Il completo ed aggiornato "Rotifero Metodo Polyculture" per l'allevamento Prima Zebrafish Feeding

Riepilogo

Larval zebrafish are adapted to feed on zooplankton. It is possible to capitalize on this natural feature in the laboratory by growing first feeding fish together in the same system with live saltwater rotifers. This "polyculture" strategy promotes high growth and survival with minimal labor and disturbance to the larvae.

Abstract

The zebrafish (Danio rerio) is a model organism of increasing importance in many fields of science. One of the most demanding technical aspects of culture of this species in the laboratory is rearing first-feeding larvae to the juvenile stage with high rates of growth and survival. The central management challenge of this developmental period revolves around delivering highly nutritious feed items to the fish on a nearly continuous basis without compromising water quality. Because larval zebrafish are well-adapted to feed on small zooplankton in the water column, live prey items such as brachionid rotifers, Artemia, and Paramecium are widely recognized as the feeds of choice, at least until the fish reach the juvenile stage and are able to efficiently feed on processed diets. This protocol describes a method whereby newly hatched zebrafish larvae are cultured together with live saltwater rotifers (Brachionus plicatilis) in the same system. This polyculture approach provides fish with an "on-demand", nutrient-rich live food source without producing chemical waste at levels that would otherwise limit performance. Importantly, because the system harnesses both the natural high productivity of the rotifers and the behavioral preferences of the fish, the labor involved with maintenance is low. The following protocol details an updated, step-by-step procedure that incorporates rotifer production (scalable to any desired level) for use in a polyculture of zebrafish larvae and rotifers that promotes maximal performance during the first 5 days of exogenous feeding.

Introduzione

Il pesce zebra (Danio rerio) è un preminente animale da laboratorio utilizzato in un numero crescente di discipline scientifiche, compreso ma non limitato alla genetica dello sviluppo, la tossicologia, il comportamento, l'acquacoltura, la biologia rigenerativa, e la modellazione di molte malattie umane ^{1 - 5.} Anche se la specie è relativamente facile da mantenere in laboratorio, ci sono una serie di problemi di gestione associati con la loro cultura ^6. Il più importante di questi è allevamento larvale, soprattutto quando il pesce prima comincia ad alimentare a seguito di inflazione della vescica gas ^7. In normali, condizioni controllate, questo evento si verifica dello sviluppo a ~ 5 giorni dopo la fecondazione (DPF), con i seguenti 3 - 5 giorni di crescita particolarmente critici ^7. La difficoltà tecnica centrale durante questa fase è quello di soddisfare adeguatamente le esigenze nutrizionali della prima larve alimentazione - articoli mangimi devono essere di dimensioni appropriate, Digestible, attraente, e disponibile su una base quasi continuo, senza creare eccessivi sprechi in vasche di coltura. Storicamente questo è stato realizzato tipicamente fornendo numerose piccole quantità di mangime per pesci in vasche, insieme con ^8,9 scambio dell'acqua routine. Mentre questi metodi sono in una certa misura di successo, sono inefficienti, richiedono ingressi del lavoro elevati, e restituiscono solo variabili e tassi limitati di crescita e la sopravvivenza ^10.

In natura, le larve si nutrono di pesce zebra presumibilmente abbondante piccolo zooplancton presente nella colonna d'acqua ^11. Per questo motivo, i protocolli larviculture che incorporano i feed live come Paramecium, rotiferi, Artemia e sono in genere più efficiente ^7. Nel 2010, le migliori e co-autori hanno dimostrato che era possibile coltivare zebrafish larvale in acqua salmastra statica con rotiferi acqua salata per i primi 5 giorni di alimentazione esogena ^12. Questo approccio, che sfruttarees l'elevata produttività naturale delle culture di rotiferi a fornire ampio, preda altamente nutrienti senza inquinare l'acqua, rendimenti molto elevati tassi di crescita delle larve e la sopravvivenza con il contributo di lavoro basso ^12,13. Negli ultimi anni, un numero crescente di laboratori di tutto il mondo hanno adottato varianti di questo protocollo, e molti sono ora coltura rotiferi in modo continuo per supportare i sistemi vivaio ^14.

