Usando Tomoauto: un protocollo per High-throughput automatizzato Cryo-elettrone Tomografia

Riepilogo

Vi presentiamo un protocollo su come utilizzare high-throughput crio-elettroni tomografia per determinare alta risoluzione in strutture in situ di macchine molecolari. Il protocollo permette di grandi quantità di dati da elaborare, evita i colli di bottiglia comuni e riduce i tempi di inattività delle risorse, permettendo all'utente di concentrarsi su importanti questioni biologiche.

Abstract

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native context at a molecular level. The technique involves initially preserving the sample in its native state by rapidly freezing the specimen in vitreous ice, then collecting a series of micrographs from different angles at high magnification, and finally computationally reconstructing a 3-D density map. The frozen-hydrated specimen is extremely sensitive to the electron beam and so micrographs are collected at very low electron doses to limit the radiation damage. As a result, the raw cryo-tomogram has a very low signal to noise ratio characterized by an intrinsically noisy image. To better visualize subjects of interest, conventional imaging analysis and sub-tomogram averaging in which sub-tomograms of the subject are extracted from the initial tomogram and aligned and averaged are utilized to improve both contrast and resolution. Large datasets of tilt-series are essential to understanding and resolving the complexes at different states, conditions, or mutations as well as obtaining a large enough collection of sub-tomograms for averaging and classification. Collecting and processing this data can be a major obstacle preventing further analysis. Here we describe a high-throughput cryo-ET protocol based on a computer-controlled 300kV cryo-electron microscope, a direct detection device (DDD) camera and a highly effective, semi-automated image-processing pipeline software wrapper library tomoauto developed in-house. This protocol has been effectively utilized to visualize the intact type III secretion system (T3SS) in Shigella flexneri minicells. It can be applicable to any project suitable for cryo-ET.

Introduzione

III sistemi di secrezione di tipo (T3SS) sono fattori di virulenza essenziali per molti patogeni Gram-negativi. Il injectisome, noto anche come il complesso dell'ago, è la macchina centrale T3SS richiesto per traslocazione diretta di proteine ​​effettrici del batterio in cellule ospiti eucariotiche ^{1, 2.} Il injectisome comprende un ago extracellulare, un corpo basale, e un complesso citoplasmatico anche noto come il complesso di smistamento ^3. Precedenti studi hanno chiarito le strutture 3-D di injectisomes purificati da Salmonella e Shigella, insieme con le strutture atomiche delle principali proteine ​​del corpo basale ^{4, 5.} Recente in strutture in situ di injectisomes da Salmonella, Shigella, e Yersinia sono stati rivelati da crio-ET ^{6 , 7.} Tuttavia, il complesso citoplasmatico, essenziale per la selezione effettrici e gruppo aghi, non è stata visualizzata in quelle strutture.

Cryo-ET è il MOSt tecnica adatta per l'imaging macchinario molecolare presso risoluzione nanometrica all'interno del suo contesto cellulare nativo (in situ). Tuttavia, la risoluzione ottenibile da crio-ET è limitata dalla spessore del provino. Per superare l'inconveniente, abbiamo ripreso injectisomes intatti in una virulenta Shigella flexneri ceppo che è stato geneticamente modificato per produrre minicells abbastanza sottili per crio-ET. Un altro limite di crio-ET è la sensibilità del campione alla radiazione indotta dal fascio di elettroni, che distrugge rapidamente le informazioni ad alta risoluzione nel campione. Come risultato, estremamente basse dosi sono utilizzati per le singole tilt-immagini in modo che una dose adatta può essere distribuito tra l'inclinazione completa serie. Questo riduce notevolmente il rapporto segnale-rumore (SNR) nella ricostruzione finale, il che rende difficile distinguere le caratteristiche strutturali del soggetto dalla grande quantità di rumore nel tomogramma e limita la risoluzione che può essere ottenuta da cryo- ET. Conventielaborazione delle immagini onal quali Fourier e filtri dello spazio reale e giù campionamento può essere utilizzato per aumentare il contrasto, ma a scapito di filtrare gran parte delle informazioni ad alta risoluzione. Recentemente, sub-tomogram media ha consentito di aumentare notevolmente il SNR e successivamente la risoluzione finale in alcuni casi a livelli sub-nanometri ^{8, 9.} Un'analisi più dettagliata dei complessi è reso possibile da computazionalmente estraendo migliaia di sub-tomogrammi contenenti le aree di interesse dalle tomografie originale e quindi allineando e media i sub-tomografie per determinare in strutture complesse in situ con maggiore SNR e una risoluzione più alta. Questi metodi possono essere integrati con approcci genetici per fornire ancora maggiori intuizioni in assemblee macromolecolari e le loro conformazioni dinamici nel contesto cellulare nativo.

