Bioprinting Cellularized Costruisce Utilizzando un tessuto-specifici idrogel Bioink

Riepilogo

Descriviamo un insieme di protocolli che, insieme, forniscono un bioink idrogel tessuto-mimando con le quali costrutti di tessuto 3-D funzionali e vitali possono essere bioprinted per l'utilizzo in applicazioni di screening in vitro.

Abstract

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as organ replacements for implantation in patients, and also, when created on a smaller size scale as model "organoids" that can be used in in vitro systems for drug and toxicology screening.

Despite development of a wide variety of bioprinting devices, application of bioprinting technology can be limited by the availability of materials that both expedite bioprinting procedures and support cell viability and function by providing tissue-specific cues. Here we describe a versatile hyaluronic acid (HA) and gelatin-based hydrogel system comprised of a multi-crosslinker, 2-stage crosslinking protocol, which can provide tissue specific biochemical signals and mimic the mechanical properties of in vivo tissues.

Biochemical factors are provided by incorporating tissue-derived extracellular matrix materials, which include potent growth factors. Tissue mechanical properties are controlled combinations of PEG-based crosslinkers with varying molecular weights, geometries (linear or multi-arm), and functional groups to yield extrudable bioinks and final construct shear stiffness values over a wide range (100 Pa to 20 kPa). Using these parameters, hydrogel bioinks were used to bioprint primary liver spheroids in a liver-specific bioink to create in vitro liver constructs with high cell viability and measurable functional albumin and urea output. This methodology provides a general framework that can be adapted for future customization of hydrogels for biofabrication of a wide range of tissue construct types.

Introduzione

Negli ultimi anni, una varietà di tecnologie sono diventate disponibili che risponde alla necessità di fonti alternative di organi funzionali e tessuti cercando di fabbricare o biofabricate, li. Bioprinting è emerso come uno dei più promettenti di queste tecnologie. Bioprinting può essere pensato come una forma di robotica additivo fabbricazione di parti biologiche, che può essere utilizzato per costruire o modello praticabile strutture organo-simili o tessuto-come in 3 dimensioni. ¹ Nella maggior parte dei casi, bioprinting impiega un 3-dimensionale (3 -D) dispositivo di stampa che è diretta da un computer per depositare cellule e biomateriali in posizioni precise, riassumendo così anatomicamente imitano architetture fisiologici. ² Questi dispositivi stampare una "bioink", che può assumere la forma di aggregati di cellule, cellule incapsulate in idrogel o fluidi viscosi, o microcarriers cellulari testa di serie, così come i polimeri privi di cellule che forniscono struttura meccanica o agire come PLA cell-freeceholders. ^3,4 A seguito del processo bioprinting, la struttura risultante può essere maturata in strutture tessuto o organo funzionale, e utilizzati per la sua applicazione finale previsto. ^5,6 Fino ad oggi, un organo completo a misura d'uomo completamente funzionale non è stato stampato, ma rimane l'obiettivo principale a lungo termine della bioprinting ricerca e sviluppo. ² Tuttavia, su piccola scala "organoide" costrutti di tessuto sono attualmente in corso di attuazione in una serie di applicazioni, tra cui la modellazione patologia, lo sviluppo di farmaci, e lo screening tossicologico.

Uno dei principali ostacoli che i ricercatori hanno incontrato nell'applicazione della tecnologia bioprinting è che ben pochi materiali sono stati sviluppati per l'esplicito scopo di bioprinting. Per avere successo in modo efficace in bioprinting, un biomateriale deve soddisfare 4 requisiti fondamentali. Il biomateriale deve avere 1) le proprietà meccaniche appropriate per consentire la deposizione (sia estrusione attraverso un ugello come un gel o un inkjet come una gocciolina), 2) la capacità di mantenere la sua forma come componente di una struttura 3-D dopo la deposizione, 3) la capacità di controllo utente delle 2 caratteristiche precedenti, e 4) ambiente amichevole e solidale una cella a tutti fasi della procedura bioprinting. ⁷ Storicamente, bioprinting lavoro è spesso cercato di impiegare biomateriali tradizionali esistenti in dispositivi bioprinting senza considerazione per la loro compatibilità, invece di progettare un biomateriale per avere le proprietà necessarie per bioprinting e successive applicazioni di post-stampa.