Nel corso degli ultimi anni, sia per i metodi di rotiferi / policoltura zebrafish e la produzione rotiferi sono stati raffinati e migliorato per diventare più standardizzati e facilmente scalabile. Questo articolo fornisce istruzioni passo-passo per 1) la produzione rotiferi continuo e robusto e 2) l'istituzione del / sistema di policoltura zebrafish rotifero utilizzato per sostenere una crescita robusta dei pesci per i primi 5 giorni di alimentazione esogena.

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Protocollo

1. Rotifer Cultura

1. I componenti di base di un sistema di coltura utilizzando un Vessel 100 L Cultura
   1. Raccogliere tutti i componenti per l'installazione coltura di rotiferi. La configurazione coltura di rotiferi è costituito da un recipiente di coltura (CV) a crescere i rotiferi; una nave simile a mantenere rotiferi feedout (feedout vaso cultura, FCV); un vaso a fondo tondo cova (feed Reservoir, FR) per la conservazione della miscela di alimentazione alghe (AFM); una riserva d'aria (AS) per aerare il CV, FCV e la FR; una pompa peristaltica con un temporizzatore di dosaggio (PMT) per controllare la consegna dei mangimi alghe nel CV e FCV; e un filtro antiparticolato filo (FPF) che si trova all'interno del curriculum.
      NOTA: L'elenco completo delle forniture e dei componenti è previsto nella lista dei materiali.
2. Configurazione
   1. Elevare il CV e FCV su un supporto o un tavolo in modo che le culture possono essere facilmente raccolte tramite uno scarico montaggio in un cont collezioneAiner (Figura 1). Utilizzare tubi flessibili di alimentazione dell'aria per collegare i AS ad una lunghezza di tubo rigido in ciascun recipiente di coltura. Assicurarsi che il tubo è abbastanza lungo per fornire aria al fondo del CV o FCV.
   2. Utilizzare una linea di aria piccola capacità per collegare gli AS ad una lunghezza di tubo rigido che si estende fino al fondo della FR che contiene l'AFM. Installare una valvola in ciascuna linea d'aria per regolare il flusso d'aria. Collegare il FR alla PMT con tubo di erogazione mangime, ed eseguire il tubo dalla PMT in un foro nel lato del CV / FCV, vicino alla parte superiore. Figura 1.
3. Avviare
   1. Riempire il recipiente di coltura al 90% del volume disponibile con osmosi inversa (RO). Se RO non è disponibile, utilizzare acqua pulita e comunale senza cloro; tuttavia, una valutazione del rischio biosicurezza deve essere eseguita per garantire che nessun microrganismi potenzialmente patogeni sono presenti in acqua di fonte. NOTA: Tale analisi può essere effettuatada qualsiasi laboratorio di prova d'acqua qualificato.
   2. Dosare l'acqua recipiente di coltura con sale acquario per raggiungere una salinità di 15 g / L. Impostare il flusso d'aria nel recipiente in modo che mantenga una "bollire rolling", e quindi aggiungere lentamente la quantità misurata di sale al recipiente di coltura fino a completa dissoluzione della aerazione. Continuare aerare l'acqua per> 1 ora per assicurarsi che sia completamente ossigenato.
   3. Rendere la miscela di alimentazione alghe. Per 3 L di pulito, dechlorinated fresco (0 ppm) acqua aggiungere 100 g di _NaHCO3 e 100 g di ammoniaca neutralizzatore (hydroxymethylsulfonate sodio). Questo ultimo reagente offre l'ulteriore vantaggio di neutralizzare qualsiasi cloro residuo da acqua di rubinetto o candeggina residui di sanificazione delle apparecchiature cultura. E 'fondamentale per garantire che questi composti sono completamente sciolti. Poi aggiungere 1 L di alghe concentrato (biomassa peso secco ~ 15%). Aggiungere la miscela di alimentazione per la FR e conservare a 4 ° C.
