Ex vivo dal vivo Imaging di polmone metastasi e il loro micro

Riepilogo

Descriviamo un metodo relativamente semplice per ex vivo l'imaging dal vivo del tumore interazioni cellula-stroma all'interno di metastasi polmonari, utilizzando i reporter fluorescenti nei topi. Utilizzando la microscopia confocale spinning-disk, questa tecnica consente la visualizzazione di cellule vive per almeno 4 ore e potrebbe essere adattato per studiare altre malattie polmonari infiammatorie.

Abstract

Metastasi è una delle principali cause di morbilità e mortalità per cancro. Metastasi è un processo a più fasi e causa della sua complessità, le esatte processi cellulari e molecolari che regolano la diffusione e la crescita metastatica sono ancora sfuggente. Immagini dal vivo permette la visualizzazione delle interazioni dinamiche e spaziali delle cellule e il loro microambiente. I tumori solidi comunemente metastasi ai polmoni. Tuttavia, la posizione anatomica dei polmoni rappresenta una sfida per l'imaging intravitale. Questo protocollo fornisce un metodo relativamente semplice e veloce per ex vivo l'imaging dal vivo delle interazioni dinamiche tra le cellule tumorali e la loro stroma circostante all'interno di metastasi polmonari. Utilizzando questo metodo, la motilità delle cellule tumorali, nonché le interazioni tra cellule tumorali e cellule stromali nel loro microambiente possono essere visualizzati in tempo reale per diverse ore. Utilizzando topi transgenici reporter fluorescente, una linea cellulare a fluorescenza, iniettabili fluorescentemolecole e / o anticorpi, componenti multipli del microambiente polmonare possono essere visualizzati, come i vasi sanguigni e cellule immunitarie. Per immagine diversi tipi cellulari, è stato usato un disco rotante microscopio confocale che permette a lungo termine di imaging continuo con acquisizione delle immagini rapida, a quattro colori. filmati time-lapse compilati da immagini raccolte su più posizioni e piani focali mostrano le interazioni tra metastatico dal vivo e le cellule immunitarie per almeno 4 ore. Questa tecnica può essere ulteriormente utilizzato per testare chemioterapia o terapia mirata. Inoltre, questo metodo potrebbe essere adattato per lo studio di altre patologie polmonari correlati che possono influenzare il microambiente polmonare.

Introduzione

The deadliest aspect of cancer is metastasis, which accounts for more than 90% of cancer-related morbidity and mortality¹. Metastasis is a multistep process and due to its complexity, the exact cellular and molecular mechanisms that govern metastatic dissemination and growth are still elusive. To metastasize, tumor cells in the primary tumor must detach from their neighboring cells and basement membrane, cross through the extracellular matrix, intravasate, travel via blood or lymphatic vessels, extravasate at the secondary site, and finally, survive and establish secondary tumors. In addition to the properties of the tumor cells, the contribution from the microenvironment, which includes the adjacent stroma along with the normal counterparts of the cancer cells, is crucial for the seeding and establishment of metastatic lesions².

Traditional methods to study metastatic seeding and growth examine static states, as tissues are excised and sectioned for histology. These data only generate a snapshot of this highly dynamic process. Although some useful information can be gained from these studies, the complicated process by which tumor and stromal cells interact during metastatic formation cannot be adequately assessed by these methods. Furthermore, it is not possible to gain insights into tumor or stromal cell migration patterns, which are important in establishing a colony at the distant site. In order to effectively study the metastatic process, it is essential to visualize various interactions between cancer cells and their microenvironment in a continuous manner and at real time.

The lung is a common site for metastases from solid tumors as breast, colorectal, pancreatic cancer, melanoma and sarcoma³. Intravital imaging was previously used to study cell-cell interaction in various primary tumor and metastatic models^4,5. Methods of lung imaging in mice, including intravital imaging, lung section imaging, and an ex vivo pulmonary metastasis assay have been published^6–9. Intravital imaging of mouse lungs utilizes a thoracic suction window to stabilize the lungs⁶. This method is used for time-lapse imaging of the lung microcirculation and alveolar spaces. The anatomical location of the lungs poses a challenge to intravital imaging. In order to access the lungs, the chest cavity must be opened which leads to loss of negative pressure and collapsed lungs. This method only allows the visualization of a small part of the lungs and is technically demanding; an unnecessary complication in studies that examine processes that are independent of blood flow. Moreover, this method also requires gating out movement caused by breathing. This is done either by collecting images between breaths or during post image acquisition analyses¹⁰. The alternative ex vivo lung section imaging provides stability and depth, and also prepares lung parenchyma for immunostaining⁷. However, the lengthy sectioning process leads to an extensive delay between the time of animal sacrifice and the start of the imaging session. Moreover, the process of sectioning a mouse lung causes considerable amount of cell death⁸, thus interfering with the quality and quantity of imaging samples and perhaps needlessly altering tumor-stroma interactions. In order to technically bridge between the methods of intravital imaging and lung section imaging, while exploiting the advantages of the two techniques, a relatively fast and easy method for ex vivo lung imaging was developed. This method was achieved by imaging of non-sectioned whole lung lobes. Using this method, the motility of cancer cells as well as interactions between cancer cells and stromal cells in their microenvironment can be visualized in real time for several hours.

