Un metodo rapido ed efficace per la purificazione delle cellule endoderma generato da cellule staminali embrionali umane

Riepilogo

Qui, si descrive un metodo per la purificazione delle cellule staminali embrionali differenziate umane che si sono impegnati verso l'endoderma definitivo per il miglioramento delle applicazioni a valle e ulteriori differenziazioni.

Abstract

Le capacità di differenziazione delle cellule staminali pluripotenti come le cellule staminali embrionali (ESC) permettono una potenziale applicazione terapeutica per le terapie di sostituzione cellulare. Terminally tipi di cellule differenziate potrebbero essere utilizzati per il trattamento di varie malattie degenerative. In vitro differenziazione di queste cellule verso tessuti del polmone, fegato e pancreas richiede come primo passo la generazione di cellule endodermico definitive. Questo passaggio è limitante per un'ulteriore differenziazione verso tipi di cellule terminalmente maturate come le cellule beta produttrici di insulina, epatociti o altri tipi di cellule endoderma-derivati. Le cellule che si sono impegnati nei confronti della stirpe endoderma altamente esprimono una moltitudine di fattori di trascrizione come Foxa2, SOX17, HNF1B era, i membri della famiglia GATA, e il recettore CXCR4 superficiale. Tuttavia, i protocolli di differenziazione sono raramente efficiente al 100%. Qui, si descrive un metodo per la purificazione di una popolazione di cellule CXCR4 + dopo la differenziazionenella DE utilizzando microsfere magnetiche. Questa purificazione elimina inoltre le cellule di linee indesiderate. Il metodo di purificazione delicata è veloce e affidabile e può essere utilizzata per migliorare le applicazioni a valle e differenziazioni.

Introduzione

Le cellule staminali pluripotenti come le cellule staminali embrionali (ESC) hanno la capacità di differenziarsi in qualsiasi tipo di cellula del corpo umano. Così, in vitro protocolli di differenziazione possono essere utilizzati per generare numerosi tipi cellulari adulto come cardiomiociti ^1, epatociti ^2, cellule beta ^3, epiteliale polmonare ⁴ o cellule neuronali ^5. Questo rende CES uno strumento prezioso per il potenziale trattamento di diverse malattie degenerative ^3.

La differenziazione in vitro dei CES verso tessuti adulti del polmone, del fegato e del pancreas richiede una pseudo-gastrulazione in cellule che ricordano l'endoderma definitivo (DE) ^6. Poiché differenziazione valle verso i suddetti tipi di cellule somatiche è molto meno efficienti, una differenziazione endoderma ottimale è considerata limitante ^7. Le cellule che si sono impegnati nei confronti della stirpe endoderma subiscono chacambiamenti racteristic nel loro profilo di espressione genica. Maestri pluripotenza geni regolatori sono giù regolati, mentre l'espressione di altri fattori di trascrizione, come Foxa2, SOX17, HNF1B era, i membri della famiglia GATA e il recettore di superficie CXCR4 è altamente upregulated ^{6, 8, 9.} CXCR4 è noto per essere transactivated da SMAD2 / 3, a valle della nodale di segnalazione / TGF-β e SOX17 a causa di specifici siti di legame nella sua regione del promotore ^10. Così è un marcatore molto adatto utilizzato in una serie di relazioni ^{6, 8, 11-13.} Questi cambiamenti di espressione riflette un evento di pseudo-gastrulazione, in cui i CES prima acquisire caratteristiche di una popolazione di cellule striscia simile primitiva e, successivamente, si impegnano nello strato germinale endoderma ^6.

Tuttavia, i protocolli di differenziazione sono raramente efficiente al 100% come poche cellule possono resistere al processo di differenziazione o differenziare verso altre linee non intenzionali ^14. Queste cellule possono Influe negativamentence ulteriore differenziazione. Inoltre, le cellule indifferenziate residue porto grandi rischi per i successivi esperimenti di trapianto e possono dar luogo a teratomi ^15-17.

