Un ELISA Based rilegatura e metodo concorrenza di determinare con rapidità interazioni ligando-recettore

Riepilogo

The presented protocols describe two enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) based techniques for the rapid investigation of ligand-receptor interactions: The first assay allows the determination of dissociation constant between ligand and receptor. The second assay enables a rapid screening of blocking peptides for ligand-receptor interactions.

Abstract

A comprehensive understanding of signaling pathways requires detailed knowledge regarding ligand-receptor interaction. This article describes two fast and reliable point-by-point protocols of enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) for the investigation of ligand-receptor interactions: the direct ligand-receptor interaction assay (LRA) and the competition LRA. As a case study, the ELISA based analysis of the interaction between different lambda interferons (IFNLs) and the alpha subunit of their receptor (IL28RA) is presented: the direct LRA is used for the determination of dissociation constants (K_D values) between receptor and IFN ligands, and the competition LRA for the determination of the inhibitory capacity of an oligopeptide, which was designed to compete with the IFNLs at their receptor binding site. Analytical steps to estimate K_D and half maximal inhibitory concentration (IC₅₀) values are described. Finally, the discussion highlights advantages and disadvantages of the presented method and how the results enable a better molecular understanding of ligand-receptor interactions.

Introduzione

Una comprensione completa delle vie di segnalazione richiede una conoscenza dettagliata circa l'interazione ligando-recettore. La maggior parte dei metodi per valutare l'interazione di un particolare ligando con il recettore specifico sono costosi, in termini di tempo, manodopera e richiedono attrezzature e competenze specifiche ^1.

Questo articolo descrive due protocolli veloce e affidabile punto per punto per studiare l'interazione ligando-recettore sulla base di un enzima collegato immunosorbent assay (ELISA): il saggio di interazione ligando-recettore diretta (LRA) e l'LRA concorrenza. ELISA è una tecnica molto sensibile, specifico e facilmente disponibile, solitamente usata in quasi ogni laboratorio. ELISA può essere eseguito e adattato in varie mode. I protocolli presentati sono ottimizzati per la ricerca delle interazioni tra i diversi interferoni lambda (INFLs) e la loro recettore.

L'LRA diretta consente una quantificatisu ligando-recettore vincolante rispetto alla concentrazione del ligando e produce pertanto una curva vincolante. Usando un modello appropriato per l'interazione ligando-recettore, i dati possono essere ulteriormente analizzati per stimare la costante di dissociazione (K _D).

Nel protocollo presentato, l'equazione Hill comunemente usato è applicata per modellare il legame ligando-recettore. Sebbene altri metodi come la superficie plasmon risonanza a ^2,3 consentono la determinazione delle affinità di legame tra due proteine, questa tecnologia è spesso laborioso, costoso e richiede attrezzature speciali di laboratorio.

L'LRA concorrenza consente la proiezione di peptidi inibitori: il legame ligando-recettore viene quantificata rispetto alla concentrazione di peptide. Questo produce una curva dose-risposta che descrive l'effetto inibitorio del peptide. I dati possono essere ulteriormente analizzati per stimare la metà massima concentrazione inibitoria (IC ₅₀ ) del peptide bloccante.

Entrambi protocolli ELISA sono facili da usare e possono essere adattati ad una vasta gamma di domande di ricerca. proteine ​​ricombinanti di qualsiasi tipo possono essere utilizzati per determinare in modo affidabile e veloce le parti di interazione. Inoltre, l'Lra concorrenza può essere utilizzato per determinare siti di interazione critici di ligandi e recettori utilizzando peptidi di blocco, che sono progettati per imitare sia il ligando o il recettore. Se il peptide bloccante mostra l'inibizione efficace e specifico, il peptide occupa un sito critico interazione del ligando (se imita peptidici del recettore) o del ligando (se imita peptide ligando).

Il primo protocollo descrive la determinazione K _D valore delle diverse INFLs e la subunità alfa del loro recettore, cioè il recettore dell'interleuchina-28 (IL28RA) usando l'LRA diretta. Successivamente, il secondo protocollo mostra come determinare la capacità di un lungo peptide di 20 aminoacidi diinibire le interazioni INFL-IL28RA. Il peptide è stato progettato per competere con IFNLs al loro recettore sito di legame e consente così una comprensione molecolare dell'interazione. Inoltre, questo peptide può essere utilizzato per bloccare IL28RA in esperimenti in vitro per determinare l'impatto sugli effetti di segnalazione a valle ^4.