Protocollo

Tutte le procedure descritte devono essere eseguite in conformità con le linee guida e regolamenti per l'uso di animali vertebrati, tra cui l'approvazione preventiva della Istituzionale Cura locali animali e del Comitato Usa (IACUC).

1. Generazione di polmone metastasi per ex vivo l'imaging dal vivo (transgenico o la coda Vein Injection)

NOTA: metastasi polmonari possono essere generati utilizzando modelli murini geneticamente o per via endovenosa (ev) delle cellule tumorali.

1. Generare metastasi polmonari per l'imaging attraversando un modello murino di tumore geneticamente modificato in un topo giornalista transgenico, ad esempio, si attraversa il cancro al seno modello di topo, mouse virus tumore mammario lunga terminal repeat-polyoma mezzo T antigene (MMTV-PyMT) ¹¹ in ACTB-ECFP modello di topo ^12.
   NOTA: Il modello ACTB-ECFP esprime migliorato proteina fluorescente ciano (ECFP) sotto il β-actnel promotore in modo tale che tutte le cellule fluorescenti nel blu, il canale PCP. Tuttavia, le cellule tumorali sono di gran lunga i più importanti e appaiono come una massa di cellule ECFP-positive al microscopio. Il modello di topo MMTV-PyMT sviluppa una malattia progressiva, in cui la crescita del tumore mammario è associata con la diffusione delle cellule tumorali alla periferia, soprattutto ai polmoni. Nei topi MMTV-PyMT sul FVB / n sfondo, micrometastasi possono osservare intorno 10-11 settimane di età. In generale, questi progressi macrometastasi a circa 14 settimane di ^{13 anni.}
   O
2. Generare metastasi sperimentali utilizzando cellule primarie o linee cellulari singenici. Utilizzare nelle cellule tumorali in vitro primaria manipolato o linee cellulari (ad es., Trasduzione) seguito da iniezione endovenosa ^14.
   1. In breve, in questo protocollo, iniettare una proteina fluorescente verde (GFP) esprimente (+) linea cellulare MMTV-PyMT in topi fluorescenti Reporter (ACTB-ECFP) o di tipo selvatico mice. Poi,visualizzare queste cellule denominate cellule VO-PyMT ¹⁵ utilizzando il verde, il canale GFP.
      NOTA: La linea cellulare originale VO-PyMT è stato derivato al Vanderbilt Ortopedia a Nashville, TN. VO acronimo di Vanderbilt Ortopedia.
   2. Dopo l'iniezione di 10 ^{6 cellule} (in 200 microlitri), osservare stravaso cellula tumorale immediatamente e fino a poche ore dopo l'iniezione; osservare micrometastasi tra 1-3 settimane dopo l'iniezione e rilevare macrometastasi 3 settimane dopo l'iniezione ^15.
      NOTA: minor numero di cellule possono essere iniettati per prolungare il tempo di iniezione per la crescita metastatica.

2. L'etichettatura dei componenti di interesse per il metastatico Microenvironment (transgenici e / o iniettabili)

NOTA: etichettatura può essere ottenuto topi transgenici e / o vari iniettabili. Assicurarsi di utilizzare i colori fluorescenti diversi per l'etichettatura dei vari tipi di cellule.

