultati.
6. Sonicare la miscela per 10 minuti in un modo pulsato con impulsi 1 sec mediata da 1 sec tempo di ritardo al 35% (del massimo). La fiala diventa molto caldo a causa del calore generato durante sonicazione. Pertanto, lasciarlo raffreddare fino a RT, mette fuori il morsetto.
7. Conservare la dispersione lattiginosa formata a temperatura ambiente per almeno 24 ore, prima di riutilizzare. Questo per garantire la stabilità contro la separazione di fase.
   Nota: prima e dopo l'utilizzo della sonda, pulirla con acetone, asciugare con un tovagliolo di carta, poi sciacquare con acqua ultrapura und asciugare una volta di più.

3. Preparazione di dispersioni di CNT Pure in acqua

1. In due bicchieri separati, pesare in 4 mg polvere MWCNT-OH e MWCNT-COOH, che sono entrambi di colore nero.
2. Aggiungere 500 ml di acqua ultrapura per ogni bicchiere. Utilizzando una sonda ultrasonicatore Sonicare miscela per 2 minuti in una modalità impulso continuo a 40% (del massimo). La conseguente concentrazione della dispersione MWCNT è di 8 mg / ml (soluzione madre).
3. Diluire la soluzione madre MWCNT con adeguate quantità di acqua ultrapura per raggiungere 6,25, 5, 4, 2 mg / ml dispersioni MWCNT.
4. Sonicare queste dispersioni come descritto in precedenza (vedi 3.2).
5. Allo stesso modo, disperdere 3 mg di SWCNT in polvere (anche di colore nero) in 500 ml di acqua ultrapura per fare un / dispersione SWCNT ml 6 mg (soluzione).
6. Diluire la soluzione SWCNT magazzino e sonicare loro come descritto in precedenza (vedi 3.2) per ottenere 0.5, 0.4, 0,3125, 0,2 mg / ml Vernice SWCNTrsions.
   Nota: Tutte le dispersioni sono chiari per circa 30 minuti, dopo di che i nanotubi di carbonio cominciano a depositarsi sul fondo.

4. Preparazione di CNT-stabilizzato nanostrutturati Lipid Particles (Figura 1)

1. Pesare in 500 mg del fuso DU in una fiala di vetro.
2. Aggiungere 9,5 ml di 6 mg / ml SWCNT dispersione al flaconcino.
3. Sonicare la miscela CNT-DU utilizzando gli stessi parametri usati per la fabbricazione dispersioni CNT puri (vedi 3.2). Al raffreddamento a RT, le particelle lipidiche CNT-stabilizzato con conservato nanostruttura internamente auto-assemblati saranno pronti.
4. In modo simile, preparare le particelle lipidiche utilizzando le dispersioni SWCNT 0,4 mg / ml e 0,2 mg / ml.
5. Seguire i protocolli da 4.1 a 4.4 per rendere le particelle lipidiche utilizzando MWCNT-OH e MWCNT-COOH ma con concentrazioni diverse, vale a dire 8, 4 e 2 mg / ml di CNT.
6. Allo stesso modo, preparare tre diversi dispersioni CNT-PT con 4 mg / ml MWCNT-OH e MWCNT-COOH E 0,4 ug / ml SWCNT. Si noti che le dispersioni CNT-PT richiedono meno potenza (35% del massimo) ma il tempo più lungo (15 min) in una modalità impulso continuo. Raffreddare le dispersioni di RT e lasciarli per 24 ore prima che li caratterizza.
   Nota: i parametri sonicazione possono essere diverse per i diversi lipidi (come per DU e PT qui) e per le diverse composizioni; hanno bisogno di essere ottimizzato per ottenere dispersioni ben stabilizzati-.

5. Controllo della Stabilità del lipide Dispersioni CNT-stabilizzati

1. Monitorare la stabilità delle dispersioni mediante osservazione visiva: controllare se le dispersioni vengono destabilizzate o grumi sono formati nelle dispersioni.
2. Scatta foto (con la macchina fotografica digitale) ad intervalli regolari. Per esempio, fotografare dispersioni ogni giorno nella prima settimana, poi ogni altro giorno per una settimana seguita da una volta a settimana per le prossime due settimane, e infine una volta al mese secondo il requisito.