Per rimuovere queste cellule indesiderate precoce sul marcatore CXCR4 superficie può essere utilizzato per la purificazione di cellule che si sono impegnati verso la DE ^18. Qui, descriviamo un metodo per la selezione positiva di + cellule CXCR4 da De culture differenziazione. Per questo, il marcatore CXCR4 superficie è vincolato da un anticorpo che poi a sua volta si lega a microsfere magnetiche. A differenza delle dure condizioni durante FACS ordinamento, le cellule DE-come magneticamente etichettati possono quindi facilmente essere purificati in un formato da banco utilizzando un metodo di purificazione delicato. Questo protocollo fornisce un metodo semplice per la rimozione delle popolazioni cellulari che oppone il processo di differenziazione DE.

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Protocollo

1. Differenziazione dei CES umana verso endoderma definitivo

1. Coltivare cellule staminali embrionali umane (CES) in un incubatore a 37 ° C e 5% di CO _2.
2. Coat una nuova piastra di coltura cellulare 6 pozzetti con 1 ml di una matrice membrana basale e incubare la coltura-ware per almeno 30 minuti a temperatura ambiente. Per informazioni specifiche si prega di girare le istruzioni del rispettivo produttore.
3. Verificare che i CES umane coltivate hanno raggiunto l'80% -90% di confluenza al microscopio con un ingrandimento basso (ad esempio, 4X). Aspirare il supporto dalle cavità succhiando via del mezzo con un bicchiere sterile Pasteur pipetta. Lavare le cellule una volta con una soluzione tampone fosfato (PBS). Per questo, aggiungere 2 ml di PBS a ciascun pozzetto dolcemente agitare la piastra e succhiare la soluzione per rimuovere le cellule morte e detriti cellulari.
4. Aggiungere 1 ml di reagente soluzione passaging senza enzima per dolce la dissociazione di gruppi di cellule. Incubare le cellule a 37 ° C und 5% di CO ₂ fino a quando le cellule mostrano chiari segni di rottura in piccoli gruppi.
   NOTA: Il tempo di incubazione dipende dal reagente utilizzato. Per la soluzione passaging senza enzima citato nella sezione materiali, tempo di incubazione è di circa 7 min.
5. Aggiungere 1 ml DMEM / F-12 di media e disturbare gli altri aggregati di cellule in singole cellule pipettando su e giù con una punta della pipetta 1 ml. Usare questo per irrigare le cellule dalla superficie e trasferire le cellule a un tubo di centrifugazione. Per recuperare tutte le celle, lavare i pozzetti con 1 ml di DMEM / F-12 medio e aggiungere il mezzo al tubo di centrifugazione.
6. Centrifugare le cellule per 5 minuti a 300 x g. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in 5 ml di ES terreno di coltura cellulare contenente 10 mM Rho-chinasi (ROCK) inibitore.
7. Contare le cellule al microscopio utilizzando un emocitometro e sementi 150.000 - 400.000 cellule per 6 pozzetti o in un altro layout di piastra, a seconda della linea cellulare utilizzata ES. Usa culture terreno contenente inibitore ROCK 10 pM di evitare l'apoptosi e la cultura nelle cellule in un incubatore a 37 ° C e 5% CO _2.
8. Circa 24 ore dopo la semina aspirare il terreno con uno sterile pipetta Pasteur di vetro e aggiungere 2 ml di terreno striscia di induzione primitiva.
   NOTA: Questo mezzo contiene concentrazioni finali di 1% glutamina, 0,2% FCS, 5 micron CHIR-99021 e 50 ng / ml activin A in avanzata RPMI-1640. Comunemente, usare 2 ml di terreno per la coltivazione in 6 pozzetti.
9. 48 ore dopo la semina, sostituire il mezzo per endoderma medio induzione. Coltivare le cellule in questo mezzo per altre 48 ore con cambio medio giornaliero.
   NOTA: Questo mezzo contiene 1% glutamina, 0,2% FCS e 50 ng / ml activina A in Advanced RPMI-1640. Le cellule che si sono impegnati verso l'endoderma definitivo esprimono il marcatore di superficie CXCR4. La colorazione di CXCR4 può essere utilizzato per quantificare il numero di cellule disimpegnati.