Una varietà di bioinks sono stati sviluppati di recente per migliore interfaccia con l'hardware deposizione e di fabbricazione. sistemi di idrogel standard pongono notevoli problemi perché esistono in generale sia come precursore di soluzioni fluide con insufficienti caratteristiche meccaniche, o idrogel polimerizzati che se stampati possono ostruire gli ugelli o diventano rotto sul processo di estrusione. La nostra squadra, così come OtheRS, hanno esplorato varie formulazioni idrogel per affrontare questi problemi, tra cui la stampa bioprinting sferoide cella in substrati idrogel, ^5,8 cellulare e idrogel filamento di estrusione da tubi microcapillari, ^9-11 estrudibili acido ialuronico (HA) idrogel nanoparticelle -Gold con proprietà di reticolazione dinamiche , ¹² controllo temporale della rigidità idrogel usando fotopolimerizzabile metacrilato HA e la gelatina, ¹³ reticolazione a base di fibrinogeno-trombina, ^14,15 a scambio ionico gel alginato-collagene, ¹⁶ e recentemente rapida polimerizzazione luce ultravioletta (UV) reticolazione iniziati con, ¹⁷

Questi esempi dimostrano la fattibilità di materiali che generano che può venire bioprinted efficace. Tuttavia, in aggiunta all'integrazione con hardware, per generare successo costrutti tissutali vitali e funzionali 3-D, biomateriali devono contenere segnali biochimici e meccanici che aiuti nel mantenimento cellularevitalità e funzionalità. Questi fattori aggiuntivi, profili biochimici e meccanici, possono avere un'influenza significativa sulla funzione di successo di costrutti di tessuto bioprinted.

Sia le cellule e la matrice extracellulare nativa (ECM) sono responsabili di presentare una vasta gamma di molecole di segnalazione come fattori di crescita e altre citochine ad altre celle. La combinazione di questi segnali varia da tessuto a tessuto, ma può essere estremamente potente e influente nella regolazione del comportamento delle cellule e dei tessuti. ¹⁸ Impiegando componenti ECM tessuto-specifici da organi diversi e attuazione come idrogel o come parte di un idrogel è stata esplorata con successo. ^19-21 Questo approccio, che comprende decellularizing un determinato tessuto, polverizzazione, e dissolverla, può essere utilizzato per produrre segnali biochimici tessuto-specifici da qualsiasi tessuto e possono essere incorporati in 3-D costrutti idrogel. ²²

Inoltre,è ampiamente documentato che i tessuti del corpo occupano una vasta gamma di impedenze. ²³ Pertanto, la possibilità di regolare le proprietà meccaniche dei biomateriali, quali il modulo elastico E 'o tranciare modulo elastico G', è uno strumento utile in ingegneria tissutale . Come descritto sopra, il controllo bioink proprietà meccaniche consente biofabrication estrusione-basato usando gel morbido, che può poi ulteriormente manipolato da reticolazione secondaria in un momento successivo, in cui i livelli di modulo elastico possono essere raggiunti che corrisponde a quella del tipo organo bersaglio. Ad esempio, biomateriali possono essere personalizzati per abbinare una rigidità di 5-10 kPa come un fegato nativo, ²³ o abbinare una rigidità di 10-15 kPa come tessuto cardiaco nativo, ^24,25 in teoria aumentare la capacità di questi organoidi di funzionare in un modo simile alle loro controparti tessuto nativo. L'influenza della rigidità dell'ambiente sul fenotipo cellulare è stato explored negli ultimi anni, in particolare rispetto alle cellule staminali. Engler et al. Hanno dimostrato che l'elasticità del substrato aiutato a guidare le cellule staminali mesenchimali (MSC) verso linee con elasticità dei tessuti corrispondente a quello del substrato. ²⁵ Questo concetto è stato ulteriormente esplorato per la differenziazione in muscolo, la funzione cardiaca, fenotipo fegato, staminali ematopoietiche proliferazione cellulare e manutenzione di potenziale terapeutico delle cellule staminali. ^24,26-29 Essendo in grado di sintonizzare un idrogel di diversi moduli di elasticità è una caratteristica importante di un biomateriale che verrà utilizzato per biofabricate costrutti tissutali. ³⁰

