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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

In questo studio, una camera di flusso nano-microfluidica è stato impiegato per visualizzare e caratterizzare funzionalmente la motilità contrazione del Xylella fastidiosa, un batterio che causa la malattia di Pierce a Grapevine.

Abstract

Xylella fastidiosa è un batterio non flagellated Gram-negativi che provoca una serie di malattie economicamente importanti delle piante. La motilità spasmi fornisce X. fastidiosa un mezzo per il movimento a lunga distanza intra-impianto e la colonizzazione, contribuendo verso patogenicità in X. fastidiosa. La motilità contrazioni di X. fastidiosa è gestito da pili di tipo IV. Tipo IV pili di Xylella fastidiosa sono regolati da Pell, un regolatore di chemiotassi in Pil-CHP proteine ​​di codifica operone che sono coinvolti con le vie di trasduzione del segnale. Per chiarire i ruoli di Pell nella motilità contrazioni di X. fastidiosa, un Pell -carente mutante Xf ΔpilG e il suo sforzo complementare XfΔpilG- C contenente nativo Pell sono stati sviluppati. A camere di microfluidica integrati con un sistema di registrazione di immagini time-lapse è stato utilizzato per osservare spasmi motilità in XfΔpIlg, XfΔpilG- C e il suo ceppo wild-type. Usando questo sistema di registrazione, permette a lungo termine osservazioni spaziali e temporali di aggregazione, la migrazione delle singole cellule e delle popolazioni di batteri via spasmi motilità. X. fastidiosa wild type e complementare ceppo XfΔpilG- C hanno mostrato caratteristiche tipiche spasmi motilità osservati direttamente nelle camere di flusso microfluidica, mentre mutante XfΔpliG esposto il fenotipo carente spasmi. Questo studio dimostra che pilg contribuisce alla motilità spasmi di X. fastidiosa. La camera di flusso microfluidica viene utilizzato come mezzo per osservare spasmi motilità.

Introduzione

Xylella fastidiosa è un batterio Gram-negativo non flagellated, patogeno che provoca una serie di malattie economicamente importanti colture, compreso il morbo di Pierce a vite (Vitis vinifera L.) 1,2, 3. Questo batterio è limitata alla xilema conducibilità dell'acqua vasi. L'infezione di vite provoca il blocco dei vasi xilematici e si traduce in stress idrico e carenze nutrizionali 3. Colonizzazione successo dipende dalla capacità del batterio di muoversi dal sito iniziale di infezione per il resto dell'impianto 3. Contrazione motilità è un mezzo di movimento batterica flagellare-indipendente, tramite l'estensione, l'attaccamento, e la scomparsa della tipo polare IV pili 4 che è stato caratterizzato X. fastidiosa 5,6,7.

La motilità contrazione è stato osservato da pinzette laser e microscopia a forza atomica (AFM) 8,9,10. Utilizzando queste tecniche, tmotilità delle streghe generati dal tipo IV pilus di N. gonorrhoeae e P. aeruginosa sono stati caratterizzati da fl pili etichettatura uorescently e catturare i loro movimenti al microscopio. Sebbene entrambi i metodi hanno dettagliato la forza adesiva dei singoli batteri, le procedure sono complicato e lungo 9,10. I micro camere uidic fl sono stati usati per osservare la migrazione a lunga distanza delle singole cellule, così come piccoli aggregati di cellule batteriche 5,6. Queste camere sono state progettate come un microfabbricazione-nano-canale in un piatto integrato con un sistema di registrazione di immagini time-lapse 11,12,13,14. Micro fl dispositivi da camera uidic offrono diversi vantaggi per lo studio delle interazioni comportamentali movimento e cellula-cellula di batteri: (i) fornisce una piattaforma integrata con molteplici funzionalità del canale; (Ii) le spetta esaminare i movimenti e le aggregazioni di singole cellule nelle caratteristiche nano-scala di batteri; (Iii) permette di m direttaicroscopic registrazione delle immagini delle cellule batteriche e analisi time-lapse, (iv) fornisce a lungo termine osservazioni spaziali e temporali di singoli e / o popolazioni di batteri in un micro-ambiente; (V) la portata del mezzo di coltura in un canale può essere controllata con precisione è richiesta (vi) solo un piccolo volume (1 ml) di mezzo di coltura per ciascun esperimento.