In generale, decine o centinaia di migliaia di sub-tomogrammi devono essere mediati per determinare altostrutture -Risoluzione in situ. L'acquisizione di un numero sufficiente di tilt serie necessaria per produrre questo grande numero di sotto-tomografie diventa rapidamente un collo di bottiglia. Il conseguente inclinazione della serie sono spesso risente spostamento fascio indotta, fase contraccolpo, e ingrandimento, rotazione e inclinazione difetti, che deve essere risolto per portare l'inclinazione serie in allineamento prima ricostruzione. La serie inclinazione è tipicamente allineato tracciando marker fiduciali oro, che sono tradizionalmente selezionabili manualmente attraverso l'ispezione del tilt-serie, causando ancora un altro collo di bottiglia. Molti pacchetti software sono stati sviluppati per automatiche di acquisizione tilt-serie attraverso microscopi elettronici controllati da computer ^{10, 11, 12,} allineamento tilt-serie e la ricostruzione ^{13, 14} e sub-tomogramma media ^15-18. Poiché questi pacchetti gestiscono operazioni discreti nel flusso di crio-ET, diventa desiderabile costruire un livello più elevato di astrazione nel processo per systemacamente snellire l'intero schema in una singola pipeline. Pertanto, abbiamo sviluppato una libreria wrapper software "tomoauto" progettato per organizzare una serie di questi pacchetti in una singola unità semi-automatico, consentendo funzionamento semplice utente, pur mantenendo la configurazione completa di ciascun componente in modo centralizzato. La biblioteca è open-source, ben documentato, continuamente sviluppato e liberamente disponibili per l'uso, lo sviluppo su misura o una maggiore integrazione per mezzo di un codice sorgente remota repository online (http://github.com/DustinMorado/tomoauto).

Questo high-throughput crio-ET gasdotto è stato utilizzato per visualizzare injectisomes intatti a S. minicells flexneri. Un totale di 1.917 tomografie sono stati generati utilizzando questo metodo, rivelando una ad alta risoluzione nella struttura situ della macchina intatta tra cui la piattaforma di smistamento citoplasmatica determinato dal sub-tomogramma media ^19. Insieme alla modellistica molecolare di wild-type e mmacchine utant, la nostra pipeline high-throughput fornisce una nuova strada per comprendere la struttura e la funzione del injectisome intatto nel contesto cellulare nativo.