Qui si descrive un protocollo che rappresenta un approccio versatile utilizzato nel nostro laboratorio per formulare un sistema idrogel che può essere estruso bioprinted e personalizzata per 1) contenere il profilo biochimico di un particolare tipo di tessuto e 2) mimare il modulo elastico di tale tipo di tessuto . Affrontando questi requisiti, ci proponiamo di provide un materiale che può riassumere le caratteristiche fisico-chimiche e biologiche di in vivo tessuto. ³¹ Il sistema composito idrogel modulare descritta sfrutta un approccio multi-reticolazione per produrre bioinks estrudibili, e permette una reticolazione secondaria per stabilizzare e aumenta la rigidità della prodotti finali per abbinare una vasta gamma di tipi di tessuto. personalizzazione biochimica viene soddisfatta utilizzando componenti ECM tessuto-specifici. A dimostrazione, ci avvaliamo di una varietà specifica di fegato di questo sistema idrogel per Bioprint fegato funzionale costrutti organoide. Il protocollo descritto utilizza un dispositivo bioprinting 3-D personalizzato. In generale, questo protocollo può essere adattato alla maggior parte delle stampanti estrusione-based, parametri di stampa specifici variano notevolmente per ciascun tipo di dispositivo e richiedono test dall'utente.

Protocollo

1. idrogel Bioink formulazioni e Preparazione

1. Al fine di fornire profili biochimici tessuto-specifici, preparare tessuto-specifica ECM digerire soluzioni come descritto in precedenza per il fegato. ²⁰
   Nota: In generale, questo ECM digest comprenderà 40% del volume bioink idrogel finale che viene impiegato. Diverse centinaia di millilitri di soluzione ECM digest possono essere preparati, aliquotati e congelati a -80 ° C per un uso futuro.
2. Prima di idrogel formulazione, sciogliere un fotoiniziatore, 2-idrossi-4 '- (2-idrossietossi) -2-methylpropiophenone, in acqua a 0,1% w / v.
   Nota: I volumi nel range 50-100 ml possono essere preparati in anticipo e conservati al riparo dalla luce a 4 ° C per diversi mesi.
3. Per formare bioinks idrogel, prima sciogliere i componenti del materiale base dalla acido ialuronico (HA) Kit idrogel nella soluzione acqua-fotoiniziatore.
   1. Sciogliere la gelatina tiolati HA e tiolati separatamente in acqua-psoluzione hotoinitiator (passo 1,2) per rendere il 2% w / v soluzioni.
   2. Sciogliere polietilenglicole diacrilato (PEGDA), il reticolante nei kit idrogel, in soluzione acquosa-fotoiniziatore (passo 1.2) per rendere un 8% w / v.
   3. Sciogliere polietilene glicole (PEG) 8-Braccio alchino (10 kDa MW) in soluzione acquosa-fotoiniziatore (passo 1.2) per rendere un 8% w / v.
4. In generale, formare idrogeli utilizzando il seguente schema, anche se la personalizzazione supplementare è possibile.
   1. Unire 4 parti 2% tiolati HA, 4 parti 2% di gelatina tiolati, 1 parte reticolante 1, 1 parte di reticolante 2 con 8 parti soluzione tessuto ECM e 2 parti di terreni di coltura degli epatociti (HCM) (o 10 parti di acqua come un non-tessuto generici idrogel SPECIFICI).
      Nota: Altre modificato HA o gelatina possono essere aggiunti per rendere l'estrusione bioink più agevolmente. Questo è descritto di seguito.
5. Agitare la miscela risultante in alto (velocità 10 su 10) per 10 secondi per miscelare prima dell'uso.
6. L'uso di idrogel bioink
   1. Per l'estrusione o il collaudo bioprinting, trasferire il composto in una cartuccia siringa o della stampante e lasciare reticolare spontaneamente per 30 minuti (fase 1 reticolazione) a 37 ° C.
   2. Per le misure reologiche, trasferire il composto in da 35 mm piastra di Petri e lasciare reticolare per 30 min.
      Nota: La miscela comincia immediatamente reticolare tramite formazione di legami tiolo-acrilato e inizierà ad aumentare di viscosità. La miscela deve essere trasferito in una siringa, cartuccia di stampa, o posizione di destinazione entro 10 min per evitare l'intasamento di una pipetta o una siringa durante il trasferimento.
   3. Quando reticolazione secondario (fase 2) si desidera, irradiare la fase gel 1-reticolati con la luce ultravioletta (365 nm, 18 W / cm ²⁾ per avviare una reazione di polimerizzazione tiolo-alkyne.
      Nota: durata dell'irradiazione dipende dalla superficie del materiale. In generale, un centimetro quadrato di materiale richiede solo 1-2 sec di esposizione ai raggi UV a questo potere UV.

