La valutazione transcutanea della funzione renale nei roditori Conscious

Riepilogo

Determination of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard to assess overall kidney function. However, traditional procedures to measure this parameter are cumbersome and require a large investment of time. Here we describe a faster and minimally invasive method to determinate GFR transcutaneously.

Abstract

Glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard to assess overall kidney function. However, traditional methods to evaluate GFR are cumbersome and time-consuming. In addition, serial blood or urine samples are required, with the associated stress for the experimental animals. A recent technique significantly reduces the investment in time and resources, minimizing the invasiveness and the animal stress, but being equally valid as the traditional approaches. The method measures transcutaneously renal function. Using an optical device and the exogenous renal marker fluorescein isothiocyanate (FITC)-sinistrin, this technique is capable of measuring the elimination kinetics of the marker through the skin. With neither blood nor urine samples nor the associated laboratory assays needed, the results of the transcutaneous measurement are almost instantaneously available. The method has been already validated in different species and successfully applied in several models of renal pathology. Moreover, due to its minimally invasive characteristics, it is suitable for sequential measurements within the same animal. Here is provided a detailed protocol to carry out the transcutaneous assessment of renal function in rodents.

Introduzione

velocità di filtrazione glomerulare (GFR) è il miglior parametro per valutare la funzione renale complessiva. Il gold standard per determinare GFR si basa sulla clearance urinaria o plasma di marcatori renali esogeni, come inulina ^1. Tuttavia, queste procedure sono molto tempo e complicate, che richiedono la raccolta di sangue serie e / o campioni di urina e test di laboratorio posteriori per l'analisi. Inoltre, questi metodi sono invasivi e stressante per gli animali, limitando il numero di volte e la frequenza in cui le misurazioni possono essere ripetute. Un certo numero di approcci alternativi sono stati sviluppati per semplificare le procedure classiche per determinare GFR, ma ancora contare su urine e nel plasma di campionamento ^2-4 e / o richiedere l'anestesia profonda ^5,6, che è noto per influenzare l'emodinamica e la funzione renale ^{7, 8.} Prodotti finali del metabolismo, come creatinina, sono anche ampiamente utilizzati per stimare la funzione renale. Tuttavia, è noto che il AccurACY di questi marcatori endogeni non è ottimale e, inoltre, per analizzarli, urine o il prelievo di sangue è anche indispensabile.

Qui si descrive una metodologia transcutanea per valutare la funzione renale in animali coscienti. Questo metodo è più semplice e più veloce rispetto ai metodi tradizionali e solo minimamente invasiva. Con questa tecnica, utilizzando un dispositivo ottico miniaturizzato e -sinistrin esogeno renale marcatore fluoresceina isotiocianato (FITC), è possibile determinare la funzione renale quasi in tempo reale senza la necessità di plasma o campionamento urine e senza cateterizzazione chirurgico per somministrazione della sostanza. Grazie a queste caratteristiche, il metodo è adatto per effettuare misurazioni sequenziali nello stesso animale.

FITC-sinistrin è un marcatore renale liberamente filtrato dal glomerulo, senza riassorbimento tubulare e secrezione. La parte ottica del dispositivo miniaturizzato costituito da due diodi emettitori di luce (LED), che eccitanoil marcatore somministrato e un fotodiodo per rilevare la fluorescenza emessa attraverso la pelle. I dati registrati vengono memorizzati nella memoria interna integrata nel dispositivo e possono essere utilizzati per generare la cinetica di eliminazione curva di FITC-sinistrin. L'alimentazione è fornita da una piccola batteria al litio ricaricabile. Per informazioni più dettagliate sul dispositivo e dei suoi singoli componenti fare riferimento alla Schreiber et al. ^9. Il dispositivo è facilmente montato sul corpo animale con un cerotto biadesivo trasporta una finestra trasparente per i componenti ottici. I risultati sono prontamente disponibili dopo il periodo di registrazione è finita.

