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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Here, we present a protocol to construct a three-dimensional in vitro model of the lining of the peritoneal cavity, composed of primary human mesothelial cells and fibroblasts layered with extracellular matrix, as a tool to investigate ovarian cancer cell adhesion, invasion, and proliferation.

Abstract

The pattern of ovarian cancer metastasis is markedly different from that of most other epithelial tumors, because it rarely spreads hematogenously. Instead, ovarian cancer cells exfoliated from the primary tumor are carried by peritoneal fluid to metastatic sites within the peritoneal cavity. These sites, most notably the abdominal peritoneum and omentum, are organs covered by a mesothelium-lined surface. To investigate the processes of ovarian cancer dissemination, we assembled a complex three-dimensional culture system that reconstructs the lining of the peritoneal cavity in vitro. Primary human fibroblasts and mesothelial cells were isolated from human omentum. The fibroblasts were then mixed with extracellular matrix and covered with a layer of the primary human mesothelial cells to mimic the peritoneal and omental surfaces encountered by metastasizing ovarian cancer cells. The resulting organotypic model is, as shown, used to examine the early steps of ovarian cancer dissemination, including cancer cell adhesion, invasion, and proliferation. This model has been used in a number of studies to investigate the role of the microenvironment (cellular and acellular) in early ovarian cancer dissemination. It has also been successfully adapted to high throughput screening and used to identify and test inhibitors of ovarian cancer metastasis.

Introduzione

Ovarian cancer is the deadliest gynecologic malignancy1. The majority of patients are diagnosed after the cancer has disseminated throughout the peritoneal cavity. Once the cancer has spread throughout the peritoneal cavity, cytoreductive surgery and chemotherapy are often not sufficient treatment to prevent cancer recurrence and chemoresistance, resulting in a less than 30% 5-year survival rate. Ovarian cancer metastasis is predominantly limited to the peritoneal cavity, and several other cancer types, including gastric, pancreatic, and colon cancers, metastasize to the same anatomic sites in the peritoneal cavity. In general, ovarian cancer cells detach from the in situ carcinoma in the fallopian tube or the primary ovarian tumor, travel in peritoneal fluid as single cells or spheroids, and attach to mesothelium-lined surfaces of the omentum, bowel, and abdominal wall2.

The tumor microenvironment plays an important role in disease progression and chemoresistance in many cancers3-6. The peritoneal cavity is a unique microenvironment, with a mesothelial cell monolayer covering the majority of surfaces (Figure 1A)7. The mesothelial lining acts as a barrier that creates a low-friction surface, which tends to be protective against cancer cell adhesion8. Immediately underneath this mesothelial-lined surface is a layer made predominantly of fibroblasts and extracellular matrix (ECM), which promote cancer cell adhesion and invasion8. Ovarian cancer cells secrete factors that induce changes in the mesothelial cell lining that enhance ovarian cancer cell adhesion, invasion, and metastasis9,10. Ovarian cancer cells adhere to the mesothelial surface via integrin and CD44-mediated mechanisms (Figure 1B)11-16.

Historically, several 3D models have been developed to investigate ovarian cancer interactions with the microenvironment. Some of the first models studied ovarian cancer-ECM interface17-21, ovarian cancer-mesothelial cell communication13,14,21-24, or both25 (reviewed by us 26). Niedbala et al. discovered that ovarian cancer cells display a quicker and firmer adhesion to ECM than to mesothelial cells or to plastic alone25. However, these models did not histologically resemble the peritoneal microenvironment. Therefore, we established a 3D organotypic model to more thoroughly replicate the ovarian cancer microenvironment. In order to better understand the role of the microenvironment and the interaction between cancer and peritoneal cells in the peritoneal dissemination of ovarian cancer, we have developed a 3D organotypic in vitro culture model of the peritoneal cavity lining (schematic in Figure 1C). The proposed model is composed of primary human fibroblasts and ECM, covered with a layer of primary human mesothelial cells-each cell type is isolated from human omentum. Histologically, this model resembles the normal peritoneal or omental lining, and provides a surface on which we can study the tumor microenvironment, the interaction between cancer cells and normal tissue, and the processes of cancer cell adhesion, invasion, and proliferation8.