Compatibilità 2. Stampante Test

1. Prima di test di integrazione con i dispositivi bioprinting, caratteristiche di prova di estrusione in panchina laboratorio con semplici test di estrusione usando siringhe standard e piccoli suggerimenti ago calibro (20-30 gauge).
   1. Spingere il bioink attraverso una siringa standard per raggiungere agevolmente filamenti estrusi di idrogel con poche o nessuna urti. Estrusione di linee o modelli semplici è sufficiente a determinare il successo.
2. Per l'integrazione bioprinter, caricare bioink preparati da loro pipettando in cartucce per stampanti, e consentire 30 minuti per il bioink di sottoporsi spontaneamente fase 1 di reticolazione all'interno della cartuccia.
   Nota: Volume di bioink dipende dall'applicazione specifica e deve essere determinato dall'utente. Cartucce per stampanti possono assomigliare o essere siringhe che sono compatibili con il dispositivo bioprinter.
3. Valutare la compatibilità di estrusioneper bioprinting, stampando un motivo semplice utilizzando il bioink. Ad esempio, stampare un reticolo 7 x 7 mm composto da linee parallele. Applicare pressione (pressione pneumatica ad esempio, 20 kPa), mentre la testina di stampa si porta nel piano XY ad una velocità di circa 300 mm / min.
   Nota: i diametri degli ugelli delle testine di varie dimensioni possono essere usati, ma ugelli conici con aperture di diametro 400-500 mM sono ottimali per la stampa sferoidi nell'intervallo 250-350 micron.
   1. Se i materiali estrusi sono nodosi o irregolari, vedere il punto 2.4, o ridurre la quantità di PEGDA per ammorbidire il materiale reticolato fase 1. formulazioni bioink adeguatamente preparato estrudere senza intoppi, permettendo la deposizione precisa nei modelli o architetture desiderati.
      Nota: Le procedure bioprinting uso descritto un dispositivo bioprinting 3-D progettato su misura in casa appositamente per il tessuto costruire la stampa ³² Come tale, i parametri di stampa specifici variano notevolmente per ogni tipo di dispositivo e richiedono testin.g dall'utente.
4. Per migliorare le proprietà di estrusione, non modificato integrare HA e gelatina per le bioinks (1,5 mg / ml e 30 mg / ml, rispettivamente).

