Tossicità Assay salinità-dipendente di Silver Nanocolloids Utilizzando Medaka uova

Riepilogo

Embryonic stages are the most susceptible to xenobiotics. Although chemical toxicity depends on salinity, no method exists to test the salinity dependence of toxicity to aquatic organisms. Here, we describe a new and high-throughput method for determining the salinity dependence of toxicity to aquatic embryos.

Abstract

Salinità è una caratteristica importante per l'ambiente acquatico. Per gli organismi acquatici definisce gli habitat di acqua dolce, acqua salmastra e acqua di mare. Prove di tossicità delle sostanze chimiche e valutazioni delle loro rischi ecologici per gli organismi acquatici vengono spesso eseguite in acqua dolce, ma la tossicità delle sostanze chimiche per gli organismi acquatici dipende dal pH, temperatura e salinità. Non esiste un metodo, tuttavia, per testare la dipendenza salinità di tossicità per gli organismi acquatici. Qui, abbiamo usato Medaka (Oryzias latipes) perché possono adattarsi a acqua dolce, acqua salmastra e acqua di mare. Diverse concentrazioni di media embrione-allevamento (ERM) (1x, 5x, 10x, 15x, 20x e 30x) sono stati impiegati per testare la tossicità delle particelle nanocolloidale argento (SNCS) per Medaka uova (1x ERM e 30x ERM avere pressioni osmotiche equivalente rispettivamente acqua dolce e acqua di mare,). In piastre sei pozzetti di plastica, 15 uova Medaka in triplice copia, sono stati esposti a SNCS a 10 mg / L ^&# 8722; 1 in diverse concentrazioni di ERM a pH 7 e 25 ° C al buio.

Abbiamo usato un microscopio da dissezione e un micrometro per misurare la frequenza cardiaca per 15 secondi e l'occhio di diametro il giorno 6 e piena lunghezza del corpo delle larve sul schiusa giorno (sezione 4). Gli embrioni sono stati osservati fino alla schiusa o il giorno 14; Abbiamo poi contato il tasso di schiusa ogni giorno per 14 giorni (sezione 4). Per vedere l'accumulo d'argento negli embrioni, abbiamo usato ad accoppiamento induttivo spettrometria di massa a plasma per misurare la concentrazione d'argento di soluzioni di test (sezione 5) ed embrioni dechorionated (sezione 6) .Il tossicità dei SNCS di embrioni Medaka ovviamente aumentata con l'aumento della salinità. Questo nuovo metodo ci permette di testare la tossicità delle sostanze chimiche in diverse salinità.

Introduzione

Dal momento che l'istituzione dell'Organizzazione per la Cooperazione Economica e linee direttrici per lo sviluppo (OCSE) per le sostanze chimiche di test nel 1979, 38 linee direttrici sono state pubblicate nella sezione 2 delle linee guida, gli effetti sulla biotici Sistemi ^1. Tutti gli organismi acquatici sottoposti alla prova sono stati da habitat d'acqua dolce, vale a dire le piante d'acqua dolce; alghe; invertebrati come dafnie e chironomidi; e pesci, come Medaka, zebrafish, e la trota arcobaleno. Rispetto agli ambienti di acqua salata, ambienti d'acqua dolce sono più direttamente interessate da attività economiche e industriali umani. Pertanto, ambienti d'acqua dolce sono state priorità per il test, perché sono a più alto rischio di inquinamento.

Nelle zone costiere, tra cui estuari, salinità variano tra condizioni di acqua e acqua di mare salmastra, e queste zone sono spesso inquinate da attività industriale ^2. Le zone costiere e le loro zone umide associati sono caratterizzati da hIGH biodiversità ecologica e produttività. Gli ecosistemi costieri devono pertanto essere protetti da inquinamento chimico. Tuttavia, vi è stata limitata la ricerca ecotossicologiche in acqua e acqua di mare salmastra habitat.

Sakaizumi ³ studiato le interazioni tossiche tra metil mercurio e la salinità nelle uova Medaka giapponesi e ha scoperto che aumentando la pressione osmotica della soluzione di prova migliorato la tossicità del mercurio metilico. . Sumitani et al ⁴ utilizzati uova Medaka per studiare la tossicità del percolato di discarica; hanno scoperto che l'equivalenza osmotica del percolato alle uova è stata la chiave per indurre anomalie durante l'embriogenesi. Inoltre, Kashiwada ⁵ ha riferito che le nanoparticelle di plastica (39,4 nm di diametro) facilmente permeato attraverso il corion Medaka uovo in condizioni salmastre (15x embrione allevamento medio (ERM)).