Di recente, il micro fl uidic flusso sistema è stato impiegato per studiare i comportamenti di cellule batteriche in diversi microambienti 14,15,16. L'adesività e l'attaccamento superficie E. coli 15, X. fastidiosa 16, e Acidovorax citrulli 14 alle superfici di vetro sono stati valutati utilizzando micro fl camere uidic. La formazione di aggregazione e bio fi lm mediato dal tipo IV pili di Acidovorax citrulli sono stati analizzati 14. Inoltre, il movimento di A. citrulli osservato sotto flusso cONDIZIONI hanno dimostrato che il pili di tipo IV può svolgere un ruolo importante nella colonizzazione e la diffusione di A. citrulli in vasi xilematici sotto alburno flusso condizioni. I motilità contrazione del Pseudomonas aeruginosa e X. cellule fastidiosa sono state osservate con successo contro una corrente di fluido in una camera di flusso microfabbricazione 5,6,17. Tipo IV pilus carente pilB e pilQ mutanti di X. fastidiosa sono stati trovati di alterare profondamente la velocità di spasmi motilità nelle condizioni di fl usso in Micro Devices uidic fl 5,6,18. Gli studi condotti su adesione batterica e la motilità in micro dispositivi uidic fl indicato che i micro fl camere uidic sono particolarmente adatti per l'analisi della motilità contrazioni e la migrazione dei batteri pili mediata in vitro. Questi risultati spiegano il meccanismo di migrazione spasmi-mediata che facilita l'attaccamento cellula-cellula, l'aggregazione e la colonizzazione all'internoil padrone di casa, alla fine portano a infezioni sistemiche.

Pil-Chp operone di X. fastidiosa contiene Pell, Pili, pilJ, pillola, chpB e CHPC quale segnale di trasduzione codifica Percorsi di 20. I chemocettori transmembrana legano stimoli chimici nel dominio periplasmic e attivare una cascata di segnali nella loro porzione citoplasmatica di controllare in ultima analisi batterica motilità spasmi. Nel operone Pil-Chp di X. fastidiosa, una proteina Pell fosfo-navetta è un omologo di CheY. In E. coli e P. aeruginosa, CheY è il regolatore di risposta in sistemi chemiotassi che interagiscono con le proteine ​​motrici flagelli 19, 21. Anche se i contributi di dell'operone Pil-Chp verso virulenza in X. fastidiosa stati esaminati recentemente 20, il ruolo di Pell in chemiotassi operone in risposta ai segnali ambientali e regolata / motore tipo IV pili di X. fastidiosa è uncLear. Per chiarire l'intuizione di regolatore di chemiotassi Pell nell'attività di spasmi motilità di X. fastidiosa, una camera uidic fl micro è utilizzato per valutare la motilità contrazioni di X. fastidiosa. La Pell di X. fastidiosa è caratterizzata confrontando i fenotipi di una delezione mutante Xf ΔpliG, ceppo complementare XfΔpliG -C e la sua wild type in vitro. I risultati evidenziano il ruolo di Pell nella motilità contrazioni di X. fastidiosa.

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Protocollo

1. La periferica Fringe di batterica Colony

  1. Grow X. fastidiosa (Xf) Temecula selvaggio di tipo 22, Pell delezione mutante Xf ΔpliG (utilizzando descritto in precedenza strategia di eliminazione 23), e il suo complementare XfΔpliG -C (utilizzando descritto in precedenza strategia di complementazione genetica cromosomica basata su 24) su PD2 piastre di agar 25 a 28 ° C per 5-7 giorni.
  2. Cellophane Autoclave (1 x 1 cm 2) in acqua a 121 ° C (249 ° F) per 15 min. Pick up un pezzo di cellophane, scaricare l'acqua toccando un angolo di cellophane su un piatto vuoto Petri, adagiare il cellophane oltre il 15% della superficie agar e asciugare all'aria.
  3. Pick up individuale X. colonie fastidiosa con sterile stuzzicadenti arrotondati e le cellule del punto in modo asettico su un foglio di cellophane sterilizzato sovrapposto sul 15% della superficie agar in piastre di agar. Incubare la piastras a 28 ° C per 2-3 giorni.
  4. Esaminate la morfologia bordo delle colonie utilizzando un microscopio da dissezione con una lente obiettivo 2X e una lente oculare 10X. Fotografare la frangia periferico intorno colonie.