1. componenti Label del microambiente metastatico utilizzando topi transgenici. Attraversate il modello di tumore del mouse precedentemente menzionato (ad es., MMTV-PyMT x ACTB-ECFP) in un modello di topo transgenico in cui le cellule stromali di interesse sono etichettati da una proteina fluorescente che non è ECFP, ad es., C-fms-EGFP ^4,16.
   NOTA: Oltre alla visualizzazione delle cellule tumorali nel canale PCP, questo permette la visualizzazione di cellule mieloidi nel canale GFP ^4.
   E / O
2. Etichettare i vari componenti del microambiente metastatico utilizzando iniettabili in topi transgenici reporter fluorescente o topi di tipo selvatico (non fluorescenti).
   NOTA: Diversi composti può essere iniettato per etichettare vari componenti del microambiente metastatico, ad esempio, un AF647-coniugato Gr-1 anticorpo viene qui utilizzato per etichettare neutrofili e sono utilizzati alcuni monociti ^{13 e} diversi destrani peso molecolareper etichettare capillari polmonari. Per la preparazione di questi iniettabili vedere il punto 4.

3. Preparazione dei Materiali prima della dissezione

1. 2% agarosio
   1. Pesare 0,2 g di agarosio ed aggiungere a 10 ml 1 x PBS. Riscaldare la soluzione per sciogliere l'agarosio. Agarose solidificherà a RT, quindi mantenerlo a bagnomaria C 37 ° fino utilizzato per il riempimento.
2. _CO 2 e regolatore di temperatura
   1. Controllare _DDH 2 O nella camera di umidificazione. Riempire quando necessario. Inserire piastra di configurazione nel portatarga fase temperatura (camera climatica). Accendere il controller di CO ₂ e impostare CO ₂ al 5%. Assicurarsi che la portata d'aria è fissato a 0,4 Nl / min.
   2. Aprire l'aria e CO _{2 valvole.} Accendere il regolatore di temperatura. Assicurarsi che la temperatura della camera climatica e il coperchio sono fissati a 37 ° C.
   3. Scaricare la pressione dell'aria sul CO _{2 metri.} Controllare CO ₂ in aumento, equilibration può richiedere fino a 30 min.
3. Spinning disco microscopio confocale
   NOTA: I dettagli del microscopio set-up sono stati precedentemente descritti ^4,17.
   1. Attivare i laser (laser argon 488 nm di eccitazione e lo stato solido 405 nm, 561 nm e 640 nm laser). Accendere il microscopio, la telecamera, l'unità di controllo disco rotante, la AOTF, l'unità di controllo laser e il controllore fotocamera.
   2. Aprire l'otturatore microscopio, accendere il computer che esegue il microscopio e aprire il software.
4. Preparazione degli strumenti e la piattaforma dissezione.
   1. Accendere lo sterilizzatore a caldo tallone e lasciarlo raggiungere i 250 ° C. Pulire le 2 paia di forbici chirurgiche e pinze con acqua e sapone. Sterilizzare gli strumenti per almeno 30 sec. Lasciate che gli strumenti raffreddare. Utilizzare un coperchio di polistirolo come piattaforma di dissezione. Coprire con un pezzo di laboratorio soaker.

4. Preparazione di iniezioni

NOTA: A seconda del tempo di dimezzamento e la risposta preferita, iniettare fluorescente anticorpi e / o molecole fluorescenti o immediatamente prima del sacrificio animale o un paio di ore o giorni prima.

1. Per neutrofili immagine Gr1-positive e monociti, prepara una siringa con 7 ml di brodo Gr-1 anticorpi AF647-coniugato (1 mg / ml) in 100 ml di PBS sterile sotto il cofano. Posizionare un 27 G ½ ago sulla siringa.
2. Per capillari polmonari immagine, preparare una seconda e terza siringa con 100 ml di o 70 kD rodamina-destrano coniugato (4 mg / ml) o destrano 10 kD AF647-coniugato (4 mg / ml). Posizionare un 27 G ½ ago sulle siringhe.
3. Iniettare l'AF647 coniugato soluzione di anticorpi iv 5 ore prima di escissione polmoni.
4. Iniettare una o entrambe le soluzioni di destrano iv immediatamente precedenti l'escissione polmoni '.

5. Preparazione dei polmoni per ex vivo l'imaging dal vivo

NOTA: Prova a lavorare come sterile e accurato possibile per evitare inutili sfide delle cellule immunitarie nei polmoni.