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Risultati

I seguenti risultati rappresentano a) la stabilità di dispersioni, b) la distribuzione delle dimensioni delle particelle lipidiche, c) il tipo di auto-assemblaggio e d) la prova per il rivestimento lipidico del CNT. La stabilità delle dispersioni (figura 2) è stato monitorato utilizzando una fotocamera da 5 MP con auto-focus e flash LED.

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Discussione

Stabilizzazione delle particelle lipidiche
Tre differenti CNT vengono utilizzati per stabilizzare le dispersioni lipidi; due dei quali sono multi-murata e funzionalizzati con -OH e gruppi -COOH, e uno è unico murato e non funzionalizzati (incontaminata). Il CNT variato in formato come segue (diametro x lunghezza): MWCNT-COOH: 9.5 nm x 1,5 micron; MWCNT-OH: 8-15 nm x 50 micron; SWCNT: 1-2 nm x 1-3 micron. I nanotubi di carbonio in polvere sono stati dispersi in acqua dalla sonda ultra-sonicazione...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dimodan U	Danisco	15312	Store at 4 °C. Non-hazardous. Irritant to eyes and skin.
Phytantriol (> 95%, GC)	TCI Europe N.V.	P1674	Store at 4 °C. Non-hazardous. Irritant to eyes and skin.
Single walled Carbon Nanotubes (90%)	Nanostructured & Amorphous Materials, Inc.	1246YJS	Store at room temperature. Away from direct light. Irritating to eyes, skin and respiratory system.
Multi-walled carboxylic acid functionalized Carbon Nanotubes (> 80% Caron basis, > 8% carboxylic acid functionalized)	Sigma-Aldrich Co. LLC	755125	Store at room temperature. Away from direct light. Causes serious eye irritation. May cause respiratory irritation.
Graphitized Multi-walled hydroxy functionalized Carbon Nanotubes (99.9%)	Nanostructured & Amorphous Materials, Inc. (NanoAmor)	1224YJF	Store at room temperature. Away from direct light. Irritating to eyes, skin and respiratory system.
Pluronic F127	Sigma-Aldrich Co. LLC	P2443	BioReagent, suitable for cell culture. Not a hazardous substance or mixture. Store at room temperature.
Acetone (99.5%)	Fisher Scientific	10134100	Highly flammable liquid. Causes serious eye irritation. May cause drowsiness or dizziness.
Jars with loose, enfolding lids (375 ml)	VWR International Ltd	216-3308
Beaker, 1,000 ml	Fisher Scientific	12942161	heavy duty, low form, with spout and graduations
Pasteur glass pipette (150 mm length) with latex bulb	Fisher Scientific	10006021
Microcentrifuge tube conical snap cap 1.5 ml	Fisher Scientific	11558232
Spatula	Fisher Scientific	11352204
Heating magnetic stirrer	Fisher Scientific	11715704
Magnetic stirrer bars (cylindrical, opaque PTFE, 30 mm x 7 mm (l x diameter))	Fisher Scientific	10011792
Needle (0.9 mm x 40 mm cannula length)	Terumo UK Ltd	MN-2038MQ
Retort Stand Set - With stand, clamp, base, rod, rubber 3 jaw and bosshead	Camlab Ltd, UK	1177157
Millipore water equipment	Barnstead Nanopure, Thermoscientific, USA
Progen Genfuge 24D Digital Microcentrifuge	Progen Scientific	C-2400
Probe ultra-sonicator, with 13 mm	SONICS, Vibracell,  USA
5 MP camera with auto-focus and LED flash	Samsung Galaxy Fame Mobile camera
Raman Spectrometer	Horiba Jobin-Yvon LabRAM HR800 spectrometer
Mastersizer 3000	Malvern Instruments Ltd, Malvern, United Kingdom
Small angle X-ray scattering (SAXS)	SAXSpace camera (Anton Paar, Graz, Austria), X-ray generating equipment (ISO-DEBYEFLEX3003, GE Inspection Technologies GmbH), closed water circuit (Chilly 35, HYFRA, Germany).