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Protocollo

Tutti i protocolli di ricerca descritti sono stati esaminati dalla University of Chicago Institutional Review Board (IRB). Il consenso informato è stato ottenuto da ogni paziente prima dell'intervento chirurgico e lo studio è stato approvato dalla University of Chicago IRB. Un tipo cappa di sicurezza biologica 2 e guanti devono essere utilizzate per la manipolazione dei tessuti umani per la protezione e per ridurre il rischio di contaminazione delle cellule.

1. Isolamento e la coltura di cellule stromali primarie non trasformati

  1. Collezione tessuti umani e di preparazione.
    1. Ottenere esemplari di omento umana, 2 cm 3, rimossi durante un intervento chirurgico addominale, e immergere subito tessuto RT tampone fosfato salino (PBS) (Figura 2A). Un pezzo di omento 3 cm x 2 cm produce tipicamente 1 milione di cellule primarie umane mesoteliali (HPMC) e 200.000 fibroblasti umani primari o fibroblasti omentali normali (NOF).
    2. Centrifugare il PBS il tessuto è stato immerso in a 0,5 xg per 3min più presto possibile dopo la raccolta (<2 ore in PBS) e trasferire il tessuto fresco 20 ml PBS in una provetta conica da 50 ml. Tagliare il tessuto in 5mm 3 pezzi da tritare con bisturi in un diametro di 15 centimetri, piatto di coltura sterile (Figura 2B).
  2. Primaria mesothelial umano isolamento delle cellule 8
    1. Per isolare HPMC, trasferire il tessuto tritato in 50 ml provette coniche e attendere 1 minuto per i pezzi solidi di galleggiare verso l'alto (Figura 2C & S). HPMC e globuli rossi (RBC) saranno presenti nel liquido sul fondo. Utilizzare una pipetta per rimuovere il liquido dal fondo della provetta e in un nuovo tubo conico. Spin il liquido verso il basso a 0,5 xg per 3 min e aspirare il surnatante dal pellet HPMC / RBC.
      1. Ripetere il processo per tre volte: aggiungere 20 ml di PBS al tessuto tritato, permettono il tessuto a salire, rimuovere il liquido dal basso con una pipetta e nella provetta HPMC / RBC, spin down, e rimuovere ilsurnatante. Dopo che tutti i giri sono stati completati e il surnatante viene aspirato, il pellet conterrà HPMC e RBC.
    2. Piatto tutte le cellule del pellet in un pallone 75 cm 2 in 15 ml di terreni di crescita completo (DMEM con 10% di siero fetale bovino [FBS], 1% vitamine MEM [93 mg / L], 1% di acidi MEM amminoacidi non essenziali [81.4 mg / L], 1% di penicillina streptomicina [Pen-Strep, 100 U / ml di penicillina e 100 mg / ml di streptomicina]).
    3. Eseguire un lavaggio secondario PBS per isolare HPMCs supplementari.
      1. Per la PBS secondario lavare, scuotere il tessuto solido residuo a 200 rpm, 37 ° C per 10 minuti in 20 ml di PBS, quindi attendere 1 minuto per il tessuto di galleggiare verso l'alto. Rimuovere il liquido dal fondo della provetta in un nuovo tubo, centrifugare a 0,5 xg per 3 min, e aspirare il surnatante.
      2. Piatto tutto il HPMC / RBC dal PBS secondario lavare in un pallone di 75 cm separata 2 in 15 ml di terreni di crescita completa.