1. Iniettare il intraperitoneale mouse (ip) con un sovradosaggio letale di anestetico consentita dal protocollo animale approvato da IACUC, ad es., 1 ml di 2,5% Avertin. Attendere il mouse per smettere di respirare e di essere completamente non-responsivi agli stimoli nocivi (zampa posteriore pinch).
   NOTA: dislocazione cervicale e biossido di carbonio l'eutanasia dovrebbe essere evitato in quanto può influenzare negativamente la vitalità delle cellule del polmone.
2. Immobilizzare il mouse su una tavola di dissezione e sterilizzare il mouse con il 70% di etanolo.
3. Utilizzare forbici chirurgiche prima fare una incisione epigastrica trasversale attraverso la pelle, seguita da un'incisione simile attraverso il peritoneo. Tenere la tavola di dissezione in posizione verticale e tagliare l'aorta discendente, in modo che le piscine sangue giù nell'addome e non nella cavità toracica.
4. Snip una piccola apertura nel diaframma per rilasciare il vuoto. Tagliare lungo la nervatura 10 e 12 di asportare il diaframma e ottenere accesso visivo ai polmoni.
5. Usare le forbici chirurgiche per tagliare la pelle fino alla trachea sopra la gabbia toracica, ma lascia intatta la gabbia toracica. Separare la pelle dalla cassa toracica. Esporre la trachea rimuovendo il tessuto connettivo circostante, facendo attenzione a non danneggiare la trachea stessa (Figura 1A).
6. Snip una piccola apertura di circa 1 mm di diametro nella trachea esposto parallelamente agli anelli cartilaginei, più vicino alla laringe possibile (Figura 1B). Fare attenzione a non tagliare completamente attraverso la trachea.
7. Prendere un ago G 20 e inserire delicatamente l'ago mm 4-5 nella trachea, senza alcuna forza contatore (Figura 1D). L'estremità dell'ago deve essere visibile attraverso la trachea (Figura 1C). Utilizzare pinze per stabilizzare l'ago nella trachea. In alternativa, una sutura può essere legato aroUnd la trachea per tenere l'ago in posizione.
   NOTA: Inserendo troppo profonda, la carena può essere traumatizzato o solo un lato dei polmoni potrebbe essere gonfiato.
8. Riempire una siringa con 400 ml di 37 ° C 2% agarosio a bassa temperatura di fusione (presa direttamente da un bagno a temperatura costante). Assicurarsi che la scheda di dissezione è in piedi e infondere lentamente l'agarosio caldo attraverso l'ago nei polmoni, usare ~ 400 microlitri per gonfiare i polmoni.
   NOTA: Guarda i polmoni gonfiano all'interno della cassa toracica. Non gonfiare eccessivamente il polmone come sarà rottura.
9. Una volta che i polmoni sono gonfiati, riempiendo ~ ⅔ della gabbia toracica, staccare la siringa e l'ago mantenere all'interno della trachea per evitare la fuoriuscita di agarosio.
10. Versare circa 50 ml di 20 ° C PBS oltre i polmoni gonfiati per consentire l'agarosio all'interno dei polmoni per impostare e solidificare. Lentamente rimuovere l'ago e chiudere la trachea con una pinza per evitare non solidificato agarosio da perdite.
11. Esporre i polmoni eseguendo una sternotomia e successivamente asportare i polmoni. Per escissione dei polmoni, trattenere la trachea durante il taglio attraverso la trachea completamente. Tirare delicatamente la trachea up, tagliare il tessuto connettivo e dell'esofago tirando i polmoni dalla cavità toracica fino polmoni è separato dal mouse (Figura 1E).
12. Immergere i polmoni a caldo RPMI-1640 per lavare via il sangue eccessivo e separare delicatamente i lobi utilizzando forbici e pinze per tagliare fusto principale bronco lobi 'in ilo (Figura 1F).
13. Posizionare i lobi, con la superficie piatta giù per massimizzare la superficie di imaging, in un pozzetto di una piastra di imaging 24 pozzetti (Figura 1G). Aggiungere 100 pl di 37 ° C RPMI-1640 in cima dei lobi. Posizionare diversi 15 mm vetrini di copertura microscopio circolare sulla parte superiore dei lobi per evitare che galleggianti.
14. Versare caldo PBS nei pozzetti circostanti per evitare che i media RPMI-1640 da evaporante. Inserire la piastra 24 pozzetti nella camera climatica equilibrato e mantenere i lobi polmonari a 37 ° C con aria e 5% CO _2. Inserire la camera climatica sul palco del microscopio confocale.
    NOTA: Altre miscele di gas (ad esempio, 5% O _2, 5% CO ₂ in N ₂ per esaminare il comportamento delle cellule in condizioni di ipossia / ossigeno inferiore) potrebbe anche essere considerato.