Protocollo

1. Preparazione dei reagenti

1. Per preparare un tampone di rivestimento carbonato, sciogliere 0,36 g di Na ₂ CO ₃ e 0,84 g NaHCO ₃ in 100 ml di acqua distillata; filtro sterile il buffer utilizzando un vuoto spinto 0,22 micron polietersulfone (PES) filtro a membrana e conservare a temperatura ambiente fino a quando l'utilizzo.
2. Preparare la soluzione di lavaggio con l'aggiunta di 0,05% v / v Tween 20 in tampone fosfato (PBS).
3. Preparare un 5% di sieroalbumina bovina (BSA) (soluzione bloccante) in soluzione PBS sciogliendo 5 g BSA (≥98%) in 100 ml di PBS e conservare a 4 ° C.
4. Ricombinante del recettore, leganti e peptidi di blocco
   1. Reconstitutethe ricombinante subunità umano recettore dell'interleuchina alfa (IL28RA) e ricombinanti ligandi His-tag di IFN umano (IFNL1-3) secondo le istruzioni del produttore e conservare a -80 ° C. Sintetizzare peptidi blocco e utilizzato come precedentemente descritto ^4. Utilizzare PBS per preparare differenti concentrazioni di ligandos e peptidi per l'uso nei saggi.
5. Per preparare l'anticorpo primario, diluire 6x suo mouse anticorpo monoclonale in PBS con 0,1% BSA a 1: 1000 diluizione. Per preparare l'anticorpo secondario, diluire perossidasi di rafano (HRP) capra coniugato anti-topo IgG (H + L) in PBS con 0,1% BSA a 1: 10.000 diluizione.
6. Preparare la soluzione TMB miscelando il reagenti A e B secondo le istruzioni del produttore.
7. Preparare la soluzione di arresto con l'aggiunta di 5 N acido solforico (H ₂ SO ₄₎ in acqua distillata e conservare a temperatura ambiente.

2. immunoenzimatico Assays (ELISA)

NOTA: Il diretta interazione ligando-recettore ELISA (Lra diretta, Figura 1) può essere utilizzato per misurare la dissociazione recettore-ligando costante (K _D), come misura della affinità di legame del recettore-ligando. L'interazione concorrenza ligando-recettore ELISA (LRA concorrenza, figura 2) tuttoflussi di screening di peptidi (e altri composti di blocco), che agiscono di interferire con l'interazione tra ligando e recettore. Il protocollo di base che è stato precedentemente pubblicato ⁵ è stata ulteriormente ottimizzata.
NOTA: in entrambe ELISA metodi utilizzano pipetta multicanale per l'aggiunta di soluzioni ai pozzetti di 96 pozzetti in ogni passaggio. Nella soluzione decantare o fasi di lavaggio, buttare fuori le soluzioni direttamente nel lavandino.