3. La convalida da Bioprinting con primari costrutti fegato

1. Preparare 3-D sferoidi fegato cellula primaria per impiccagione metodi Drop come la componente cellulare ³³
   Nota: Bioprinting può essere eseguita senza sferoidi, ma con singole cellule sospese nei bioinks idrogel pure. Sferoidi sono impiegati qui per accelerare le interazioni cellula-cellula e costruire funzionalità. Il numero di sferoidi o cellule impiegate dipende dalla specifica applicazione e deve essere determinato dall'utente. Queste procedure devono essere eseguite in condizioni sterili, utilizzando materiali sterili.
   1. Preparare HCM aggiungendo il contenuto scongelati del kit di componenti supplemento HCM ai media epatociti basale (HBM) e filtraggio sterile.
      1. Scongelare il supplemento componenti delle Nazioni Unitetil liquido.
      2. Aggiungere i componenti supplemento (acido ascorbico, 0,5 ml; albumina sierica bovina [acidi grassi liberi], 10 ml; gentamicina solfato / amfotericina B, 0,5 ml; idrocortisone 21-emisuccinato, 0,5 ml, insulina, 0,5 ml; fattore di crescita epidermico umano ricombinante , 0,5 ml, trasferire, 0,5 ml) a 500 ml HBM.
      3. filtro sterile attraverso un 0,45 micron o 0,22 micron filtro utilizzando un gruppo filtro bottiglia-top o un filtro di punta della siringa.
   2. Determinare la densità cellulare di epatociti primari umani, cellule di Kupffer e cellule stellate contando su un emocitometro dopo ogni tipo di cellula è stato scongelato in base alle istruzioni del fabbricante.
   3. Combinare epatociti primari umani, cellule di Kupffer e cellule stellate in un rapporto 80:10:10 in numero di cellule in mezzi HCM che è stato riscaldato a 37 ° C in una provetta conica.
      Nota: Il volume del supporto da utilizzare dipende dal numero complessivo cella specifica per l'applicazione e deve essere determinata da the utente.
   4. Centrifugare la sospensione cellulare per 5 minuti a 520 xga 20 ° C.
   5. Aspirare il surnatante, lasciando dietro di sé il pellet.
   6. Risospendere il pellet di cellule in mezzi HCM per ottenere una sospensione cellulare contenente 1.000 cellule per 40 mezzi microlitri. Il volume totale dipende dal numero di sferoidi prodotta.
   7. Trasferire la sospensione cellulare a 96 pozzetti formato appesi piastre goccia. Aggiungere un totale di circa 1.000 cellule in ciascun pozzetto in HCM e mantenere a 37 ° C, in 5% CO ₂ per 3 giorni durante i quali formano sferoidi multicellulari.
   8. Raccogliere sferoidi fegato dalla piastra goccia appeso con una pipetta. Trasferire in un tubo da 15 ml sterile.
2. sferoidi fegato Bioprint a specifici fegato idrogel bioink
   1. Preparare una formulazione di fegato ECM contenenti idrogel bioink come descritto al punto 1, impiegando 8% PEGDA e l'8% 8-Braccio PEG alkyne come reticolanti. Utilizzare questa combinazione per la sua capacità di resulting in un idrogel vicino a taglio modulo elastico al tessuto del fegato nativo.
   2. Che i sferoidi depositano sul fondo della provetta conica in cui sono stati collocati nel passaggio 3.1.7. Questo varia in base alle dimensioni e alla densità sferoide, ma in genere si verifica entro 1-2 min. Rimuovere tutti i supporti con attenzione aspirando o con una pipetta.
   3. Trasferire il volume desiderato di soluzione di idrogel bioink preparata al momento per il tubo conico contenente sferoidi. Generalmente, un volume adeguato è del 10% -25% superiore al volume del costrutto 3-D da stampare. pipetta con cautela su e giù per risospendere sferoidi nella soluzione idrogel bioink. Trasferimento in una cartuccia bioprinter utilizzando una pipetta o una pipetta sierologica.
   4. All'interno della cartuccia bioprinter, lasciare che la soluzione di sottoporsi primo stadio di reticolazione (reazione tiolo-acrilato) per 30 min.
      Nota: A seconda delle dimensioni sferoide, la cartuccia può essere necessario lentamente ruotato o può avere bisogno di essere miscelato con i contenutiuna spatola sterile per mantenere sferoidi distribuiti nel bioink durante la fase 1 di reticolazione. Questo è meno di una necessità per bioinks preparati con cellule sospese invece di sferoidi.
      Nota: Dopo la fase 1 di reticolazione, gli utenti hanno una finestra operativa di diverse ore. Tuttavia, si raccomanda di eseguire il processo bioprinting rapidamente per migliorare la vitalità cellulare.
   5. A seguito di fase 1 di reticolazione, utilizzare un dispositivo bioprinting per creare strutture di idrogel desiderati contenenti sferoidi fegato primari (o altre cellule).
      Nota: Questa tecnologia fornisce un sistema per biofabricating un'ampia varietà di strutture. Parametri come volume totale, il numero di cellule o sferoidi, la geometria struttura stampata, e il substrato su cui sono stampati costrutti sono altamente dipendenti dagli obiettivi dell'utente.
   6. Dopo la deposizione nella configurazione desiderata, amministrare luce UV per 2-4 secondi per avviare il meccanismo di reticolazione secondaria, stabilizzando la constructs e aumentando la rigidità al livello desiderato.
      Nota: La concentrazione di PEG-alchino, e quindi la densità di reticolazione finale complessiva, controlla primariamente la rigidità costrutto finale.
   7. Ripetere la 3.2.4 e 3.2.5 passaggi per creare costrutti multistrato.