2. La colorazione di CXCR4 + endoderma definitivo cellule per l'analisi in citometria a flusso

1. Per la finale 24 hr ma almeno 1 ora prima della raccolta delle cellule aggiungono inibitore ROCK 10 pM al mezzo di coltura.
2. Coat coltura-ware cellule che verrà utilizzato per la ri-semina con una matrice di membrana basale, cioè, piastre da 12 pozzetti per analisi qPCR o la camera di vetrini per immunofluorescenza. Incubare le piastre o le diapositive per almeno 30 minuti a temperatura ambiente.
3. Aspirare il mezzo con uno sterile pipetta Pasteur di vetro dai pozzi delle cellule differenziate utilizzati per la colorazione e / o l'ordinamento.
4. Aggiungere 1 ml di reagente soluzione passaging priva di enzimi per il dolce di dissociazione di gruppi di cellule. Incubare le cellule a 37 ° C e 5% CO ₂ finché le cellule mostrano evidenti segni di rottura in piccoli gruppi.
   NOTA: Il tempo di incubazione dipende dal reagente utilizzato. Per la soluzione passaging senza enzima di cui al Materisezione als, tempo di incubazione è di circa 7 min.
5. Aggiungere 1 ml DMEM / F-12 di media e disturbare restante aggregati di cellule in singole cellule pipettando su e giù con una punta di 1 ml. Usare questo per irrigare le cellule dalla superficie e trasferire le cellule a un tubo di centrifugazione. Per recuperare tutte le celle, lavare i pozzetti con 1 ml di DMEM / F-12 medio w / o FCS e aggiungere il mezzo al tubo di centrifugazione.
6. Contare le cellule sotto il microscopio con un emocitometro. Le cellule provenienti da tre pozzetti di una piastra da 6 pozzetti dovrebbero portare a 10-15 x 10 ⁶ cellule dopo tre giorni di differenziazione. Centrifugare le cellule per 5 minuti a 300 x g.
   NOTA: Il numero esatto di cellule ottenute dipenderà dalla linea cellulare pluripotenti utilizzato per la differenziazione.
7. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in tampone PEB contenente inibitore ROCK 10 micron. Utilizzare 100 ml di questo buffer per un massimo di 10 ⁷ cellule. Aggiungere l'inibitore ROCK 10 pM del giorno di staining. Utilizzare questo buffer per tutte le applicazioni a valle (di seguito PEB tampone + RI).
   NOTA: tampone PEB contiene 0,5% BSA e 2 mM EDTA in PBS. Se più celle devono essere macchiati, regolare il volume di accumulo di conseguenza.
8. Aggiungere 10 ml di un anticorpo CXCR4-APC per 10 ⁷ cellule in 100 microlitri, questo rappresenta circa una diluizione di 1:10.
   NOTA: L'utilizzo di un anticorpo APC-linked non è obbligatoria. Invece può essere sostituito a seconda delle microsfere utilizzate. Se più celle devono essere macchiati regolare il volume anticorpi conseguenza.
9. Mescolare capovolgendo delicatamente il tubo con le dita e incubare a 4 ° C in frigorifero per 15 minuti. Risospendere le cellule con 1-2 ml di tampone PEB. Centrifugare le cellule per 5 minuti a 300 x g.
10. Aspirare il surnatante con un bicchiere sterile Pasteur pipetta e risospendere il pellet cellulare in 80 microlitri PEB per 10 ⁷ cellule e aggiungere 20 microlitri anti-APC microsfere.
    NOTA: Se più celle devono essere macchiato, regolare il volume micro-perline di conseguenza.
11. Mescolare capovolgendo delicatamente il tubo con le dita e incubare a 4 ° C in frigorifero per 15 minuti. Risospendere le cellule con 1-2 ml di PEB tampone + RI. Centrifugare le cellule per 5 minuti a 300 x g. Aspirare il buffer. Risospendere in 500 microlitri di buffer PEB + RI.