Protocollo

1. Minicell Preparazione

1. Per rendere S. minicells flexneri, trasformano 1 ml di plasmide pBS58, che esprime costitutivamente geni divisione cellulare Escherichia coli ftsQ, FTSA, e FtsZ da un basso copy spectinomicina resistente plasmide in 5 microlitri electrocompetent streptomicina resistente sierotipo 5a (M90T-Sm), le cellule di elettroporazione a 2,5 kV per 5 msec a 1 mm cuvette.
2. Conservare i campioni minicell a -80 ° C in 15% glicerolo in una provetta da 1,5 ml criogenico. Quando si è pronti per l'uso, raschiare circa 5 ml di cellule dalla provetta unthawed con un puntale e sospendere le cellule in 4 ml di brodo di soia trittico con spectinomicina aggiunto a 100 mg / ml di concentrazione. Crescere O / N a 37 ° C.
3. Pipettare 2 ml di cultura da 1,2 in 200 ml di brodo di soia trittico con spectinomicina ancora aggiunti a 100 mcg / ml concentrazioni. Crescere a 37 ° C per fase di log in ritardo.
4. Per arricchire minicells, centrifuga200 ml di coltura da 1,3 a 1000 xg per 5 min. Versare con cautela il surnatante in una nuova provetta da centrifuga e centrifugare a 20.000 g per 10 min. Versare con cautela e scartare il surnatante, e mescolare delicatamente il pellet con il liquido restante con un puntale e trasferire circa 100 ml di miscela di pellet in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga.

2. EM griglia Preparazione

1. Posizionare un lato pellicola di carbonio da 200 maglie carbonio griglia di rame R2 / 2 bucata su un vetrino.
   NOTA: A / 2 griglia 200 mesh R2 è scelto per massimizzare il numero di tilt-serie che può essere impostato per acquisire in un unico quadrato della griglia supportando allo stesso tempo il campione e posizionando il bordo della pellicola di carbonio nel campo della telecamera Allo ingrandimento desiderato. Griglie maglie più fini e film di carbonio bucata più piccoli come R1.2 / 1.3 400-rete può essere utilizzato per i campioni imaged a maggiore ingrandimento; più grandi film di carbonio bucata quali R3.5 / 1 200-maglia può essere usod per campioni ripreso a ingrandimento minore o se la micrografia non deve contenere il bordo carbonio e carbonio film bucata con spaziatura più grande come R1 / 4 200 mesh può essere usato per aiutare con l'allineamento della fase alla zona di interesse e proteggere aree da sovraesposizione nella messa a fuoco e il monitoraggio di routine.
2. Posizionare il vetrino sulla piattaforma in un dispositivo di scarica a bagliore.
   NOTA: Usiamo un dispositivo in-casa in cui un anodo e la piattaforma è stato lavorato in un essiccatore a vuoto ed è alimentato da un generatore ad alta frequenza. Dopo aver creato il vuoto, collegare la sonda generatore ad alta frequenza per l'anodo e accendere la sonda per 1 min per Glow Discharge griglia. Il tempo necessario per Glow Discharge rete può variare da pochi secondi a un minuto. Variando il tempo di scarica luminescente può essere utilizzato per diagnosticare problemi di concentrazione del campione e le griglie che appaiono a secco senza ghiaccio vitreo.
3. Rimuovere la griglia con un set di pinze, e bloccare le pinze chiuse con un b elasticoe.
4. Aggiungere 100 ml di soluzione di 10 nm oro colloidale per la provetta con le minicells preparati in 1.4 e mescolare muovendo delicatamente il tubo con un dito. Con un nuovo posto pipetta 4 microlitri della miscela sulla griglia preparata in 2.2.
   NOTA: oro colloidale è disponibile in una varietà di formati e si deve prestare attenzione che la dimensione del oro è maggiore di 5 pixel date le dimensioni dei pixel delle micrografie da trattare con l'ingrandimento acquisito, pur non essendo troppo grande per caratteristiche oscure di interesse.
5. Preparare l'apparato tuffo antigelo; riempire il contenitore esterno di congelamento con azoto liquido e poi riempire la camera interna con etano liquido. Fissare la pinza con griglia per lo stantuffo e bloccare lo stantuffo nella posizione sollevata.
   NOTA: Vedere Iancu et al ²⁰ per un protocollo che descrive l'uso di un apparato affondamento freeze commerciale..
6. Tamponare la griglia toccando attenzione un pezzo di carta da filtro a tegli goccia del campione fino menisco tra le separa griglia e carta da filtro e la traspirazione sulla carta da filtro ferma, quindi rilasciare immediatamente lo stantuffo, il congelamento della griglia. Rimuovere con cautela la pinza dal stantuffo e posizionare la griglia in un supporto griglia.
7. Preparare la stazione di trasferimento Cryo-EM riempiendo il contenitore pompa zona di carico e l'assorbimento di azoto liquido. Una volta che la zona di carico è al liquido posto temperatura dell'azoto titolare griglia e una cartuccia esemplare microscopio nella zona di carico.
8. Rimuovere con attenzione l'anello di bloccaggio, che può essere un piccolo anello di bloccaggio a vite sui microscopi Polara precedenti o una clip anello C-stile sui modelli successivi; posizionare la griglia EM nella cartuccia con pinze e quindi ricollegare delicatamente la ghiera indietro sulla cartuccia di fissaggio della griglia.
9. Rimuovere il supporto del campione multiplo dal microscopio e fissarlo alla stazione di trasferimento. Posizionare la cartuccia del campione nel supporto con pinze Cartuccia Unad retrarre il supporto dalla zona di carico e trasferire il portacampioni multipli al microscopio.
   NOTA: Vedere Chen ed altri ²¹ per un protocollo visivo dettagli 2,1-2,9..