Un tipico modello di piccoli pesci, i Medaka giapponesi (Oryzias latipes ) è stato usato in biologia di base e ecotossicologia ^6. Medaka giapponesi possono vivere in condizioni che vanno da acqua dolce ad acqua di mare a causa delle loro cellule cloruro altamente sviluppati ^7. Sono quindi suscettibili di essere utile per testare in condizioni con una vasta gamma di salinità.

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Protocollo

I Medaka giapponesi utilizzati in questo studio sono stati trattati umanamente secondo le linee guida istituzionali di Toyo University, con la dovuta considerazione per l'alleviamento della sofferenza e disagio.

1. argento Nanocolloids (SNCS)

1. Acquisto SNCS purificati (20 mg / L ^-1, 99,99% di purezza, di particelle di diametro circa 28,4 ± 8,5 nm sospeso in acqua distillata significa).
2. Convalida la purezza e la concentrazione dell'argento da accoppiamento induttivo spettrometria di massa a plasma (ICP-MS) analisi in base alle istruzioni per l'uso ^8. Il metodo di pretrattamento per ICP-MS analisi è descritto nel capitolo 7.

2. Preparazione del SNC Solutions (miscele di argento colloidi e Ag ⁺⁾ con diverse salinità

1. Preparare 60 ERM × costituito da 60 g di NaCl, 1,8 g KCl, 2,4 g di CaCl ₂ · 2H ₂ O, e 9,78 g MgSO ₄ · 7H ₂ O in 1 L di ultacqua rapure; regolare il pH a 7,0 con 1,25% NaHCO ₃ in acqua ultrapura.
2. Agitare la soluzione ERM a 25 ° C per una notte.
3. Mescolare SNCS con ERM diluito. Preparare 40 ml di ciascuna soluzione mista SNC-ERM. La concentrazione finale è di 10 mg / L ^-1 di SNCS in diverse concentrazioni di ERM (1x, 5x, 10x, 15x, 20x, 30x o).
4. Regolare il pH della soluzione mista SNC-ERM a 7,0 con 0,625% NaHCO ₃ in acqua ultrapura. la regolazione del pH è molto importante nella preparazione della soluzione SNC, perché Ag ⁺ rilascio è facilitato da condizioni acide ^9.
5. Utilizzare AgNO ₃ come composto di riferimento per SNCS.
   1. Mescolare AgNO ₃ con ERM diluito. Preparare 40 ml di Agno ₃ -ERM soluzione mista ad un AgNO ₃ concentrazione di 15,7 mg / L ^-1 (10 mg / L ^-1 argento) a differenti concentrazioni di ERM (1x, 5x, 10x, 15x, 20x, 30x o) .
      Nota: Per esaminare la tossicità colloidi d'argento, Agno ₃soluzione, che è una fonte di argento solubile, viene usato come composto di riferimento per SNCS, che sono una miscela di colloidi di argento e argento solubile.

3. Medaka cultura e la raccolta Egg

1. Ottenere il Medaka (latipes O.) (ceppo arancio-rosso) (60 maschi e 60 femmine).
2. Cultura Medaka come gruppi (20 maschi e 20 femmine come un unico gruppo) in 1x ERM in 3 serbatoi L utilizzando un sistema di coltura Medaka flow-through.
   1. Cultura alle seguenti condizioni:
      intervallo di pH del mezzo di coltura: 6,2 e 6,5
      luce: buio ciclo: 16: 8 ore
      temperatura del mezzo di coltura: 24 ± 0.5 ° C
      pressione osmotica del mezzo di coltura: 257 mOsm
3. Alimentare Medaka su Artemia salina naupli alle 10:00 (una volta al giorno) ed alimentare una dieta pesce secco artificiali alle 09:00, 11:00, 13:00, 15:00 e 17:00 (cinque volte al giorno).
   1. Ottenere A. salina nauplii.
   2. Preparare 5 L di una soluzione salina 3,0% in un beaker di plastica.
   3. Aggiungere 30 g di uova del gambero di salamoia per la soluzione salina nel bicchiere.
   4. Incubare le uova a 25 ° C per 48 ore con gorgogliamento (4 L / min ^-1) utilizzando una pompa di aerazione.
   5. Dopo 48 ore, arrestare il bubbling.
   6. Lasciare che la soluzione riposare per 5 a 10 minuti per separare la A. tratteggiato salina nauplii (parte inferiore della soluzione) dalle uova non schiuse e gusci d'uovo (parte superiore della soluzione).
   7. Rimuovere lo strato superiore della soluzione per decantazione.
   8. Filtrare la porzione inferiore della soluzione attraverso un setaccio con aperture di 283 micron, e raccogliere i naupli che passano attraverso una rete con aperture di 198 micron.
   9. Alimentare il nauplii alle Medaka entro 6 ore.
4. Dopo i Medaka femminili hanno generato, rimuovere gli ammassi di uova esterni delicatamente dai corpi delle femmine o raccogliere le uova dal fondo della vasca di pesci utilizzando un smtutti i net (dimensione netta 5 cm x 5 cm, dimensione del foro 0,2 mm x 0,2 mm).
5. Risciacquare il cluster uovo con acqua corrente per 5 sec.
6. Aggiungere tutti i cluster di uova sciacquati a 30x soluzione ERM.
7. Rimuovere i cluster dalla soluzione dopo 1 min e posizionare i grappoli d'uovo tra gli asciugamani di carta a secco e ruotare delicatamente.
8. Mettere le uova di nuovo nel ERM 30x.
9. Selezionare uova fecondate sotto un microscopio da dissezione.
10. Luogo scelto 810 uova in 1x ERM in sei pozzetti di plastica utilizzando una pinza.
11. Incubare le uova a 25 ± 0,1 ° C in un incubatore fino stadio di sviluppo 21. (Stadi di sviluppo degli embrioni Medaka sono stati definiti dal lavoro di Iwamatsu ^10).
12. Scegliere uova incubate in fase di sviluppo 21 sotto un microscopio da dissezione.
13. Risciacquare uova selezionati con 1x ERM.
14. Sottoporre le uova sciacquati agli esperimenti di esposizione (sezione 4).