3. La separazione magnetica di CXCR4 + cellule

1. Posizionare una colonna magnetica di medie dimensioni in un campo magnetico come da istruzioni di fabbricazione. Pre-lavare la colonna con 500 microlitri di buffer PEB + RI. Applicare l'intera sospensione cellulare alla colonna. Raccogliere il flusso attraverso le cellule come non tutti lo legherà alla colonna. Fare attenzione a non disturbare le colonne per il recupero ottimale delle cellule CXCR4 +.
2. Lavare la colonna tre volte con 500 microlitri di buffer PEB + RI. Raccogliere il primo flusso attraverso e combinarlo con le cellule raccolte dal punto 3.1. Rimuovere la colonna magnetica dal campo magnetico e metterla in untubo di raccolta adatto. Aggiungere 1 ml di PEB tampone + RI sulla colonna. Per eluire le cellule premere con forza il pistone nella colonna.
3. Opzionale: Raccogliere tutte flusso attraverso campioni separatamente e 20 ml ciascuno di analizzare il numero di cellule CXCR4 + citometria a flusso. Il loro numero dovrebbe diminuire con ogni fase di lavaggio.
   NOTA: Almeno 2 x 10 ⁴ praticabile, le cellule gated devono essere contati per ottenere risultati affidabili.
4. Ripetere i punti 3.1-3.3 con il flusso raccolte attraverso campione dal punto 3.1 e il primo flusso attraverso campione dal punto 3.2 con una nuova colonna. Non riutilizzare la colonna precedente. Utilizzando l'aria stantuffo viene pressato nella colonna, che blocca.
5. Contare le cellule sotto il microscopio con un emocitometro. A seconda della efficienza della differenziazione fino a 6 x 10 ⁶ cellule possono essere ordinati inizialmente e altre 1 x 10 ⁶ cellule utilizzando una seconda colonna utilizzando 10 ⁷ cellule per la procedura.
6. Centrifugare le cellule a 300 xg per 5 min. Aspirare il surnatante e con uno sterile Pasteur di vetro pipetta e risospendere le cellule in 1 ml di mezzo endoderma induzione dal punto 1.9 con l'aggiunta di inibitore ROCK 10 micron.
7. Contare le cellule sotto il microscopio con un emocitometro. Seme le cellule ad una densità adeguata, vale a dire, ~ 4 x 10 ⁵ cellule per pozzetto di una 12-pozzetti (app. 3,6 cm ² di superficie) o ~ 1,5 x 10 ⁵ cellule per pozzetto di un 8-ben camera-scivolo.

4. Opzionale: Analisi delle purificata Popolazione Endoderma definitiva

1. Per immunofluorescenza fissare le cellule purificate dal punto 3.7 circa 24 ore dopo la semina con paraformaldeide al 4% e colorare per endoderma definitivo (DE) e / o proteine ​​marker pluripotenza.
   NOTA: comunemente usato DE marcatori includono Foxa2 e SOX17, marcatori pluripotenza comunemente usati includono Oct3 / 4, Nanog e SOX2 ^{6, 8.}
2. foanalisi R RT-qPCR, raccogliere le cellule purificate direttamente o 24 ore dopo la semina, estratto totale-RNA e reverse trascrivere cDNA dai campioni totale-RNA estratto. Utilizzare 10 ng cDNA come modello per reazione RT-qPCR (triplicato) per analizzare l'espressione di DE e geni marcatori pluripotenza ^{6, 8.}
   NOTA: i geni marcatori di uso comune sono menzionati al punto 4.1. condizioni del ciclo sono 5 min a 95 ° C e 40 cicli di 15 secondi a 95 ° C e 1 min a 60 ° C, seguita da analisi della curva di fusione.