1. Diretto ligando-recettore-Interaction Assay (LRA continua)
   NOTA: Per una illustrazione del flusso di lavoro (vedere Figura 1).
   1. Piatto del rivestimento con il recettore ricombinante
      1. Diluire il recettore ricombinante in tampone carbonato a una concentrazione finale di 100 ng / ml. pozzi mano di 96 pozzetti micropiastra con la concentrazione dei recettori fisso (100 ng / ml) pipettando 100 ul per ogni pozzetto usando una pipetta multicanale. Escludere muri esterni della piastra per evitare così artefatto bordo. Coprire la piastra con un coperchio e incubare latarga a 4 ° CO / N.
   2. Blocco e aggiunta di leganti
      1. Il giorno seguente, togliere la soluzione di rivestimento inclinando il piatto contro il lavandino e lavare la piastra 3 volte con soluzione di lavaggio (PBS + 0,05% v / v Tween 20).
      2. Bloccare i siti recettoriali di legame liberi nella piastra rivestita con 200 ml di soluzione di BSA 5% in ogni pozzetto con una pipetta multicanale e incubare la piastra per 2 ore a temperatura ambiente.
      3. Eliminare la soluzione di saturazione (vedi punto 2.1.2.1.) E lavare la piastra 3 volte con soluzione di lavaggio.
      4. Preparare il ricombinante His-tag ligandi a diverse concentrazioni (ad esempio, 8 mg / ml, 4 mg / ml, 2 mg / ml, 1 mg / ml, 0,5 mg / ml, 0,25 mg / ml, 0,125 mg / ml, 0,063 mcg / ml, 0,031 mg / ml, 0,0 mg / ml) in PBS. Aggiungere solo PBS nei pozzetti del bianco.
      5. Aggiungere 100 ml di ciascuna concentrazione ligando ai pozzetti in duplicato e incubare la piastra per 2 ore a temperatura ambiente permettendo recettore-ligandointerazione.
   3. L'incubazione con anticorpi
      1. Dopo l'incubazione con i ligandi, lavare la piastra 3 volte con soluzione di lavaggio.
      2. Dispensare 100 l di suo anti-soluzione principale del mouse anticorpo monoclonale (1: 1.000) in ogni pozzetto.
      3. Incubare la piastra a temperatura ambiente per 2 ore; Dopo l'incubazione, scartare la soluzione di anticorpi (vedi punto 2.1.2.1.) e lavare la piastra 3 volte con soluzione di lavaggio.
      4. Aggiungere 100 ml di HRP accoppiati capra soluzione di anticorpo secondario anti-topo IgG (1: 10.000) in ogni pozzetto. Incubare la piastra per 45 minuti a temperatura ambiente.
      5. Scartare la soluzione di anticorpi (vedi punto 2.1.2.1.) E lavare la piastra 3 volte con soluzione di lavaggio.
   4. L'aggiunta di substrato e lo Sviluppo
      1. Portare le soluzioni del substrato TMB a RT e preparare TMB soluzione di substrato A e B in rapporto 1: 1. Aggiungere 100 ml preparati al momento substrato di ogni bene e mantenere la piastra a temperatura ambiente per 15-30 minuti. Dopo col sufficienti o sviluppo aggiungere la soluzione di arresto 50 ml.
   5. Leggere la piastra e analisi dei dati
      NOTA: Il protocollo descritto si basa sul presupposto che il segnale misurato sale dal legame specifico. Potrebbe essere necessario stimare il contributo di legame aspecifico al segnale ma questo è fuori della portata di questo protocollo.
      1. Leggere l'assorbanza (densità ottica, OD) direttamente a 450 nm.
      2. Sottrarre il segnale di fondo ai valori della DO misurati e li normalizza. Trasformare tutti i valori della concentrazione di ligando in scala logaritmica (base 10, log _10).
      3. Tracciare la normalizzata e di fondo corretta valori di OD (asse Y, corrisponde alla frazione di siti di legame del recettore occupati) contro il logaritmo della concentrazione di ligando (asse X, log scala _10).
      4. Per stimare il valore di K _D, inserire i dati per il seguente modulo dell'equazione Hill:
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         NOTA: Qui Y indica la frazione dei siti occupati del recettore di legame e Y _max il legame massimo; [L] indica la concentrazione di legante libero e il coefficiente di Hill. Se vi è un solo sito di legame per il ligando, il coefficiente di Hill è n = 1. Per sistemi con più di un ligando sito di legame, l'esposizione vincolanti cooperatività positivo se n> 1, cooperatività negativa se n <1 e non cooperatività se n = 1. la costante di dissociazione microscopica è definito e corrisponde alla metà effettiva concentrazione massima EC ₅₀ ^6. La costante di dissociazione apparente è K _d = (K _D) ^n. Nel caso più semplice in cui n = 1, la dissociazione corrisponde costanti a concentrazione ligando in cui la metà del recettore siti di legame sono occupati e K _d = K _D. Questo modello assume azione di massa vincolante in condizioni di equilibrio, e che soltanto una piccola frazione diil legante aggiunto è legato al recettore, cioè, [L] >> [RL].

Figura 1. saggio diretto ligando-recettore interazione (LRA diretta). Step-by-step di protocollo per LRA diretta. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