Con il metodo e protocollo fornito qui, si introduce una tecnologia promettente che potrebbe sostituire l'attuale gold standard per determinare GFR, non solo nella ricerca, ma anche in campo clinico.

Protocollo

esperimenti necessari per sviluppare il protocollo sono stati eseguiti secondo le normative nazionali ed è stato approvato dal comitato etico della scienza locale (Regierungspräsidium Karlsruhe).

1. Preparazione di FITC-sinistrin soluzione per l'iniezione

1. Sciogliere FITC-sinistrin in soluzione salina fisiologica per preparare una soluzione madre. La dose raccomandata nei topi è di 7,5 mg / 100 g di peso corporeo (BW), mentre nei ratti 5 mg / 100 g BW FITC-sinistrin è preferibile. Per i topi, preparare una soluzione di soluzione FITC-sinistrin a 15 mg / ml, mentre per i ratti preparare a una concentrazione di 40 mg / ml.
   Nota: Soluzione FITC-sinistrin può essere preparato in anticipo e conservati a -20 ° C al riparo dalla luce.

2. Preparazione degli animali

1. Acclimatare animali per almeno una settimana prima della loro introduzione in ogni esperimento.
2. Anestetizzare l'animale utilizzando 5% isoflurano a 5 l / min O ₂ Flusso per 2 minuti.
3. Verificare che l'animale sia adeguatamente anestetizzato osservando il suo respiro, che diventa più lenta e profonda, e verificare assenza di reazione con una mancanza di una risposta dito del piede.
4. Una volta che l'animale è addormentato, ridurre l'anestesia al 2,5% isoflurano a 2 L / min O ₂ portata e prendere il BW.
5. Rimuovere il pelo dal fianco del dorso dell'animale con un rasoio elettrico. Radere una superficie leggermente più grande l'area che verrà occupata dal cerotto biadesivo, che ha dimensioni di 3 cm x 6 cm.
6. Successivamente applicare la crema depilazione per un breve periodo (2-3 min) per rimuovere il pelo rimanente.
7. Lavare accuratamente l'area fino a quando la crema è stato completamente rimosso, come la crema in sé può essere fluorescente.
   Nota: Evitare di graffiare la pelle dell'animale in quanto può produrre irritazione / edema. Se l'area depilata mostra la pigmentazione della pelle, radere un'area maggiore fino a quando un punto non pigmentato per laparte ottica del dispositivo risulta. Si raccomanda di radersi 24 ore in anticipo per ridurre al minimo l'esposizione all'anestesia.

3. Dispositivo Preparazione

1. Posizionare il dispositivo ottico per misurare la funzione renale su un lato del cerotto biadesivo, posizionando la parte ottica sopra la finestra trasparente (Figura 1) lasciando la parte opposta con la pellicola protettiva.
   Nota: Quando si lavora con piccoli roditori, ridurre le dimensioni del patch come mostrato nella Figura 2.
2. Attaccare un pezzo di cerotto biadesivo di dimensione corrispondente alla batteria come illustrato in figura 3.

4. Fissaggio del dispositivo sull'animale

1. Calcolare il volume appropriato di iniezione in base al peso corporeo dell'animale.
2. Anestetizzare l'animale con isoflurano come precedentemente indicato sezioni 2.1-2.3.
3. Tagliare un pezzo di garza tubolare elastico benda of circa 1 cm di lunghezza superiore alla larghezza del cerotto biadesivo da utilizzare.
4. Estrarre il bendaggio elastico della garza sulla testa dell'animale e posto sulla schiena, lasciando la zona rasata scoperto.
   Nota: In alternativa, fissare il dispositivo utilizzando solo nastro adesivo, ma essere consapevoli di indebite pressioni sul dispositivo.
5. Collegare la batteria al dispositivo inserendo la spina della batteria alla porta corrispondente sul dispositivo. Dopo che rimuovere il foglio protettivo dal pezzo di cerotto e montare la batteria sulla superficie superiore del dispositivo (Figura 4A). Assicurarsi che la batteria sia collegato correttamente controllando che il dispositivo inizia a lampeggiare.
   Nota: Nei ratti, la batteria può essere anche fissato direttamente sul cerotto, accanto al dispositivo (Figura 4B).
6. Rimuovere la protezione dal cerotto con il dispositivo di azionamento e posizionarlo sulla zona rasata sul dorso dell'animale tenendolos bordi finché non viene risolta correttamente.
7. Coprire il dispositivo con il tubolare benda di garza elastica aderente alla superficie adesiva del cerotto (Figura 5).
8. Correttamente allungare la benda tubolare sull'addome dell'animale, garantendo che gli arti possono muoversi liberamente.
9. Per una fissazione e protezione del dispositivo migliore, applicare una striscia di nastro adesivo seguendo la forma del dispositivo e che copre i fili della batteria.
10. Misurare sfondo per 1 a 3 min, senza mettere pressione sul dispositivo