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Risultati

Su differenziazione CES subiscono drastici cambiamenti di espressione genica e proteica. La figura 1 illustra geni marcatori tipici che possono essere utilizzati per verificare una differenziazione endoderma successo. Obiettivi principali per l'analisi di espressione genica sono GSC, Foxa2 e SOX17. In un parente analisi di espressione genica in particolare Foxa2 e SOX17 sono aumentate di> 2.000 volte ...

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Discussione

protocolli di differenziazione Attualmente utilizzati raramente si traducono in 100% di cellule differenziate. Per ragioni che devono ancora essere affrontate alcune cellule resistono il processo di differenziazione. A seconda della efficienza del protocollo differenziazione utilizzato e la propensione del CES linea un certo numero di cellule pluripotenti residue vengono comunemente osservato anche dopo differenziamento in endoderma definitiva. Queste cellule residue possono compromettere differenziazioni a valle o ulte...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hues8 human embryonic stem cell line	Harvard Department of stem cell & regenerative biology		Suitable cell line for endoderm generation
Hes3 human embryonic stem cell line	ES Cell International		Suitable and robust cell line for endoderm generation
mTeSR1	Stemcell Technologies	5850	ESC culture medium
FCS	Biowest	S1860
Advanced RPMI 1640	Life Technologies	12633012
CD184 (CXCR4)-APC, human	Miltenyi Biotec	130-098-357
anti-APC MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-090-855
OctoMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-042-109	magnetic field
Y-27632	Selleck Chemicals	S1049	ROCK inhibitor
CHIR-99021	Tocris Bioscience	4423
Activin A	Peprotech	120-14
Gentle Cell Dissociation Reagent	Stemcell Technologies	7174	Enzyme-free passaging solution, alternative: Trypsin/EDTA
Matrigel*	Corning	354277	basement membrane matrix * solve and store in aliquots at -80 °C as outlined in the suppliers manual. Upon use, thaw on ice, dilute in 25 ml ice-cold knockout DMEM/F-12. Add 1 ml to each well of a 6-well plate and incubate for 45 min at room temperature. Remove the matrigel and use immediately.
MS Columns	Miltenyi Biotec	30-042-201
MACS Separator	Miltenyi Biotec	130-042-302
Human FOXA2 FW gggagcggtgaagatgga	Life Technologies	NA
Human FOXA2 REV tcatgttgctcacggaggagta	Life Technologies
Human GSC FW gaggagaaagtggaggtctggtt	Life Technologies
Human GSC REV ctctgatgaggaccgcttctg	Life Technologies
SOX17 TaqMan assay	Applied Biosystems	Hs00751752_s1
Human SOX7 FW gatgctgggaaagtcgtggaagg	Life Technologies
Human SOX7 REV tgcgcggccggtacttgtag	Life Technologies
Human POU5F1 FW cttgctgcagaagtgggtggagg	Life Technologies
Human POU5F1 REV ctgcagtgtgggtttcgggca	Life Technologies
Human Nanog FW ccgagggcagacatcatcc	Life Technologies
Human Nanog REV ccatccactgccacatcttct	Life Technologies
Human TBP FW caa cag cct gcc acc tta cgc tc	Life Technologies
Human TBP REV agg ctg tgg ggt cag tcc agt g	Life Technologies
Human TUBA1A FW ggc agt gtt tgt aga ctt gga acc c	Life Technologies
Human TUBA1A REV tgt gat aag ttg ctc agg gtg gaa g	Life Technologies
Human G6PD FW agg ccg tca cca aga aca ttc a	Life Technologies
Human G6PD REV cga tga tgc ggt tcc agc cta t	Life Technologies
Anti-SOX2	Santa Cruz Biotechnology	sc-17320
Anti-FOXA2	MerckMillipore	07-633
Anti-SOX17	R&D Systems	AF1924