2. camere di flusso e microscopia microfluidici

  1. Fabbricare dispositivi microfluidici che utilizzano procedure di foto-litografico simili a quelli precedentemente descritti 5,18. Design a quattro canali paralleli con il software di progettazione assistita da computer su wafer di silicio master con i metodi litografici standard di 26.
  2. Creare le camere di microfluidica dal maestro wafer di silicio con polidimetilsilossano (PDMS). Versare PDMS polimerizzate sopra master wafer di silicio e curare a 60 ° C per 1 ora. Staccare la replica PDMS dal master di wafer e tagliare la replica PDMS con una lama in un 22 mm x 40 mm come la stessa dimensione di un vetrino di vetro.
  3. Esporre la replica PDMS, un vetrino di vetro (22 x 40 mm 2), ed un microscscivolo OPE (51 x 76 mm 2) per il plasma aria a 30 W per 2 min 27. Sandwich il corpo PDMS tra il vetrino di vetro e il microscopio di vetro per costruire la camera di uidic fl micro.
  4. Praticare un foro (5,5 mm di diametro) attraverso le PDMS a ciascuna estremità del canale fantasia. Tagliare il tubo di gomma di silicone in lungo 12-20 cm. Inserire un'estremità del tubo di gomma di silicone (5,1 mm di diametro esterno 2,1 mm diametro interno 0,8 mm parete) in ciascuna estremità dei canali della replica PDMS apertura e sigillare con PDMS polimerizzate a 60 ° C per 1 ora.
  5. Collegare un'altra estremità del tubo al fine spinato di connettori luer plastica. Avvolgere le camere microfluidica assemblati con il foglio di alluminio e autoclave per 20 min.
  6. Raccogliere batteri cellule di X. fastidiosa wild type, mutante Xf ΔpliG, e complementare XfΔpliG -C tramite raschiatura, utilizzando inoculo monouso loop da PD2 piatti di media. Regolare la densità cellularead una densità ottica di 0,05 a 600 nm in PD2 brodo come descritto in precedenza 23. Raccogliere la soluzione di cellule batteriche in una tenuta di gas siringa da 1 ml.
  7. Montare il dispositivo a microfluidi su un palco microscopio invertito. Collegare un tubo di ingresso alla siringa a tenuta di gas da 5 ml contenente PD2 brodo. Montare il 5 ml a tenuta di gas siringa con le pompe a siringa.
  8. Collegare il tubo di scarico ad un serbatoio dei rifiuti. Mantenere una velocità media di flusso di 0,2 ml min -1 per 30 minuti per stabilizzare il sistema.
  9. Collegare i tubi laterali di ingresso ad un 1 ml a tenuta di gas siringa contenente la soluzione cellula batterica. Lavare la soluzione cellula batterica attraverso il tubo di gomma fino a raggiungere il canale. Mantenere una portata media di 0,2 ml min -1 per altri 30 minuti, al fine di svuotare le cellule non legato dalla camera prima di cattura delle immagini.
  10. Montare l'otturatore microscopio sotto la parte di campo-adjusted del microscopio per controllare la luce. Collegare l'otturatore per l'otturatore coSistema ntrol e collegare il sistema di controllo dell'otturatore al computer.
  11. Montare una fotocamera digitale alla porta video del microscopio e collegarlo al computer. Eseguire il software di registrazione time-lapse, selezionare la funzione "scatto" dal menu, e riconoscere automaticamente l'otturatore installato di default nel software per stabilire connessioni a l'otturatore con il software.
  12. Selezionare la funzione "fotocamera digitale" dal menu del software di registrazione time-lapse di riconoscere automaticamente la fotocamera digitale come dispositivo di acquisizione di default nel software e stabilire la comunicazione con la fotocamera digitale con il software.
  13. Individuare le cellule batteriche in uno dei canali che utilizzano 20X ottica a contrasto di fase, quindi passare alla lente obiettivo 40X prima di cattura delle immagini.
  14. Eseguire il software di registrazione time-lapse, selezionare la funzione "acquisizione delle immagini" utilizzando parametri di default dal menu per acquisire le immagini del microscopio.Quindi, aprire la funzione "Acquisire time-lapse" e impostare l'intervallo di tempo di 30 sec 5,18,28 per la durata di 6-24 ore a seconda esperimento necessario per osservare spasmi motilità di X. fastidiosa 5,18,28. Fai clic su "OK" per avviare la registrazione time-lapse. Fai clic su "Funzione Stack" dal menù, selezionare "Salva con nome" per impilare le immagini nella cartella di destinazione sul computer dopo aver terminato la registrazione.
  15. Per più canali, catturare immagini time-lapse dal primo canale ogni 30 sec per 6 ore. Spostare la lente dell'obiettivo del microscopio al canale successivo per individuare le cellule bersaglio. Ripetere la funzione di time-lapse, come descritto sopra per catturare immagini in ciascuno dei quattro canali in sequenza se esperimento è configurato per utilizzare quattro canali. Continuare l'acquisizione di immagini time-lapse per fino a tre giorni consecutivi. Tutti gli esperimenti sono stati condotti a temperatura ambiente (23 ± 2 ° C).
  16. Compilare le immagini time-lapse in unfile video utilizzando il software di imaging di registrazione time-lapse. Eseguire il software di registrazione time-lapse, fai clic su "funzione di Stack" dal menu, e selezionare "la funzione stack open" per aprire i file impilati dal computer.
  17. Avviare la funzione "Crea filmato" dal modulo pila, selezionando le immagini e scegliere il formato di output "AVI". Fare clic su "salva con nome" per salvare il file video nella cartella di destinazione sul computer.
  18. Selezionare i filmati raccolti dalla cartella di destinazione sul computer e riprodurli. Poi, osservare la motilità delle singole celle attraverso la visualizzazione risultante dell'attività spasmi motilità delle cellule batteriche nei file video generati.