Figura 1. Protocollo per la preparazione dei polmoni per l'imaging in tempo reale. (A) esposizione della trachea dopo la preparazione del mouse. (B) Piccola snip fatto nella trachea esposto parallelamente agli anelli cartilaginei. (C) 20 ago G inserita 4-5 mm nella trachea. (D) instillazione di 400 microlitri 2% a bassa temperatura di fusione agarosio nei polmoni. (E) Inflpolmoni ATED separati dal mouse. (F) lobi separati dopo l'inflazione. (G) Lobi posto in un pozzo di una piastra di imaging 24-bene. Fai clic qui per vedere una versione più grande di questa figura.

6. Acquisizione e analisi di immagini

NOTA: Le immagini possono essere acquisite con una varietà di filatura del disco microscopio confocale supportati da vari programmi software. In questo protocollo, sia μManager con una filatura disco microscopio confocale misura o Zen con un disco di filatura microscopio confocale disponibile in commercio viene utilizzato per l'acquisizione dell'immagine, mentre Imaris viene utilizzato per l'editing di film e di analisi.

1. Acquisire le immagini utilizzando μManager. Un passo dettagliata da protocollo passo per l'acquisizione di immagini utilizzando il software μManager è descritto in precedenza ^18.
   O
2. acquisire le immaginiutilizzando il software di analisi delle immagini, come Zen (vedi Figura S1).
   1. Fare clic sulla scheda 'Locate' e scegliere obiettivo (10x o 20x) nello strumento di 'Light Path' (Figura S1A, scatola rossa). Successivamente, clicca su 'Occhi - DAPI' a guardare il canale PCP attraverso l'oculare (Figura S1A, scatola blu). Localizzare il campione manualmente utilizzando il microscopio. Fare clic su 'All Off'after il tessuto è centro del campo visivo.
   2. Fare clic sulla scheda 'Acquisizione' per impostare tutti i parametri per l'acquisizione delle immagini.
   3. Nello strumento di 'canali', fare clic sul pulsante '+' (Figura S1B, scatola rossa). Appare un menu pop-up e cercare il colorante (s) presente nel campione nel 'Dye Database' (Figura S1B). Selezionare il colorante e fare clic su 'Aggiungi'.
      NOTA: Il programma impostato tutti i filtri di ottimizzare. Un colorante può essere cancellatoselezionandolo seguito facendo clic sul pulsante del cestino (Figura S1B, scatola gialla).
   4. Nel menu 'Acquisition Mode', impostare 'Binning' a 5x5. Fare doppio clic sul ECFP nel menu canali per selezionarla. Abbassare la potenza del laser al 20% in modo che il campione non verrà sbiancato durante l'impostazione dei parametri di acquisizione delle immagini.
   5. Selezionare la casella 'piastrelle' nella sezione 'Experiment Manager' e lo strumento piastrelle compare nel gruppo di strumenti 'multidimensionale Acquisition' (Figura S1C). Fare clic sul pulsante 'Impostazioni avanzate' per visualizzare l'immagine dal vivo dalla telecamera. Fare clic sul pulsante 'Aggiungi' nella sezione 'posizioni' aggiungere da 4 a 6 posizioni per l'esperimento. Per cancellare una posizione, selezionare quella posizione e fare clic sul pulsante del cestino.
   6. Nel gruppo strumento 'acquisizione dei parametri', aprire lo strumento 'Strategia Focus', e selezionare 'Absolute fissa Z-position 'dal menu a discesa.
   7. Selezionare la casella Z-Stack nella sezione 'Experiment Manager' e lo strumento Z-Stack appare nel gruppo di strumenti del 'multidimensionale Acquisition' (Figura S1D). Fare doppio clic su una delle posizioni nella sezione 'posizioni' e premere 'Live'. Impostare manualmente prima e impostare ultima posizione del campo dell'imaging. Impostare l'intervallo di 4 micron.
      NOTA: Il programma determina il numero di fette per l'intervallo e l'intervallo selezionato. Idealmente, 5-7 fette sono convenienti per permettere la visualizzazione sufficiente e rapida acquisizione delle immagini.
   8. Controllare la casella 'Time Series' nella sezione 'Experiment Manager'. Set desiderato 'Durata' e tempi 'intervallo' in funzione 'Time Series' che è apparso nel gruppo di strumenti 'multidimensionale Acquisition' (Figura S1E).
   9. Nel 'acquisiModalità ne 'di menu, impostare' Binning 'a 2x2. Doppio click su un fluoroforo nel menu canali per selezionare e aumentare la potenza del laser al 100%. Premere 'Live' e regolare il 'tempo di esposizione'. Ripetere questa operazione per ogni fluoroforo.
   10. Selezionare la casella 'Enable Auto Save'. Selezionare una cartella e digitare il nome del file. Tutte le immagini acquisite verranno salvate automaticamente in questa cartella.
   11. Fare clic su 'Start Experiment' nella sezione 'Experiment Manager' per avviare l'acquisizione delle immagini.
3. Dopo l'acquisizione delle immagini, compilare i dati grezzi nel software Imaris. Convertire immagini in .ims i file e le regolazioni possono essere effettuate. Un passo dettagliata da protocollo passo per la conversione di file, le regolazioni e film risparmio utilizzando Imaris è descritto in precedenza ^18.
4. Quando si salva il film, impostare la 'Frame Rate' a 5 fotogrammi al secondo (fps).