Risultati

Quando le procedure sopra descritte vengono seguite correttamente, idrogel dovrebbero contenere un profilo biochimico specifico per il tipo di tessuto bersaglio, ²⁰ permettono un elevato grado di controllo su bioprinting e modulo elastico finale, ³⁴ e supportano cellule vitali funzionali nei costrutti tissutali.

idrogel Personalizzazione
Per meglio fegato nativo mimica, la bioink i...

Discussione

Ci sono diverse componenti che sono fondamentali per prendere in considerazione quando si cerca di biofabricate 3-D costrutti di tessuto, per l'uso eventuale negli esseri umani o per applicazioni di screening in vitro. Impiegando i componenti cellulari appropriati determina il potenziale funzionalità end, mentre il dispositivo biofabrication si determina la metodologia generale per raggiungere il costrutto finale. Il terzo componente, il biomateriale, è altrettanto importante, in quanto serve un doppio ru...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hyaluronic acid	Sigma	53747
Gelatin	Sigma	G6144
2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone	Sigma	410896
Hyaluronic acid and gelatin hydrogel kit (HyStem-HP)	ESI-BIO	GS315	Kit contains the components Heprasil (thiolated and heparinized hyaluronic acid), Gelin-S (thiolated gelatin), and Extralink (PEGDA)
PEG 8-Arm Alkyne, 10 kDa	Creative PEGWorks	PSB-887
Primary human hepatocytes	Triangle Research Labs	HUCPM6
Primary human liver stellate cells	ScienCell	5300
Primary human Kupffer cells	Life Technologies	HUKCCS
Hepatocyte Basal Media (HBM)	Lonza	CC-3199
Hepatocyte Media Supplement Kit	Lonza	CC-3198	HCM SingleQuot Kits (contains ascorbic acid, 0.5 ml; bovine serum albumin [fatty acid free], 10 ml; gentamicin sulfate/amphotericin B, 0.5 ml; hydrocortisone 21-hemisuccinate, 0.5 ml; insulin, 0.5 ml; human recombinant epidermal growth factor, 0.5 ml; transferring, 0.5 ml)
Triton X-100	Sigma	T9284	Other manufacturers are ok.
Ammonium hydroxide	Fischer Scientific	A669	Other manufacturers are ok.
Fresh porcine cadaver tissue	n/a	n/a
Lyophilizer	any	n/a
Freezer mill	any	n/a
Bioprinter	n/a	n/a	The bioprinter described herein was custom built in-house. In general, other devices are adequate provided they support computer controlled extrusion-based printing of hydrogel materials.
Hanging drop cell culture plate	InSphero	CS-06-001	InSphero GravityPlus 3D Culture Platform