    4. Per isolare ogni rNumero residua HPMC, agitare il tessuto macinata a 200 rpm, 37 ° C ° per 10 min a 20 ml di una miscela 1: 1 0,25% tripsina mM EDTA 25: soluzione PBS in volume. Lasciare il tessuto a salire, raccogliere il liquido sul fondo della provetta in un nuovo tubo 50 ml, e spin giù a 0.5 gx 3 min.
      1. Aspirare il surnatante e piastra tutto il HPMC / RBC in un pallone di 75 cm 2 separata in 15 ml di terreni di crescita completa.
    5. Cultura le cellule piastrate a 37 ° C e 5% CO 2 in un ambiente umidificato. Mangimi cellule placcato con l'aggiunta di 15 ml di media piena crescita nei giorni 3 e 5 senza rimuovere i media spesi. HPMC può essere coltivato per 5-7 giorni prima della scissione.
      1. Utilizzare a basso passaggio HPMC (fino a passaggio 2) in tutti gli esperimenti per ridurre al minimo dedifferenziazione e la modifica di fenotipo originale. Utilizzare un microscopio a grande campo, preferibilmente con un obiettivo 20x con funzionalità di contrasto interferenza differenziali plastica o obiettivo 4-20x con capabilitie contrasto di fases (filtri di contrasto di fase sul microscopio) per l'adozione di tutte le immagini delle cellule, e un obiettivo 10x () in campo chiaro per analizzare immunoistochimica 3,3'-diaminobenzidina (DAB) colorazione.
    6. Verificare che il HPMC sono cubica ed esprimere citocheratina 8 e vimentina eseguendo immunoistochimica 8 (figura 3A, C, E).
  3. NOF isolamento 8
    1. Preparare 10 ml di uno stock di soluzione di tipo collagenasi III (10x) mediante la combinazione di un 1: 1: 1 miscela di 100x Pen-Strep: 1.500 unità di attività / ml di collagenasi di tipo III: attività 714 unità / ml di ialuronidasi in PBS.
    2. Agitare il tessuto omento macinata, che rimane dopo l'isolamento HPMC a 200 rpm, 37 ° C per 6 ore in 10 ml di soluzione di 10x collagenasi tipo III diluito nei media senza siero (DMEM con 1% vitamine MEM [93 mg / L], 1% MEM aminoacidi non essenziali [81,4 mg / L], 1% di penicillina streptomicina [Pen-Strep, 100 U / ml di penicillina e 100 mg / ml di streptomicina]). Tessuto digerito sarà opaco e potrebbe avere alcuni detriti fibroso (Figura 2E).
    3. Centrifugare le cellule NOF soluzione contenente in sospensione a 0,5 xg per 3 min a RT, aspirare il supernatante e piastra il pellet in un pallone 75 cm 2 in 13 ml di terreni di crescita completa.
    4. Rimuovere vecchi media e sostituirlo con 15 ml di fresco terreni di crescita completo dopo 24 ore. NOF può essere coltivato per 1-3 giorni prima della scissione. Nota proliferazione del NOF cesserà quando le cellule raggiungono confluenza.
    5. Confermare che i fibroblasti umani primari sono, cellule allungate piatte ed esprimono vimentina, ma non citocheratina 8 eseguendo immunoistochimica 8 (figura 3B, D, F). Utilizzare a basso passaggio NOF per esperimenti (idealmente prima del passaggio 3) per ridurre al minimo dedifferentiation e modifica di fenotipo originale. Utilizzare un microscopio a grande campo con un obiettivo 20x con funzionalità di plastica DIC dell'adozione di tutte le immagini in fase di cellule,e un obiettivo 10x in campo chiaro per analizzare immunoistochimica DAB colorazione.