3. Alta produttività automatizzata Tilt-Series Collection

1. Raccolta di basso ingrandimento Maps
   1. Aprire una nuova finestra di navigazione cliccando su 'Open' nel menu 'Navigator' di SerialEM ¹⁰ (http://bio3d.colorado.edu/SerialEM)
   2. Trova quadrati della griglia che contengono condizioni di imaging accettabili (cioè, ghiaccio sottile, nessuna contaminazione, oggetto di interesse) utilizzando lo schermo fluorescente a basso ingrandimento (~ 2,300X per il campione Minicell).
      NOTA: [Facoltativo:. Questa fase può essere automatizzato con SerialEM dal montaging l'intera griglia, ma può essere più veloce per selezionare semplicemente alcune aree manualmente]
   3. Regolare la fase di altezza eucentrico inclinando il titolare del campione a 50 ° quindi regolarelo z-altezza fino a quando la traduzione xy del palco è minima tra i punti di vista inclinato e ruotato.
   4. Spostare al centro della piazza della griglia e fare clic sul pulsante 'Aggiungi tappa Pos' nella finestra Navigator per memorizzare la posizione attuale fase.
   5. Continuare passi 3.1.1-4 sopra fino a quando sono stati salvati tutti i posti quadrati della griglia palco accettabili.
   6. Aprire un nuovo file di montaggio MRC cliccando su 'Nuovo montage' nel menu 'File'. Nella finestra di dialogo di installazione in sequenza che si apre, selezionare un numero di pezzi in X e Y che acquisirà tutta la piazza della griglia (ad esempio, 10 x 10 per una griglia di 200 rete standard). Utilizzare un alto binning come 8 e selezionare il 'Sposta fase Invece di spostamento dell'immagine' e 'Vai correlazioni usate per allineare pezzi' pulsanti di opzione.
   7. Nella finestra di Navigator fare clic sulla prima posizione di fase e impostare da acquisire selezionando la casella 'Acquire'. Ripetere questa operazione per ciascuna posizione fase della finestra del navigatore.
   8. Aprire il Navigatore Acquire dialogo facendo clic su 'Acquire a Punti' nel menu 'Navigator'. Controllare l''immagine della mappa Acquire' e casella 'eucentricity ruvida' e fare in modo che tutte le altre caselle di controllo siano deselezionate. Fare clic su 'Procedi' per raccogliere un montaggio in ogni posizione fase.
2. Tilt-series Acquisizione
   1. Nella finestra del Navigatore selezionare una delle carte acquisite e fare clic sul pulsante 'Carica mappa'.
   2. Nella finestra del navigatore cliccare su 'Aggiungi punti "pulsante e selezionare i punti nella mappa in cui acquisire un tilt-series. Quindi fare clic sul 'smettere di aggiungere punti "pulsante. Ripetere per ogni mappa raccolti.
   3. Nel menu Fotocamera selezionare "Parametri" e definire i parametri per le modalità di messa a fuoco, di sperimentazione, e Record. [Opzionale:. Dose-frazionata i dati possono essere specificati nei parametri per la modalità Record]
   4. Selezionare un punto nella finestra Navigatore e controllare il 'Tilt-Series9; casella di controllo. Nella finestra di dialogo Imposta Tilt-Series che si apre selezionare i parametri desiderati per la raccolta di inclinazione della serie. Ripetere l'operazione per il resto dei punti selezionati nella finestra del Navigatore, ma non selezionare le mappe.
   5. Nel menu Navigator di nuovo selezionare il 'Acquire a punti'. Nella Navigator Acquisisci finestra scegliere 'Riallineare alla voce', messa a fuoco automatica 'e' eucentricity Ruvido 'come operazioni preliminari, e selezionare' Acquire serie tilt 'come il compito primario, e selezionare' Chiudere le valvole delle colonne di fine 'per chiudere la colonna quando tutto dei punti sono stati raccolti. Al momento di procedere un'inclinazione serie saranno raccolti in ogni punto in ogni mappa.