2. Concorso ligando-recettore-Interaction Assay (competizione LRA)
   NOTA:. Per un'illustrazione del flusso di lavoro vedi Figura 2 La procedura di concorso LRA segue la stessa procedura come il LRA diretta (rivestimento della piastra, l'incubazione anticorpo, sviluppo targa) ad eccezione di importanti cambiamenti nel legante e peptidi passo oltre. Regolari controlli negativi sono essenziali per questo test. In uno studio di screening precedente 4, il peptide bloccando strapazzate non ha mostrato effetti antagonisti.
   1. Blocco - aggiunta di leganti e peptidi di blocco
      1. Il giorno seguente, togliere la soluzione di rivestimento e lavare la piastra (vedi 2.1.2.1).
      2. Bloccare la piastra rivestita con l'aggiunta di 200 ml di soluzione di BSA 5% in ogni pozzetto ed incubare la piastra per 2 ore a temperatura ambiente.
      3. Preparare i ligandi His-tag ricombinanti (IFNL1-3) ad una concentrazione fissa (2x-20 ng / ml) in PBS.
      4. Preparare il peptide bloccante (vedi tabella 3) con differenti concentrazioni comprese tra 10 nM e 100 pM in PBS per garantire una curva dose-risposta.
         NOTA: Ciò consente successiva determinazione del valore _IC50 per il peptide di blocco. In pozzetti di controllo, aggiungere concentrazione ligando solo fisso senza peptide di ricavare il massimo (100%) vincolante. Nel vuoto, solo aggiungere PBS senza legante o peptide.
      5. Aggiungere 50 ml di ligandi (IFNL1-3) e 50 ml di ogni peconcentrazione ptide ai pozzetti di duplicati.
      6. Incubare la piastra per 2 ore a temperatura ambiente.
   2. Leggere la piastra e analisi dei dati
      NOTA: Il protocollo descritto si basa sul presupposto che il segnale misurato sale dal legame specifico. Potrebbe essere necessario stimare il contributo di legame aspecifico al segnale ma questo è fuori della portata di questo protocollo.
      1. Leggere l'assorbanza (densità ottica, OD) direttamente a 450 nm.
      2. Sottrarre il segnale di fondo ai valori della DO misurati e li normalizza. Trasformare tutti i valori della concentrazione di peptide in scala logaritmica (base 10, log _10).
      3. Tracciare la normalizzata e di fondo corretta valori di OD (asse Y, corrisponde alla frazione di siti di legame del recettore occupati) contro il logaritmo della concentrazione di ligando (asse X, log scala _10).
      4. Per stimare il valore di IC _50, inserire i dati alla seguente equazione:
         
         NOTA: Qui [P] è la concentrazione del peptide ed il pendio della collina. La pendenza Hill descrive la pendenza della curva dose-risposta. La IC ₅₀ corrisponde alla concentrazione dell'inibitore alla quale si osserva il 50% di inibizione del legame tra il ligando e recettore.

Figura 2. Concorrenza ligando-recettore interazione saggio (concorrenza LRA). Step-by-step di protocollo per LRA concorrenza. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Risultati

Le costanti di dissociazione tra INFL1-3 e loro recettore subunità alfa IL28RA sono stati determinati utilizzando il LRA diretta. I risultati sono mostrati in Figura 3: La frazione dei siti di legame occupati è tracciata contro il logaritmo della rispettiva concentrazione di IFN. La trama Scatchard dei dati è mostrata nell'angolo in basso a destra. I risultati illustrano che l'Lra diretta produce una curva di legame, che può essere ulteriormente analizzati pe...

Discussione

ELISA è uno standard e il metodo consolidato per molti laboratori. Abbiamo ulteriormente modificato e migliorato un metodo ^5,7 precedentemente pubblicato. Il protocollo passo-passo dimostrato mostra come può essere utilizzato in modo semplice per determinare i valori K _D di interazioni ligando-recettore. Inoltre, la IC50 di un peptide bloccante che interferisce con l'interazione ligando-recettore può essere determinato.

I principali vantaggi sono la rapida messa ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nunc-Immunoplate (F96 Maxi sorp)	Thermo Scientific	442404	ELISA plate
Sodium carbonate (Na2CO3)	Merck	497-19-8	For ELISA plate coating buffer
Sodium hydrogen carbomnate(NaHCO3)	Merck	144-55-8	For ELISA plate coating buffer
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A7030-100G	5% BSA in PBS for Blocking
rhIL-28Rα/IFNλR1	R&D systems	5260-MR	Recombinant human interlukin-28 Receptor alpha
rhIL-29/IFNλ1	R&D systems	1598-IL/CF	Recombinant human interlukin-29/Carrier free/C-terminal 10-His tag
rhIL-28A/IFNλ2	R&D systems	1587-IL/CF	Recombinant human interlukin-28A/Carrier free/C-terminal 6-His tag
rhIL-28B/IFNλ3	R&D systems	5259-IL/CF	Recombinant human interlukin-28B/Carrier free/C-terminal 6-His tag
6x His Monoclonal antibody (Mouse)	Clontech	631212	Primary antiboy to capture His tagged Ligands
Goat anti-Mouse igG (H+L)	Jackson Immuno Research	115-035-166	Horseradish Peroxidase conjucated secondary antibody
BDoptEIA TMB reagent set	BD Biosciences	555214	ELISA - TMB substrate solution
Sulfuric acid (H2SO4)	Fulka	84720	5 N H2SO4 (Enzyme reaction stop solution)
Synergy/H1 - Microplate reader	BioTeK		ELISA plate reader