2. Placcatura Cultura organotipica 8

  1. NOF uscita dal pallone di coltura 75 cm da risciacquo con 10 ml di PBS seguita da 3 ml di 0,25% / 25 mM EDTA tripsina per non più di 5 min. Neutralizzare tripsina con almeno 3 volte il volume del terreno di coltura completo.
  2. Trasferire le cellule trypsinized in una provetta da 50 ml e spin down a 0.5 gx 3 min. Rimuovere il surnatante e portare le cellule back up in 5 ml di media piena crescita. Utilizzare un contatore di cellule per contare le cellule recuperate dal pallone di coltura.
  3. Diluire le cellule nel volume appropriato di supporto piena crescita al piatto 2.000-4.000 NOF per 100 microlitri su un piatto nero, chiaro a fondo, 96 pozzetti. Aggiungere 0,5 mg / 100 ml di coda di topo collagene I alla miscela cella prima placcatura. Let cellule siedono a 37 ° C in 5% CO 2 in un ambiente umidificato per almeno 4 ore, o fino a quando le cellulead aderire alla superficie della piastra.
  4. Rilasciare HPMC dal pallone di coltura usando gli stessi metodi descritti in fasi 2.1 e 2.2. Diluire le cellule nella quantità appropriata di terreni di crescita completo alla tavola 10.000-20.000 HPMC per 50 microlitri in cima al NOF già placcato con collagene I in piastre da 96 pozzetti. Lasciare le cellule siedono a 37 ° C in 5% CO 2 in un ambiente umidificato per almeno 18 ore prima di iniziare esperimenti.
  5. La proteina fluorescente verde Cultura (GFP) esprimente le cellule tumorali dell'ovaio HeyA8 nei media piena crescita. Le cellule tumorali dell'ovaio HeyA8 sono fluorescente da espressione di un vettore lentivirale che esprime copepodi cGFP (pCDH-CMV-MCS-EF1). Le cellule tumorali dell'ovaio HeyA8 dovrebbe essere 80-90% confluenti il ​​giorno di utilizzo (fase di crescita logaritmica). Rilasciate le cellule dalla piastra di coltura e contare con le stesse modalità descritte nei passaggi 2.1-2.2 per le cellule primarie.
  6. Consentire cellule di cancro ovarico di recuperare nei media piena crescita per 15-20 minuti a 37 ° C in untubo conico con coperchio sigillato liberamente.

3. Adesione saggio 8

  1. Dopo il recupero, agglomerare le cellule di cancro ovarico, facendo girare per 3 min a 0,5 xg e poi rimuovere il surnatante e diluire le cellule nel volume adeguato di mezzi privi di siero per ottenere una concentrazione di 50.000 cellule / 100 microlitri.
  2. Capovolgere le piastre a 96 pozzetti con / NOF colture organotipiche HPMC per rimuovere il supporto spesi, e aggiungere 100 ml di sospensione cellulare di cancro nei media senza siero in ciascun pozzetto. Incubare la piastra a 37 ° C in 5% CO 2 in un ambiente umidificato per 30 minuti a 4 ore.
  3. Capovolgere la piastra a 96 pozzetti per rimuovere i media e le cellule non aderenti. Utilizzare una pipetta multicanale a bassa potenza da Dispensare attenzione e delicatezza 100 ml di soluzione in ciascuno bene, e invertire di nuovo piatto. Ripetere la PBS lavare una volta di più.
  4. Inverti per rimuovere PBS e aggiungere 100 microlitri paraformaldeide 4% in ogni pozzetto. Lasciare la piastra a sedere per 20 min per fissare le cellule. Dopo 20 minuti, capovolgere la piastra e aggiungere 100 microlitri di PBS.
  5. Si noti che la fluorescenza totale di pozzetti possono essere segnalati o il numero di cellule può essere quantificata. Per la quantificazione, prima piastra una curva standard in duplicato utilizzando cellule HeyA8 ad una concentrazione di 1 milione di cellule / ml.
    1. Rendere la curva standard riducendo la velocità 1 milione di cellule, rimuovendo i media, e consentendo loro di sedersi in 1 ml di paraformaldeide 4% per 20 min.
    2. Spin cellule di nuovo e portare fino in 1 ml di PBS (cellule raccontano per confermare 1.000.000 / concentrazione ml). Piatto 50.000, 40.000, 30.000, 20.000, 10.000, 5000, 1000, e 0 cellule in ciascun pozzetto in duplicato, e aggiungere PBS per un volume totale finale di 50 microlitri in ciascun pozzetto.
  6. Fondo leggere la piastra di coltura su un lettore di fluorescenza piatto (eccitazione = 488 nm, emissione = 528 nm), il ridimensionamento alti pozzi (50.000 in curva standard). Utilizzare la curva standard per calcolare il numero di cellule di cancro ovarico aderito alla organotypcultura ic in ciascun pozzetto (Figura 4A-C).