Risultati

Utilizzando la microscopia confocale spinning-disk, i vari sistemi modello mouse e iniettabili, il microambiente metastatico possono essere visualizzati e monitorati nel tempo. L'utilizzo di un MMTV-PyMT; ACTB-ECFP; c-fms-EGFP tripla modello di topo transgenico, diversi componenti cellulari sono fluorescente (Figura 2A, Film 1). La struttura tipica del parenchima polmonare può essere visualizzato nel canale PCP poiché tutte le cellule esprimono ECFP sotto...

Discussione

Questo manoscritto descrive un metodo dettagliato per ex vivo l'imaging dal vivo di metastasi polmonare in modelli murini di metastasi. Questo protocollo di imaging fornisce una visualizzazione diretta delle interazioni tumore a cellule-stroma dinamici e spaziali all'interno del microambiente polmonare. Si tratta di un metodo relativamente semplice e veloce che permette l'imaging affidabile di metastasi polmonari per almeno 4 ore. Film acquisiti da questi esperimenti possono essere utilizzati per mo...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
MMTV-PyMT/FVB mice	Jackson Laboratory	2374	Female mice
ACTB-ECFP/FVB mice	UCSF Werb lab		Female mice
c-fms-EGFP/FVB mice	UCSF Werb lab		Female mice
FVB mice	Jackson Laboratory	1800	Female mice
GFP+ VO-PyMT cells	UCSF Werb lab
70,000 kDa Dextran, rhodamine-conjugated	Invitrogen	D1818	Dilute to  4mg/ml in 1 x PBS and store at -20  °C. Use 0.4 mg per animal.
10,000 kDa Dextran, Alexa Fluor 647 conjugated	Invitrogen	D22914	Dilute to  4mg/ml in 1 x PBS and store at -20  °C. Use 0.4 mg per animal.
Anti-mouse Gr-1 antibody Alexa Fluor 647	UCSF Monoclonal antibody core		Stock 1mg/ml. Use 7 ug per animal.
Anesthetic			Anesthesia approved by IACUC, used for anesthesia and/or euthanesia
1X PBS	UCSF cell culture facility
PBS, USP sterile	Amresco INC	K813-500ML	Ultra pure grade for i.v. injection
Styrofoam platform			Will be used as dissection board
Fine scissors sharp	Fine Science Tools	14060-11
Forceps	Roboz Surgical Store	RS-5135
Hot bead sterilizer	Fine Science Tools	18000-45	Turn ON 30min before use
Air	UCSF
Oxygen	UCSF
Carbon dioxide	UCSF
1 mL syringe without needle	BD	309659
27 G x 1/2 needle	BD	305109	for i.v. injection
20 G x 1 needle, short bevel	BD	305178
Low-melting-temperature agarose	Lonza	50111	To make 10 ml of solution, weigh 0.2 g of agarose, add to 10 ml 1 x PBS, and heat to dissolve. Agarose will solidify at room temperature, so maintain in a 37 °C water bath until used for inflation.
RPMI-1640 medium without phenol red	Life Technologies	11835-030
24 well Imaging plate	E&K scientific	EK-42892
Glass cover slides, 15 mm	Fisher Scientific	22-031-144
Digital CO2 and temperature controller	Okolab	DGTCO2BX	http://www.oko-lab.com
Climate chamber	Okolab		http://www.oko-lab.com
Cell Observer spinning disk confocal microscope	Zeiss
Zen software	Zeiss
Inverted microscope	Carl Zeiss Inc	Zeiss Axiovert 200M
ICCD camera	Stanford Photonics	XR-Mega-10EX S-30
Spinning disk confocal scan-head	Yokogawa Corporation	CSU-10b
Imaris	Bitplane
mManager	Vale lab, UCSF		Open-source software