4. Alto-throughput automatizzata Tilt-series di elaborazione e ricostruzione Utilizzando Tomoauto

1. Correzione di movimento del fascio-indotta nei dati dose-frazionati [opzionale]
   NOTA: Tomoauto utilizza MOTIONCORR ²² (http://cryoem.ucsf.edu/software/driftcorr.html) per rimuovere il movimento fascio indotta da micrografie di dose frazionata. NOTIONCORR ¹⁶ deve essere installato sul sistema.
   1. Con l'inclinazione della serie originale, il registro di output da SerialEM ¹⁰ e le singole immagini di dose-frazionata tutto nella directory di lavoro corrente, in un terminale eseguire il comando:
      dose_fractioned_to_stack
      è il nome del tilt-serie da elaborare.
2. Allineamento e Ricostruzione di Tilt-series
   NOTA: Tomoauto di default usa IMOD ¹³ (http://bio3d.colorado.edu/imod/) per gestire tilt-serie generazione del modello fiduciale automatizzato, l'allineamento, la determinazione della funzione di trasferimento di contrasto (CTF), ^CTF-23 la correzione, e ricostruzione. In alternativa, gli utenti hanno la possibilità di tomoauto per usare RAPTOR ²⁴ (incluso nel IMOD) per automatizzata generazione del modello fiduciale, CTFFIND4 ²⁵ (http://grigoriefflab.janelia.org/ctf) per determinare la CTF, e tomo3d ²⁶ (https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3d) per la ricostruzione o in qualsiasi combinazione di pacchetti software per configurazione. Questa configurazione, così come i parametri disponibili in ogni pacchetto è gestito da un file di configurazione globale che può essere modificato per soddisfare i valori più comunemente utilizzati in un laboratorio mentre i file di configurazione locali possono anche essere creati per i parametri di dettaglio utilizzati per uno specifico esemplare, di raccolta impostare o individuale di inclinazione della serie. Tutti i pacchetti che desiderano essere utilizzati devono essere installati sul sistema.
   1. Con l'inclinazione della serie nella directory di lavoro corrente, in un terminale eseguire il comando
      tomoauto --CTF --mode = align
      è l'inclinazione della serie per essere elaborati e è il Diameter dei marcatori di riferimento nel nanometri. Questo comando allineerà e stimare la CTF dell'inclinazione serie automaticamente. È possibile saltare elaborazione CTF rimuovendo l'opzione --CTF dal comando.
   2. Controllare l'inclinazione-serie allineata visivamente per eventuali errori evidenti nella lavorazione di allineamento e ispezionare la CTF stimato eseguendo i comandi:
      3dmod .ali
      submfg _ctfplotter.com
      rispettivamente, dove è il nome del tilt-serie senza suffisso. Controllare anche l'uscita del comando tomoauto vedere l'errore medio residuo generato dalla allineamento, che è una statistica quantitativa della qualità dell'allineamento.
   3. Dato un allineamento accettabile procedere lavorazione eseguendo il comando:
      tomoaua --CTF --mode = ricostruire
      con le stesse sostituzioni utente come in 4.2.1. Questo comando correggerà la CTF, cancellare i marker fiduciali dalla inclinazione della serie e calcolare la ricostruzione. Anche in questo caso l'elaborazione CTF può essere saltata come al punto 4.2.1.
   4. [opzionale] Per saltare la fase di ispezione visiva e automatizzare completamente l'elaborazione e la ricostruzione eseguire il comando
      tomoauto --CTF
   5. [opzionale] Per utilizzare una configurazione locale specifica, consultare la documentazione tomoauto su come generare un file di configurazione locale, e poi eseguire il comando
      tomoauto [opzioni] -L
      dove è il nome del locale confil file della configurazione della.