4. Proliferazione Assay 10

  1. Dopo che le cellule tumorali dell'ovaio recuperare (vedere i passi 2.5 e sopra 2.6), agglomerare le cellule facendo girare per 3 min a 0,5 xg e quindi diluire le cellule nel volume appropriato di 1% FBS supporti (DMEM con 1% FBS, 1% MEM vitamine [93 mg / L], 1% MEM aminoacidi essenziali [81,4 mg / L], 1% di penicillina streptomicina [Pen-Strep, 100 U / ml di penicillina e 100 mg / ml di streptomicina]) per ottenere una concentrazione di 4.000 cellule / 150 ml.
  2. Capovolgere la piastra a 96 pozzetti con i HPMC / NOF colture organotipiche di estrarre il supporto spesi, e aggiungere 150 ml di sospensione cellulare cancro nel 1% dei media FBS in ciascun pozzetto. Incubare la piastra a 37 ° C in 5% CO 2 in un ambiente umidificato per 72 hr.
  3. Fondo leggere la piastra di coltura su un lettore di piastre a fluorescenza una volta al giorno (di eccitazione = 488 nm, emissione = 528 nm) per valutare la relativa proliferazionedi cellule. Continuare il test per 96 ore, cambiando i media a 48 ore (Figura 5A-C). Fare attenzione a non disturbare la cultura quando si cambia supporto (invertendo il piatto è preferibile).

5. Invasione Assay 8

  1. Prima di placcatura la cultura 3D, aggiungere 7,5 mg coda di topo collagene I in 200 l di PBS a 24 pozzetti inserto piastra di coltura (8 micron dimensione dei pori). Lasciate che la piastra di incubare O / N, quindi rimuovere con cautela la PBS con una pipetta immediatamente prima placcatura cultura organotipica HPMC / NOF sugli inserti collagene rivestite (step 2, sopra).
  2. Preparare le cellule tumorali ovariche come al punto 3.1. Al piatto le cellule tumorali ovariche sulle colture organotipiche sugli inserti, utilizzare con cautela una pipetta per rimuovere l'eccesso supporto dalla parte superiore degli inserti. Aggiungere 100 ml di sospensione cellulare tumore ovarico in mezzi privi di siero in ciascun pozzetto.
  3. Aggiungere 750 ml di media piena crescita nel pozzo sotto l'inserto di indurre cellule del cancro invasion nelle culture organotipiche. Incubare la piastra a 37 ° C in 5% CO 2 in un ambiente umidificato per 24 ore.
    Nota: le cellule tumorali ovariche che invadono la cultura organotipica attraverserà l'inserto e rimanere sul lato inferiore dell'inserto.
  4. Dopo 24 ore, cogliere l'inserto con le pinze e brevemente sciacquarlo in un bicchiere di PBS, quindi spostare l'inserto in un pozzo vuoto. Scrub parte superiore di ogni inserto con entrambi i lati di un batuffolo di cotone per un totale di 1 min. Introdurre rapidamente l'inserto in un piatto contenente 750 ml 4% paraformaldeide in ogni pozzetto. Consentire ad ogni inserto di sedersi in paraformaldeide per 10 minuti prima di trasferire gli inserti nei pozzetti riempiti con 750 l di PBS.
  5. Vedi le cellule invase (aderito e fissati al fondo di inserti) con un microscopio a 2,5x. Quando l'intero pozzo è all'interno del campo di vista, regolare l'ingrandimento di 10x e prendere 5 immagini, uno vicino al centro e 1 in ciascun quadrante del pozzo, evitandoprendendo immagini troppo vicino ai bordi. Seguire lo stesso schema per ogni bene.
  6. Utilizzare il programma del produttore per contare il numero di cellule in ogni immagine per ottenere un numero medio di cellule invase per campo in ogni pozzetto (Figura 6A-C) in base al loro protocollo.