5. FITC-sinistrin Amministrazione e Procedura di misurazione

1. Se necessario, riscaldare la coda dell'animale con acqua calda prima iniezione o una piastra riscaldante a temperatura controllata lungo tutto il procedimento.
2. Iniettare attraverso vena della coda il volume appropriato di soluzione FITC-sinistrin magazzino. Il volume di iniezione dipende BW animali e, pertanto, deve essere calcolato per ogni singolo considering la dose desiderata e la concentrazione di soluzione di riserva, già citato nel paragrafo 1.1.
3. Assicurarsi che tutta la soluzione FITC-sinistrin viene somministrato per via endovenosa e non per via sottocutanea.
   Nota: In alternativa, coniugati con sinistrin può essere somministrato tramite un catetere endovenoso pre-impiantato uscito alla nuca nei roditori o tramite iniezione orbitale retrò nei topi.
4. Cautela, restituire l'animale a sua gabbia casa evitando forti movimenti e qualsiasi pressione sul dispositivo, come sarebbe introdurre artefatti di movimento.
5. Posizionare la gabbia casa in un luogo tranquillo per evitare che l'animale è disturbato.
6. Eseguire la misurazione per almeno 1 ora se si lavora con i topi e 2 ore quando si usa ratti. Durante questo periodo, il dispositivo ottico misurerà attraverso la pelle la fluorescenza emessa da FITC-sinistrin.
   Nota: Durante il periodo di registrazione l'animale deve essere ospitati solo. Inoltre approvvigionamento idrico, nonché sporgentistrutture come i coperchi filo, devono essere rimossi per evitare di danneggiare i dispositivi e di movimento artefatti elettronici a causa di urti con oggetti.

Rimozione 6. Dispositivo

1. Una volta che il periodo di registrazione è finita, rimuovere il dispositivo senza anestesia; tuttavia, se necessario, anestetizzare l'animale brevemente sotto 5% isoflurano a 5 l / min O ₂ tasso di consegna durante la 2 min.
2. Con cautela, tirare fuori il nastro adesivo, poi la benda tubolare.
3. staccare delicatamente il cerotto biadesivo dalla pelle e restituire l'animale al suo normale gabbia casa.

7. Leggi di dati

1. Scollegare la batteria dal dispositivo e rimuovere la patch adesivo.
   Nota: I dati vengono memorizzati sul dispositivo fino a quando inizia una nuova misurazione. Quando è collegato una batteria i dati memorizzati vengono sovrascritti con le nuove registrazioni. Pertanto, non ricollegare la batteria prima di scaricare i dati daldispositivo. Vi è un periodo di grazia di 10 secondi destinato a reconnections accidentali della batteria.
2. Collegare il dispositivo a un PC utilizzando un cavo micro USB e scaricare i dati utilizzando il software in dotazione. Il file di output è un file .csv che può essere aperto e modificato con un programma di foglio di calcolo.
3. Aprire il file di dati con il software specifico per il dispositivo ottico e generare la curva cinetica di eliminazione utilizzando i protocolli software.
4. Analizzare la curva seguendo le istruzioni fornite con il dispositivo ottico. Poco, per la valutazione dei dati, impostare il segnale di fondo misurata prima somministrazione FITC-sinistrin e segnare l'inizio della fase di escrezione esponenziale del marcatore, che di solito avviene 15 min e 45 min dopo l'iniezione del bolo, in topi e ratti rispettivamente .
   Nota: il software visualizza automaticamente la FITC-sinistrin emivita (t _1/2) con un valore di R ^2, determinato da un 1-Comparmodello di tment. t _1/2 può essere utilizzato per calcolare il GFR utilizzando un fattore di conversione ^9,10.