4. Prove di tossicità dei SNCS o AgNO ₃ A differenti salinità ERM

1. Risciacquare uova Medaka (fase 21) tre volte con soluzione di prova [SNCS (10 mg / L ^-1) o AgNO ₃ (15,7 mg / L ^-1 a 10 mg / L ^-1 argento) a ciascuna concentrazione di ERM (1x, 5x , 10x, 15x, 20x, 30x o) a pH 7]. Come controlli, utilizzare uova in 1 × 30 × ERM a pH 7.
2. Aggiungere 15 uova sciacquati a 5 ml di ciascuna soluzione di prova in sei pozzetti di plastica. (Eseguire gli esperimenti di esposizione tre volte per il SNC o AgNO _{3 di} tossicità test con ogni soluzione di prova.)
3. Avvolgere le piastre in alluminio.
4. Incubare le piastre avvolte a 25 ° C al buio fino alla schiusa o per 14 giorni.
5. Osservare le uova esposte ogni 24 ore per i cambiamenti biologici e uova morti (figure 1 e 2).
6. Sostituire le soluzioni in esame ogni 24 ore.
7. Eseguire osservazioni come segue.
   1. Il giorno 6 di esposizione, contare la frequenza cardiaca (per 15 sec) oembrioni Medaka f sotto un microscopio da dissezione utilizzando un cronometro (Figura 3a).
   2. Il giorno 6 di esposizione, si misura la dimensione dell'occhio (diametro) di embrioni Medaka sotto un microscopio da dissezione utilizzando un micrometro (Figura 3b).
   3. Il giorno schiusa, misurare le lunghezze corpo pieno di larve sotto un microscopio da dissezione utilizzando un micrometro (Figura 3c).
   4. Contare il numero totale di uova che si schiudono esposti nei 14 giorni (figura 3d).

5. L'isolamento di Silver solubile da SNC Solution, e analisi d'argento

1. Isolare argento solubile di ciascuna soluzione SNC (una miscela di colloidi di argento e argento solubile) filtrando attraverso un filtro a membrana 3 kDa a 14.000 x ge 4 ° C per 10 min. Utilizzare un filtro a membrana 3 kDa per isolare l'argento solubile dalle SNCS, perché il diametro medio riportato SNCS aggregati in 1x ERM è 67,8 nm ¹¹ aND quella di Ag ⁺ è 0,162 nm ^12; la membrana 3 kDa esclude le particelle con un diametro di 2 nm o più ^13.
2. Misurare la concentrazione di argento in 50 ml di soluzione filtrata (= concentrazione argento solubile) mediante ICP-MS analisi (figura 3e) secondo il manuale operativo ICP-MS ^8. Il metodo di pretrattamento per la ICP-MS analisi è descritto nel capitolo 7.

6. Misure di Silver bioaccumulo in Medaka Embrioni

1. Esporre uova Medaka (fase 21) a SNCS o AgNO ₃ come descritto nella sezione 4.
2. Il giorno 6 di esposizione, rimuovere corion dall'uovo (vale a dire, dechorion) utilizzando Medaka cova enzima secondo il protocollo descritto nel Libro Medaka ^14.
3. Misurare la concentrazione d'argento delle uova dechorioned mediante analisi ICP-MS secondo la ICP-MS manuale operativo ⁸ (Figura 3f). Il pretrattamentometodo per la ICP-MS analisi è descritto nel capitolo 7.