   4. Aggiungere una cultura antipasto di 5-10.000.000 rotiferi Brachionus plicatilis al CV contenente 15 g di acqua di salinità / L aerato. Se i rotiferi sono stati refrigerati durante il trasporto o la conservazione, dovrebbero essere gradualmente (durante 30 min o più) acclimatati alla temperatura dell'acqua nel recipiente di coltura (25 - 27 ° C).
   5. Accendere il PMT e iniziare a pompare il feed alghe nel vaso coltura di rotiferi. Utilizzando la funzione timer del PMT, impostare la portata di miscela di alimentazione alghe in modo che ~ 1,6 ml di miscela di alimentazione alghe viene consegnato per milione di rotiferi nella cultura, al giorno. Distribuire le alimentazioni in piccole porzioni a intervalli regolari nel corso di un periodo di 24 ore; la più frequente delle alimentazioni, meglio è.
   6. Calibrare la portata della pompa agendo manualmente sulla PMT per un determinato periodo (ad esempio, 1 min) e raccogliere le alghe che esso pompa durante questo intervallo in un cilindro o cilindro graduato. Ad esempio, se le dosi PMT 5 ml di alghe in 1 min, quindi la dose sarebbe5 ml alghe / min.
   7. Calcolare il tasso di alimentazione giornaliera richiesta moltiplicando il numero di rotiferi presenti, in milioni, di 1,6 ml. Ad esempio, una cultura rotifero con una dimensione della popolazione di 100 milioni di rotiferi richiederebbe ~ 160 ml di mangime al giorno (100 x 1,6 ml).
   8. Impostare la PMT per dosare il fabbisogno alimentare giornaliero totale a intervalli regolari durante un periodo di 24 ore. Ad esempio, la consegna di una quantità di trasporto giornaliera totale di 160 ml potrebbe essere consegnato in porzioni volta ogni 3 ore in un periodo di 24 ore utilizzando una serie PMT con un tasso pompa dosatrice di 5 ml / min per 4 min, 8 volte al giorno (5 ml / min x 4 = numero minimo di 20 ml x 8 poppate = 160 ml).
   9. Lasciare che la cultura a crescere fino a che non genera la popolazione richiesta, di solito per 48-72 ore, prima della raccolta. A 24 ore dopo l'avvio, aggiungere i filtri antiparticolato filo interdentale al recipiente di coltura ed iniziare la normale manutenzione.
4. Manutenzione
   NOTA: La cultura funziona su base continua e richiede routine manutenzione che idealmente dovrebbe essere eseguita alla stessa ora ogni giorno, nella seguente sequenza.
   1. Riempire la FCV al 90% del volume disponibile con pulito, senza cloro acqua dolce, dosata con 10 g / L di sali acquario. Assicurarsi che l'acqua è ben miscelati, e che tutto il sale è completamente dissolto. Impostare il flusso d'aria nel recipiente in modo che mantenga una "bollore". Misurare la salinità con un rifrattometro e garantire che la salinità è di 10 g / L. E 'fondamentale per raggiungere questo obiettivo e di non superarla.
   2. Assaggiate i rotiferi del CV: Assicurarsi che la cultura è ben miscelato, quindi raccogliere 3 campioni di 2-3 ml con una pipetta di trasferimento o autopipettor, provenienti da diverse parti della cultura. Combinare questi campioni in un tubo o fiala di dimensione conveniente (ad esempio, 10 ml).
   3. Transfer 1 - 2 ml del campione combinato su una capsula di Petri in modo che possa essere visualizzato sotto un microscopio da dissezione. Controllare la qualità della cultura (nuoto comportamentorotiferi, presenza di uova staccati, contaminando protozoi).
   4. Immobilizzare il rotiferi del campione combinato restante aggiungendo 100 ml di 50% soluzione di iodio Lugol al campione. In pochi secondi dopo l'aggiunta dei Lugol, osservare i rotiferi per fermare il nuoto. Ora, facilmente contare i rotiferi.