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Risultati

La coltura organotipica stato assemblato mescolando dapprima fibroblasti umani primari con collagene di tipo I e quindi sovrapponendo questa cultura con 5 volte il numero di cellule mesoteliali. La cultura è stata incubata per almeno 18 ore prima di cellule di cancro ovarico sono stati aggiunti per studiare l'adesione, invasione o la proliferazione. Ciascun test è stato ripetuto con multiplo (n = 3-5) culture 3D ottenuti da pazienti diversi e numerosi pozzi sono stati testati in ciascuna condizione per l'adesi...

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Discussione

Un modello organotipica del microambiente peritoneale è stato istituito per valutare la funzione individuale e collettiva (s) di entrambi i componenti cellulari e innate del microambiente in ovarico diffusione del cancro. Sono disponibili i protocolli specifici per la placcatura e personalizzare la cultura organotipica 3D per indagare ovarico adesione delle cellule tumorali, la proliferazione e l'invasione. Cellule primarie umane omentali mesothelial e fibroblasti sono stati isolati da pazienti e utilizzati in un p...

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Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Riconoscimenti

We thank all residents and attending physicians, notably Dr. A.F. Haney (the University of Chicago, Department of Obstetrics and Gynecology) for collecting omental biopsies. Also, we thank Stacey Tobin and Gail Isenberg for carefully editing this manuscript. This work was supported by Bears Care, the charitable beneficiary of the Chicago Bears Football Club, the National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) R21 NS075702, and the National Cancer Institute grant R01 CA111882 to E.L.

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
1. Isolation and culture of primary cells
PBSFisher ScientificSH3001304
Single-edged razor bladesFisher Scientific12-640
15 cm culture dishesBD Biosciences353025
Glass flask??
Fetal Bovine Serum (FBS)Life Technologies16000044_3616914956
DMEM with L-GlutamineCorning10-013-CV
MEM VitaminsCorning25-020-Cl
MEM Nonessential amino acidsCorning25-025-CI
Penicillin-StreptomycinCorning30-002-CI
Shaker Thermo-FisherMaxQ 4450
CentrifugeEppendorf5702
IncubatorThermo-FisherForma Series II Water Jacketed CO2 Incubator Model 3100
Trypsin EDTA, 1x (0.25%)Corning25-053-CI
HyaluronidaseWorthington BiochemicalLS002592
T-75 FlasksBD Biosciences353136
T-175 FlasksBD Biosciences353112
Pipet tipsRaininP2, P10, P20, P200 and P1000
Pipet tipsCorningFiltered tips P2, P10, P20, P200 and P1000
Name of Reagent/ EquipmentCompanyCatalog NumberComments/Description
2. Plating 3D culture
Cell CounterInvitrogenCountess
Countess Cell Counting Chamber SlidesInvitrogenC10313
Trypan Blue Stain (0.4%)Gibco15250-061
Collagen Type I (Rat Tail)BD Biosciences354236
96 well plate, clear bottom, blackBD Biosciences353219
Name of Reagent/ EquipmentCompanyCatalog NumberComments/Description
3. Adhesion assay
Multichannel pipetEppendorfXplorer 300
Paraformaldehyde solution 4% in PBSSanta Cruz Biotechnologysc-281692
Plate readerMolecular DevicesMinimax
Name of Reagent/ EquipmentCompanyCatalog NumberComments/Description
5. Invasion assay
Cell Culture Inserts (8um, 24-well)BD Biosciences353097
Cotton swabsQ-tipscotton swabs
MicroscopeZeissAxiovert 200m
Cell Profilerpublic domain
24 well plateBD Biosciences353047
Name of Reagent/ EquipmentCompanyCatalog NumberComments/Description
6. Antibodies
Anti-Integrin αVβ3 Antibody, clone LM609EMD MilliporeMAB1976
Beta 1 OncosynergyOS2966
Alpha 5 [CD49e]ID Pharmingen555615
Beta 4 [CD104]EMD MilliporeMAB 2058

Riferimenti

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