7. misurazione della concentrazione d'argento per ICP-MS Analysis

1. Aggiungere esempi [50 ml di soluzione d'argento (per la validazione della concentrazione di argento, sezione 1); tre embrioni dechorionated (sezione 5); o 50 ml di soluzione filtrata (sezione 5)] per un 50 ml di Teflon bicchiere.
2. Aggiungere 2,0 ml di acido nitrico ultrapuro al bicchiere da 50 ml.
3. Scaldare la miscela su un piatto caldo a 110 ° C fino a poco prima che si asciughi (circa 3 ore).
4. Per sciogliere la sostanza organica completamente, aggiungere 2,0 ml di acido nitrico ultrapuro e 0,5 ml di acqua ossigenata nel becher.
5. Scaldare la miscela di nuovo sulla piastra calda fino a poco prima che si asciughi (circa 3 ore).
6. Sciogliere il residuo in 4 ml di soluzione di acido nitrico ultrapuro 1,0%.
7. Trasferimento 4 ml di soluzione in una provetta da centrifuga.
8. Ripetere 7.6 al 7.7 volte (per un totale di tre volte). Il volume finale è 12.0ml.
9. Misurare la concentrazione d'argento del campione (sciolto in acido nitrico ultrapuro 1,0%) utilizzando analisi ICP-MS secondo il manuale operativo ^8.
   1. Utilizzare un interno e una soluzione standard esterno (vedi elenco dei materiali) per quantificare la concentrazione di argento. La soluzione standard interna ed esterna è accreditato dalla American Association for Laboratory Accreditation (A2LA). Limiti di rilevazione d'argento erano 0,0018 ng / ml ^-1 (soluzione) e 0.016 ng mg-peso ^-1 (corpo dell'embrione).

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Risultati

L'effetto della salinità sulla tossicità SNC era molto evidente: l'induzione di deformità o morte era salinità dipendenti (figure 1 e 2). Abbiamo misurato biomarcatori fenotipiche (frequenza cardiaca, dimensioni degli occhi, la lunghezza di tutto il corpo, e tasso di schiusa) nel SNC (10 mg / L ^-1) embrioni -exposed. Questi biomarcatori fenotipiche hanno rivelato tossicità SNC salinità-dipendente.

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Discussione

Medaka è un pesce d'acqua dolce che è altamente tolleranti all'acqua di mare; non è ben noto che l'habitat naturale originali pesce era acqua salata largo della costa giapponese ^6. Quindi, pesce Medaka sono ben sviluppate cellule cloruro ^7. Questa struttura unica fornisce agli scienziati un nuovo modo per testare la tossicità delle sostanze chimiche nell'ambiente in funzione della salinità (acqua dolce ad acqua di mare) utilizzando solo una singola specie di pesce.

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Silver nanocolloids	Utopia Silver Supplements
NaCl	Nacalai Tesque, Inc.	31319-45	For making ERM
KCl	Nacalai Tesque, Inc.	28513-85	For making ERM
CaCl2·2H2O	Nacalai Tesque, Inc.	06730-15	For making ERM
MgSO4·7H2O	Nacalai Tesque, Inc.	21002-85	For making ERM
NaHCO3	Nacalai Tesque, Inc.	31212-25	For making ERM
AgNO3	Nacalai Tesque, Inc.	31018-72
pH meter	HORIBA, Ltd.	F-51S
Balance	Mettler-Toledo International Inc.	MS204S
medaka (Oryzias latipes) orange-red strain	National Institute for Environmental Studies
medaka flow-through culturing system	Meito Suien Co.	MEITOsystem
Artemia salina nauplii eggs	Japan pet design Co. Ltd	4975677033759
aeration pump	Japan pet design Co. Ltd	non-noise w300
Otohime larval β-1	Marubeni Nissin Feed Co. Ltd	Otohime larval β-1	Artificial dry fish diet
dissecting microscope	Leica microsystems	M165FC
micrometer	Fujikogaku, Ltd.	10450023
incubator	Nksystem	TG-180-5LB
shaker	ELMI Ltd.	Aizkraukles 21-136
6-well plastic plates	Greiner CELLSTAR	M8562-100EA
aluminum foil	AS ONE Co.	6-713-02
stopwatch	DRETEC Co. Ltd.	SW-111YE
3 kDa membrane filter	EMD Millipore Corporation	0.5 ml centrifugal-type filter
50 ml Teflon beaker	AS ONE Co.	33431097
Custom claritas standard	SPEXertificate	ZSTC-538	For internal standard
Custom claritas standard	SPEXertificate	ZSTC-622	For external standard
ultrapure nitric acid	Kanto Chemical Co.	28163-5B
hydrogen peroxide	Kanto Chemical Co.	18084-1B	for atomic absorption spectrometry
ICP-MS	Thermo Scientific	Thermo Scientific X Series 2
hot plate	Tiger Co.	CRC-A300