Risultati

La configurazione della misurazione transcutanea è molto semplice e veloce: il dispositivo è posto sul cerotto biadesivo (Figura 1) e regolata in dimensioni se necessario (Figura 2), la batteria è disposta (figura 3) e connesso (Figura 4).

Questo metodo per valutare la funzionalità renale è già stato validato in diverse specie in confronto con l'approccio tradizionale della clearance plasmatica ^9,11,12. Seguendo il protocollo qui esposta, Schreiber et al. dimostrato la validità della tecnica in diversi modelli murini, mostrando risultati molto simili tra la misurazione e clearance plasmatica transcutanea per tutti i gruppi studiati (Tabella 1) ^9. In questo lavoro la t ottenuto _1/2 è stato convertito in GFR utilizzando un mouse specifico di conversione semi-empiricafattore.

La consistenza della valutazione transcutanea della funzione renale è stata anche dimostrata utilizzando diversi ceppi di topi. Misurazioni sequenziali entro 3 giorni, nello stesso animale ha mostrato un coefficiente delle varianze di 3,0-6,2% ^13. In questo studio non vi era alcuna conversione di GFR, ma i risultati sono stati espressi ed interpretati direttamente in termini di t _1/2.

La possibilità di avere i risultati quasi in tempo reale è uno dei grandi vantaggi di questo metodo. Dopo il periodo di registrazione, i risultati sono immediatamente disponibili per l'analisi e il software fornito visualizza la curva escrezione di FITC-sinistrin istantaneamente (Figura 6). Entro lo stesso software t _1/2 di FITC-sinistrin può essere ottenuta, che può essere utilizzato direttamente come parametro per valutare la funzione renale di convertito in termini di GFR. Figura 7 mostra come appare la curva di escrezione FITC-sinistrin misurata transcutanea in un animale con insufficienza renale. Quando la funzione renale è influenzato, coniugati con sinistrin t _1/2 aumenta a causa della ridotta escrezione della sostanza e l'aspetto dei cambiamenti curva. In genere, la curva misurata non torna al livello di fondo e presenta una superficie maggiore sotto la curva. Nello stesso animale, misurazione da pre a post-infortunio possono sperimentare un aumento dell'intensità massima di fluorescenza a causa di accumulo del marcatore causato dalla sua escrezione ridotta. In presenza di insufficienza renale, la curva transcutanea misurata di FITC-sinistrin può mostrare uno stato di equilibrio a causa di funzione gravemente compromessa (Figura 7B).

L'uso del dispositivo miniaturizzato in diversi ceppi di roditori con differente stato sanitario ha dimostrato che questa tecnica è adatto e abbastanza sensibile per rilevare i cambiamenti due alla malattia renale e l'invecchiamento. La tabella 2 mostra una sintesi dei modelli murini studiati fino ad oggi con questo metodo.

Figura 1. Il posizionamento del dispositivo sul cerotto biadesivo. Il dispositivo è montato sul posizionamento cerotto sua parte ottica nella finestra trasparente.

Figura 2. Adattamento cerotto adesivo per piccole dimensioni roditori. Per uso in piccoli animali si consiglia di ridurre le dimensioni del patch. A: utilizzare il dispositivo come una guida per tagliare la patch correttamente. B: Una volta che la dimensione desiderata è stata ottenuta, il dispositivo può essere disposto sulla superficie adesiva del cerotto. Pleasing clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3. Preparazione della batteria. Per collegare il dispositivo alla batteria, tagliare un pezzetto di cerotto adesivo su due lati (A e B) e posizionarlo sulla superficie della batteria (C). Clicca qui per visualizzare un grande versione di questa figura.