      NOTA: L'etanolo, candeggina diluita, o aceto possono essere utilizzati al posto di Lugol. Aceto (2 gocce / 10 ml) ha il vantaggio di essere non pericolosi, senza perdere forza nella memoria come soluzioni di lavaggio e di iodio può, e non fare il contratto rotiferi, così la corona delle ciglia e il "piede" rimanere estesa e la animali aspetto più naturale.
   5. Assicurarsi che il campione è ben miscelato (rotiferi immobilizzate si depositano rapidamente), poi prendere rapidamente un ml sottocampione ~ 2 in una pipetta di plastica e dispensare 1 ml in una diapositiva che conta Sedgewick-Rafter (20 x 50 1 mm quadrati) (Figura 2 ). Utilizzando un microscopio da dissezione o composto, contare i rotiferi intatti e il tNumero otale di uova attaccate a queste rotiferi (Figura 2). Conte come gran parte della zona diapositiva come necessario contare ~ 100 rotiferi. Calcolare il numero di rotiferi per ml, e registrare questo in un foglio di calcolo o giornale di bordo.
   6. Harvest ~ 30% del volume dei rotiferi nel CV: Rimuovere l'alimentazione dell'aria e filtro filo, aprire lentamente la valvola sul fondo del CV e permettere all'acqua di fluire in un collettore di plancton con uno schermo di maglia 53 micron. Raccogliere l'acqua che scorre fuori dal fondo del collettore dopo il filtraggio in un secchio o scarico. Utilizzare un dolce a moderato flusso per evitare di danneggiare i rotiferi. Non permettere che i rotiferi asciugare sullo schermo.
   7. Per motivi di coerenza, è opportuno stabilire il FCV con un numero standard di rotiferi ogni giorno. Pertanto, sulla base del noto volume di CV densità rotifero e il raccolto, regolare il volume totale FCV per ottenere una densità finale coerente (ad es., 1.500 rotiferi / ml). Aggiungere il roti raccoltofers al FCV: trasferire delicatamente i rotiferi dallo schermo raccolta utilizzando una bottiglia di lavaggio riempita con acqua salata pulita (10-15 g / l). Capovolgere lo schermo sopra la FCV e lavare i rotiferi in FCV con una leggera corrente di acqua salata. Avviare la PMT per fornire alimentazione (~ 1,57 ml per milione di rotiferi al giorno) per il FCV.
   8. Scrub l'intero all'interno del CV con una spazzola di nylon morbido e pulito o pad macchia.
   9. Preparare una nuova miscela di 15 g di acqua / L aggiungendo la quantità appropriata di sale ad una quantità misurata di acqua pulita RO in un secchio da 5 galloni per sostituire il volume di acqua persa per raccogliere. Aggiungere il sale all'acqua nel secchio e mescolare vigorosamente fino a completa dissoluzione, e quindi aggiungere al CV.
   10. Usando uno spray ad alta pressione in un lavandino, lavare il filtro filo fino a quando è libero di detriti, e poi tornare al CV.
   11. Regolare velocità di avanzamento di alghe consegnato al CV cambiando la durata di ogni evento di dosaggio, in base al conteggio giornaliero di rotiferi / ml.Utilizzare i calcoli forniti al punto 1.3.8, al di sopra di determinare la giusta quantità di mangime da consegnare.
   12. Circa 24 ore dopo, ripetere il processo. Avviare raccogliendo i rotiferi rimanenti nel FCV (che non erano necessari per il giorno precedente) nello stesso modo precedentemente descritto (punti 1.4.2 - 1.4.10). Concentrarli in 2 litri di acqua fresca e pulita senza cloro (5 g / l di sale). Questi possono essere conservati a 4 ° C come alimentazione di riserva, o utilizzati per alimentare le fasi successive di pesce, al di là di quanto descritto in questo protocollo.
       NOTA: Questo protocollo permette fino a 2 - 3 giorni di ridotta manutenzione cultura (con alimentazione automatica normale), perché i rotiferi nel curriculum può tollerare l'omissione dei raccolti senza gravi conseguenze.