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Risultati

La presenza di una frangia colonia periferico indicativa di tipo IV pilus-mediata spasmi motilità, è stato osservato nelle colonie di X. fastidiosa wild type e complementare ceppo Xf ΔpliG -C (Figura 1). Mutante XfΔpliG, tuttavia, non ha evidenziato una frangia intorno alla periferia delle colonie (Figura 1). Time-lapse imaging di cellule batteriche in camere a flusso nano-microfluidica ha rivelato che spasmi motil...

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Discussione

In questo studio, abbiamo caratterizzato il comportamento movimento di X. fastidiosa Pell mutante Xf ΔpilG ei suoi complementari ceppi XfΔpilG- C a nuova concezione multipla parallelo-nano-canale micro camere di fl uidic. Le camere uidic di nuova progettazione micro fl possono avere fino a quattro camere parallele con 100 micron nano-canale in larghezza rispetto a modelli precedenti con un solo 50 micron di larghezza di canale 18. Il miglioramento più ampio nano...

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Divulgazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Riconoscimenti

Questo studio è stato sostenuto dal United States Department of Agriculture, Agricultural Research Service. I nomi commerciali o prodotti commerciali in questa pubblicazione sono citati unicamente allo scopo di fornire informazioni specifiche e non implica raccomandazione o approvazione da parte del Dipartimento dell'Agricoltura degli Stati Uniti. USDA è un fornitore di pari opportunità e datore di lavoro.

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Biology materials
X. fastidiosa (Xf) Temecula wild typeCosta, H. S., et al., 2004 22
pilG deletion mutant XfΔpliGShi, X. Y., et al., 2007 26
pilG complementary strain XfΔpliG-C Davis, M. J., et al. 1998 23
Physical materials and equipment
Disposable inoculating loopsVWR international, Radnor, PA#22-363-607quantitative procedures such as bacterial collection
Polydimethylsiloxane (PDMS)Dow Corning Corporation#0002709226Sylgard 184 silicone Elastomeric Kits
AmScope MD2000 digital cameraAmScope, Irvine, CASE305R-AZ-EImage, video recording and measurement 
Tubes lineEdgewood, NY#T4300Connected to the syringe and microfluidic chamber
Plastic luer connectorsEdgewood, NYConnected to the syringe and microfluidic chamber
Syringe pumpsPico Plus, Harvard Apparatus, MA#702209The flow rate can be adjusted while the pump is running.
SyringesGastight, Hemilton Company, Reno, NV#1005Provide the flowing broth
Inverted Olympus IMT-2 microscopeOlympusIMT-2 FLuoro PHaseImage observation and recording
SPOT-RT digital cameraDiagnostic Instruments, Inc., MIRT230Image, video recording and measurement
Microscope ShutterThe UNIBLITZ, US#LS2T2Control camera’s exposure time
Microscope Shutter Control systemThe UNIBLITZ, USVCM-D1VCM-D1 Single Channel CE/UL/CSA Approved Shutter Driver
MetaMorph Image softwareUniversal Imaging Corp., PAReal-time super-resolution image processing 

Riferimenti

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