Figura 4. Collegamento e posizionamento della batteria durante la misurazione. (A) In piccoli roditori come topi, a causa dello spazio ridotto, la batteria deve essere collocato sulla parte superiore del dispositivo. (B) In animali più grandi della batteria cun essere posizionato accanto al dispositivo. Fai clic qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5. Il posizionamento del tubo benda di garza elastica in un topo. Il bendaggio tubolare dovrebbe coprire la patch biadesivo senza interferire con la libera circolazione degli arti per il comfort dell'animale. Clicca qui per vedere una versione più grande questa figura.

Figura 6. immagine rappresentativa di una curva eliminazione di FITC-sinistrin. Il segnale generato dal FITC-sinistrin viene rilevato transcutaneamente e memorizzati nella memoria interna del dispositivo. Quando i dati registrati vengono scaricati su un PC, il software genera una curva simile a quella presentata nell'immagine. Asse Y mostra l'intensità di fluorescenza registrata [AU], emessa dal marcatore FITC-sinistrin iniettata, mentre asse X rappresenta la durata della misurazione nel tempo [min]. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 7. immagine rappresentante di una curva eliminazione di FITC-sinistrin in animali con insufficienza renale. (A) Curva eliminazione FITC-sinistrin negli animali con ridotta funzionalità renale mostra in genere una maggiore area sotto la curva e l'incapacità di raggiungere la linea di base all'interno del normale periodo di misurazione . (B) In animali gravemente compromessa la curva transcutanea misurata può mostrare uno stato stazionario che indica l'insufficienza renale. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Tabella 1. La convalida della misura transcutanea confrontando con la clearance plasmatica tradizionale. La misurazione transcutanea della funzione renale è stato convalidato in diversi modelli murini (sana e unilateralmente nephrectomized (UNX C57BL) / 6-129 SV topi e modello murino di nefronoftisi ( PCY)) per confronto con clearance plasmatica. I valori sono medie ± SD. GFR, velocità di filtrazione glomerulare ^9.

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Tabella 2. Modelli murini studiate usando la misura transcutanea UNX, unilateralmente nephrectomized.; ACE, inibitori dell'enzima di conversione; T ^{gumodwt / peso,} transgenico uromodulina knockout, SD, Sprague Dawley ratto; PKD, la malattia del rene policistico.

Discussione

Il presente lavoro descrive la procedura per determinare la funzione renale nei roditori coscienti utilizzando un dispositivo miniaturizzato ed il esogeno marcatore renale FITC-sinistrin. Come detto prima, questo metodo presenta diversi vantaggi rispetto ai procedimenti tradizionali di passaggio urinario e plasma. Uno di questi è l'indipendenza dal sangue e nelle urine di campionamento che porta a grandi risparmi in termini di consumo, tempo e, naturalmente, stress animale.

Come mostrato nella Tabella 2, il esogeno marcatore renale FITC-sinistrin e la misurazione della cinetica di eliminazione attraverso la pelle permettono l'impatto delle patologie renali sulla funzione renale da studiare ^9,10,14-18. La raccolta di serie di campioni di sangue necessarie per valutare la clearance plasmatica o biomarcatori di malattia renale sono stressante per l'animale, ingombrante e in termini di tempo per i ricercatori. Pertanto, le misure sequenziali all'interno dello stesso animale sono stati limdisattivato da il benessere degli animali e motivi metodologici. La riproducibilità dimostrato all'interno animale della misura transcutanea ¹³ lo rende un metodo ideale per rilevare i cambiamenti nella funzione renale a causa di progressione della malattia o invecchiamento. Per la stessa ragione, può anche essere estremamente utile per studiare l'efficacia di approcci terapeutici.