2. Policoltura

1. Impostare
   1. Raccogliere embrioni di zebrafish da un evento di deposizione delle uova versando embrioni generati attraverso un colino da tè e poi risciacquare delicatamente con fis sterilih di acqua (o di qualsiasi altra fonte non contaminata della soluzione opportunamente condizionata, ad esempio, di media embrione, E3, etc.) da un flacone di lavaggio in capsule di Petri.
   2. Incubare gli embrioni a 25 - 28 ° C in piastre Petri ad una densità di 40 - 50 embrioni per piastra per 5 giorni.
   3. Iniziare la fase polyculture il giorno 5 dopo la fecondazione, o quando più del 90% delle larve schiuse attivamente nuotando nella colonna d'acqua.
2. Inoculazione
   1. Aggiungere 500 ml di coltura di rotiferi direttamente dal FCV ad un serbatoio vivaio 3,5 L; inclusione di acqua coltura di rotiferi prevede algale che mantiene il contenuto nutrizionale dei rotiferi durante policoltura.
   2. Delicatamente versare le larve da una capsula di Petri nel serbatoio vivaio. Assicurarsi che nessun larve rimangono nel piatto.
   3. Aggiungere 500 ml di acqua pulita e pesci condizionata da un sistema di ricircolo o fonte d'acqua dedicata al serbatoio per raggiungere un volume finale di 1 litro e il s finalealinity di 5 g / L.
      NOTA: Questo salinità è fondamentale perché la sopravvivenza delle larve zebrafish sarà influenzato negativamente se la salinità è> 7 g / L e di sopravvivenza rotiferi sarà influenzato negativamente se la salinità <2 g / l.
3. Fase policoltura
   NOTA: La fase di policoltura dovrebbe durare per un massimo di 4 giorni post-inoculazione (per un totale di 5 giorni, corrispondenti a 5-9 giorni dopo la fecondazione).
   1. Osservare il serbatoio policoltura almeno una volta al giorno durante questo periodo per assicurare che rotiferi e pesce sono presenti e in crescita. Assicurarsi che i rotiferi sono visibili in tutta la colonna d'acqua. Assicurarsi che i le fishs sono visibili anche all'interno della colonna d'acqua, nuotando tra i rotiferi.
   2. Inizia flusso d'acqua normale attraverso il serbatoio. Posizionare uno schermo o deflettore attraverso la porta di scarico per garantire che le larve non vengono trasferite dal serbatoio.
      NOTA: Al termine di questa fase, i pesci saranno abbastanza grande da consumare prede più grandi come Artemiaelementi del feed naupli o trasformati nella gamma di dimensioni di 75-125 micron.
      NOTA: Le dinamiche demografiche rotifero all'interno di un serbatoio di polyculture rappresentante sono stati misurati mediante campionamento / conteggio rotiferi dal serbatoio allo stesso modo come descritto ai punti 1.4.2 - 1.4.5. Ciò è stato fatto una volta al giorno a partire dall'inizio della fase polyculture finché fu completata.

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Risultati

Il sistema di coltura di rotiferi continua qui descritta è dinamico, ed è normale per i numeri di rotiferi a fluttuare in misura limitata nel tempo se ci sono variazioni nei tassi di alimentazione e di raccolta giornaliera. La popolazione dei rotiferi in una delle culture attive nei servizi di acquacoltura Hospital Boston bambini, mantenuto nel modo sopra descritto, è stata monitorata per 30 giorni (Figura 3). La densità di cultura media durante questo periodo è sta...