5. Sub-tomogramma Averaging

NOTA: Usiamo il pacchetto i3 ¹⁵ (http://www.electrontomography.org/) per elaborare esperimenti di calcolo della media sub-tomogramma, ma il protocollo descritto si applica generalmente alla maggior parte disponibili sub-tomogramma esperimenti processo software media packages16to sub-tomogram delle medie, tuttavia il protocollo descritto si applica generalmente alla maggior parte dei pacchetti software media disponibili sub-tomogramma ^16-18.

1. Con il tomogramma ricostruito nella directory di lavoro corrente aprire il tomogramma per il prelievo delle particelle eseguendo il comando:
   tomopick .rec
   dove è come in 4.2.2. Nella finestra che si apre con il tasto sinistro del mouse per fare clic sul primo corpo basale e poi la punta dell'ago per selezionare un injectisome e utilizzare i tasti freccia su e giù per riff attraverso le fette della tomografiam. Seleziona tutti injectisomes visibili in questo modo. Ciò memorizza le coordinate in un file di testo che definiscono l'asse longitudinale della struttura così come stima due dei tre angoli di Eulero che descrive l'orientamento della struttura.
2. Estratto computazionalmente 400 ³ cubetti di voxel del tomogramma centrato nel punto centrale dell'asse lungo definito eseguendo il comando:
   clip di ridimensionamento -cx -cy -cz -ix 400 -iy 400 -iz 400
   .rec _001.mrc
   dove , , sono le coordinate del punto medio della struttura e è come in 4.2.2. La dimensione del cubo estratto dovrebbe variare la struttura e l'ingrandimento utilizzato, e dovrebbe essere sufficientemente grande da includere adeguatamente la struttura di interesse, che per questo esempio è di 400 ³ voxel.
3. Down-campione (bin) il sub-tomogramma di un fattore di quattro per ridurre il tempo di calcolo per allineamento iniziale eseguendo il comando:
   binvol -b 4 _001.mrc _001.bin4.mrc
   dove è come in 5.2.
4. Applicare la determinata angoli di Eulero a sub-tomogrammi e calcolare la media globale per produrre il modello iniziale per eseguire il comando.
   I3totsum.sh
5. Allineare e classificare down-campione sotto-tomogrammi utilizzando una maschera classificazione binaria dell'area citoplasmatica. Eseguire sub-tomogramma media nello spazio di Fourier per ridurre al minimo i mancanti manufatti cuneo caratteristici della tomografia. Per binning 4 dati, si prega di utilizzare SAMPFACT = "4 4 4".
   i3mramsacls.sh
6. Ripetere il punto 5.5 con sub-tomogrammi down-campionati di un fattore di due (SAMPFACT = &# 34; 2 2 2 ") e ancora una volta con i dati originali (SAMPFACT =" 1 1 1 ").
   i3mramsacls.sh

Risultati

Campioni di minicells S. flexneri stati raccolti e trattati come indicato in figura 1 utilizzando tomoauto schema seguente pipeline descritto nella figura 2. Tilt-series sono stati raccolti utilizzando SerialEM ^10, che permette di high-throughput acquisizione tilt serie nei punti designati da parte dell'utente su mappe montaggio a basso ingrandimento (Figura 3). Micrografie sono...