Due passaggi critici per il successo applicazione di questa tecnologia sono la fissazione del dispositivo ottico sull'animale e la corretta gestione del marcatore. Il dispositivo deve essere opportunamente fissato al fine di evitare artefatti di movimento. A tal fine, impedendo l'attacco e il distacco del cerotto biadesivo è fondamentale in quanto può portare alla perdita delle sue proprietà adesive e in definitiva una fissazione contenuti sull'animale. Come accennato nel protocollo, l'immobilizzazione e la protezione del dispositivo ottico coprendolo con del nastro adesivo è un approccio efficace per garantire un Adequate fissazione. Quando si esegue l'iniezione in bolo FITC-sinistrin è fondamentale per gestire tutta la sostanza per via endovenosa e non per via sottocutanea. Il rilascio del marcatore nel tessuto sottocutaneo può essere facilmente identificato da un anello giallo che circonda la coda dell'animale prodotto dal proprio colore di FITC-sinistrin. Una iniezione sottocutanea si manifesta in genere come una curva più piatta e il tempo marcatore escrezione prolungata. L'eventuale limitazione di questo metodo è più legato al marcatore usato rispetto alla tecnologia in sé. Quando un edema è presente nella pelle di un animale, non sarebbe raccomandato la valutazione transcutanea della funzione renale, in quanto vi è un vano aggiuntivo che potrebbe alterare le dinamiche di escrezione di FITC-sinistrin. Allo stesso modo, la pelle pigmentata può limitare l'uso della tecnica dovuta alla sovrapposizione di eccitazione ed emissione spettri di FITC-sinistrin e melanina. Tuttavia, in animali con pigmentazione cutanea a chiazze, il problema è risolto posizionando l'otticaparte del dispositivo in una zona non pigmentato.

È possibile modificare diversi aspetti della valutazione transcutanea della funzione renale in modo da adattare la procedura per diverse specie animali e / o approcci. Per esempio, il dosaggio FITC-sinistrin raccomandati o la lunghezza della misura può essere regolata a seconda dell'obiettivo dell'esperimento e di specie diverse o modelli animali. Questa adattabilità del metodo è già stata confermata dalla sua applicazione di successo in diverse specie di roditori e diversi tipi di ceppi con condizioni di salute diverse. Inoltre, la valutazione transcutanea della funzione renale è stato recentemente validato in cani e gatti ¹² con ottimi risultati. A causa delle differenze indubbie tra questi animali e roditori, questo studio ha determinato la dose appropriata di FITC-sinistrin per entrambi, cani e gatti, ed è eseguito un tempo molto più lungo di misura, 4 ore invece di 1 o 2 ore di usod nei roditori.

Presi insieme, l'uso di questa tecnica ci può aiutare a ottenere informazioni più precise in nefrologia, tra cui una migliore comprensione della progressione della malattia renale e l'effetto delle terapie. Le caratteristiche della valutazione transcutanea della funzione renale pone come una tecnica adatta per essere applicata in campo clinico umano e veterinario nel futuro, e devono essere considerati come una tecnologia promettente per sostituire gli approcci tradizionali.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
NIC-Kidney device	Mannheim Pharma & Diagnostics GmbH		Software, batteries and chargers are provided together with the device/s. Orderings should be done through info@mapdiagnostics.com
FITC-sinistrin	Mannheim Pharma & Diagnostics GmbH		Orderings should be done through info@mapdiagnostics.com
Double-sided adhesive patch	Mannheim Pharma & Diagnostics GmbH		Orderings should be done through info@mapdiagnostics.com
Isis Rodent electric shaver	Braun Aesculap	GT420
Isoflurane	Abbott GmbH	PZN4831850
Leukosilk adhesive tape	BSN medical	102200
Tubular elastic gauze bandage	MaiMed Medical GmbH	73012	There are different sizes available. Size 1 is recommended for mice.
Veet depilation cream	Reckitt Benckiser	PZN7768307	Sensitive skin formulation is recommended as is more gentle with the skin of the animals
Micro USB cable	Samsung	APCBU10BBE
Deltajonin Physiologic solution	AlleMan Pharma GmbH	3366954	Alternatively, it can be used saline or PBS