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Discussione

La corretta attuazione del metodo policoltura rotiferi per l'alimentazione precoce zebrafish larvale richiede protocolli efficaci per due compiti: la creazione e il mantenimento di un sistema di coltura di rotiferi continuo a nutrire i pesci, e la coltura di prima alimentazione larve zebrafish con rotiferi nella stessa vasca.

La messa a punto di un sistema di produzione di acqua salata rotifero continua per i laboratori di zebrafish prima descritti da Lawrence e co-autori ^{di 14}

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rotifer Culture Infrastructure
100 L Culture Vessel	Aquaneering	Custom	Polycarbonate culture vessel, conical bottomed, with drain valve
5 Gallon Culture Bucket Kit	Reed Mariculture	CCS Starter Kit	Small volume culture vessel for small facilities
Rigid Clear Tubing 1/2" O.D., 36”	Pentair Aquatic Ecosystems	16025	Rigid clear tubing for air delivery
Mesh tube	Pentair Aquatic Ecosystems	RT444X	Mesh tube support for floss filter
Rotifer Floss	Reed Mariculture	Rotifer floss 12” x 42”	Particulate waste trap
Peristaltic Metering Timer Pump, 5 GPD	Grainger	38M003	Metering pump with timer for dosing feed to rotifers
Peristaltic Metering Timer Pump, 1-100 mL/hr (for smaller-scale culture)	Coral Vue	SKU: IC-LQD-DSR	Metering pump with timer for dosing feed to rotifers
Silicone Tubing	Cole Parmer		Tubing for algae delivery to rotifer vessel
Rigid Clear Tubing " O.D.,36”	Pentair Aquatic Ecosystems	16025	Rigid clear tubing for air delivery to algae paste
Rigid Clear Tubing O.D., 36”	Pentair Aquatic Ecosystems	16025	Rigid clear tubing for algae delivery
Rotifers
Live Rotifers Brachionus plicatilis Type L	Reed Mariculture	Type L 5 million	Rotifer stock culture for system startup
Rotifer Feed
Sodium hydroxymethylsulfonate	Reed Mariculture	ClorAm-X® 1lb tub	Ammonia reducer for algae feed mix
Sodium Bicarbonate	Fisher Scientific	S25533B	pH buffer for algae feed mix
Microalgae concentrate	Reed Mariculture	Rotigrow Plus® 1 liter bag	Nutritionally optimized rotifer feed
RG Complete	Reed Mariculture	RG Complete 6 oz bottle	All in one microalgae based feed for small scale cultures
Water Preparation
Reef Crystals Reef Salt	That Fish Place	198210	Salt for making culture water (NOTE: this item is an example only; any contaminant free salt formulations may be used).
Refractometer	Pentair Aquatic Ecosystems	SR6	measuring salinity
Rotifer Culture Equipment
Plankton Collectors 12" Dia, 53 microns	Pentair Aquatic Ecosystems	BBPC20	Mesh screen for collecting rotifers
Scrub Pads	Pentair Aquatic Ecosystems	SCR-58	Scrub pad for cleaning inside of culturing vessels
Scrub Brush
Bucket	Grainger Supply	43Y530	Graduated bucket for mixing culture water
Hatching Jar	Pentair Aquatic Ecosystems	J30	Storage of algae feed mix
Lugol’s Solution, Dilute	Fisher Scientific	S99481	Agent used to immobilize live rotifers for counting
Sedgewick-Rafter plankton counting slide with grid	Pentair Aquatic Eco-Systems	M415	Counting rotifers
Miscelleneous
Tea Strainer	Kitchenworks	971972	Used for collecting zebrafish embryos after spawning