Discussione

Il metodo di alto-rendimento descritto qui ci ha permesso di elaborare 1.917 crio tilt-serie e produrre oltre 4.500 sub-tomogrammi del intatto S. flexneri injectisome ^19. I dati raccolti hanno portato alla caratterizzazione dettagliata di in situ injectisome, tra cui il citoplasmatica di ordinamento complesso. Il metodo è stato utilizzato anche per visualizzare varie cellule mutanti con specifico delezione di componenti proteiche putativi, che ha contribuito a chiarire la composizi...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glycerol	Sigma-Aldrich	G9012
Tyrptic Soy Broth	Sigma-Aldrich	22092
Spectinomycin	Sigma-Aldrich	S0692
Electroporation Apparatus	Bio-rad	165-2100
1 mm Cuvette	BTX	45-0124
1.5 ml Cryogenic Tube	Thermoscientific	5000-1020
1.5 ml Microcentrifuge Tube	Sigma-Aldrich	Z336769
Holey Carbon Grids	Quantifoil (Electron Microscopy Sciences)	Q2100CR2	R2/2 200 Cu
Glow Discharge Device	In-House		Commercial Alternative Available
Vacuum Desiccator	Sigma-Aldrich	Z119016	Used in In-House Glow Discharge Device
High-Frequency Generator	Electro-Technic Products	BD-10A	Used in In-House Glow Discharge Device.  CAUTION: This device generates high voltages.
Centrifuge
Forceps	Dumont (Electron Microscopy Sciences)	72705-D	Style 5 Anti-magnetic
Colliodal Gold	Aurion		BSA 10nm
Filter Paper	Whatman		#2
Ethane	Matheson Tri-Gas	UN1035
Nitrogen	Matheson Tri-Gas	UN1977
Plunger Device	In-House		Commercial Alternative Available
Cryogenic Grid Storage Box	Electron Microscopy Sciences	71166-30
Transmission Electron Microscope	FEI		Tecnai Polara F30 (300 KeV)
Direct Detection Device Camera	Gatan		K2 Summit
Tomogram Acquisiton Software	SerialEM		http://bio3d.colorado.eud/SerialEM Alternatives: UCSF Tomography, Leginon, FEI Batch Tomography
Beam-induced Motion Correction Software	MOTIONCORR		http://cryoem.ucsf.edu/software/driftcorr.html Requires >2GB Nvidia GPU
Tilt-Series Alignment Software	IMOD		http://bio3d.colorado.edu/IMOD Alternatives: XMIPP, Protomo
Automatic Fiducial Marker Modelling Software	IMOD		Alternatives: RAPTOR (Included in IMOD0 (Usable in tomoauto)
CTF Determination Software	IMOD		Alternatives: CTFFIND http://grigoriefflab.janelia.org/ctf (Usable in tomoauto)
Tilt-Series Reconstruction Software	tomo3d		https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3d Alternatives: IMOD, XMIPP http://xmipp.cnb.csic.es , Protomo
Tilt-Series Automated Processing Software	tomoauto		https://github.com/DustinMorado/tomoauto
Particle Picking Software	i3		http://www.electrontomography.org Alternatives: IMOD
Subvolume Averaging Software	i3		Alternatives: PEET http://bio3d.colorado.edu/PEET, Dynamo https://dynamo.bioz.unibas.ch , PyTom http://pytom.org