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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

The epithelial cells of the choroid plexus (CP) form the blood-cerebrospinal fluid barrier (BCSFB). An in vitro model of the BCSFB employs human choroid plexus papilloma (HIBCPP) cells. This article describes culturing and basolateral infection of HIBCPP cells using a cell culture filter insert system.

Abstract

The epithelial cells of the choroid plexus (CP), located in the ventricular system of the brain, form the blood-cerebrospinal fluid barrier (BCSFB). The BCSFB functions in separating the cerebrospinal fluid (CSF) from the blood and restricting the molecular exchange to a minimum extent. An in vitro model of the BCSFB is based on cells derived from a human choroid plexus papilloma (HIBCPP). HIBCPP cells display typical barrier functions including formation of tight junctions (TJs), development of a transepithelial electrical resistance (TEER), as well as minor permeabilities for macromolecules. There are several pathogens that can enter the central nervous system (CNS) via the BCSFB and subsequently cause severe disease like meningitis. One of these pathogens is Neisseria meningitidis (N. meningitidis), a human-specific bacterium. Employing the HIBCPP cells in an inverted cell culture filter insert system enables to study interactions of pathogens with cells of the BCSFB from the basolateral cell side, which is relevant in vivo. In this article, we describe seeding and culturing of HIBCPP cells on cell culture inserts. Further, infection of the cells with N. meningitidis along with analysis of invaded and adhered bacteria via double immunofluorescence is demonstrated. As the cells of the CP are also involved in other diseases, including neurodegenerative disorders like Alzheimer`s disease and Multiple Sclerosis, as well as during the brain metastasis of tumor cells, the model system can also be applied in other fields of research. It provides the potential to decipher molecular mechanisms and to identify novel therapeutic targets.

Introduzione

La barriera sangue fluido cerebrospinale (BCSFB) è uno dei tre siti barriera tra il sangue e il cervello 1. La correlazione morfologica sono le cellule epiteliali del plesso coroide (CP) 2,3, un convoluto endoteliale-epiteliale, che è fortemente vascolarizzato e situato nei ventricoli del cervello. Il CP serve per produrre il liquido cerebrospinale (CSF), nonché a separare quest'ultima dal sangue. Al fine di realizzare la funzione di barriera, le cellule epiteliali CP mostrano una bassa attività pinocitotiche, esprimono trasportatori specifici, e sono densamente collegati da una rete continua di giunzioni strette (TJS) 2,3.

Umana coroide plesso papilloma (HIBCPP), le cellule, derivate da una maligna coroide plesso papilloma di una donna giapponese a 4, sono stati usati per costruire un funzionale modello in vitro del BCSFB. cellule HIBCPP mostrano un paio di caratteristiche di un BCSFB funzionale come la formazione di TJfili, lo sviluppo di un alto potenziale di membrana transepiteliale che può essere determinato come la resistenza elettrica transepiteliale (TEER) e permeabilità minori per macromolecole. Inoltre, le cellule HIBCPP esprimono trasportatori caratteristici, che possono servire a regolare il microambiente ionico, e mostrare apicale / basolaterale 5,6,7 polarità.

Il BCSFB ha dimostrato di funzionare come un sito di ingresso per agenti patogeni (batteri, virus e funghi) nel sistema nervoso centrale (CNS) 8. L'invasione di patogeni, tra cui Neisseria meningitidis (N. meningitidis), un batterio Gram-negativo, può causare malattie gravi come la meningite. La prova che supera la barriera epiteliale protettiva del CP è supportata da osservazioni istopatologici nei pazienti con malattia meningococcica esibendo una maggiore quantità di meningococchi nei vasi e le cellule epiteliali CP 9,10. Per ottenere l'ingresso nelle cellule ospiti bacteria spesso dirottare meccanismi di endocitosi, che sono mediati o attivati ​​da specifici recettori di superficie situati sulle cellule ospiti. Poiché interazioni di patogeni con questi recettori possono essere specie modelli 11, animali specifici possono essere consultati solo in misura limitata. La linea cellulare HIBCPP offre l'opportunità di studiare il processo di invasione nonché i meccanismi molecolari alla base in un sistema modello umano. Impiegando inserti di coltura cellulare ci permette di analizzare le interazioni di agenti patogeni con cellule ospiti da due lati delle cellule distinte. Molti batteri, tra cui N. meningitidis, sono fortemente soggetta all'impatto di gravità durante saggi di infezione. Per l'interazione ottimale dei patogeni con cellule HIBCPP durante i saggi, i batteri sono inizialmente aggiunti nel vano superiore del sistema di cartuccia del filtro di coltura cellulare. Per attivare infezione apicale o il lato della cella basolaterale rispettivamente, due varianti del sistema in vitro sono stati estafissare dei: Nel sistema standard cellule HIBCPP vengono seminate nel vano superiore dell'inserto filtrante, imitando la situazione quando i microrganismi si trovano sul CSF-lato ed entrare in contatto con il lato apicale delle cellule (Figura 1A, C). Al contrario, utilizzando le cellule HIBCPP in un sistema di cartuccia del filtro di coltura cellulare invertito riflette le condizioni quando i batteri sono entrati nel flusso sanguigno. Microrganismi diffondere nel sangue e di incontro CP cellule epiteliali dal lato basolaterale (Figura 1B, D). Degno di nota, in questo sistema modello è stato dimostrato che i batteri invadono le cellule HIBCPP in modo polare specificamente dal basolaterale 5,7 lato della cella.

In seguito alle infezioni del CP, gli agenti patogeni invasi possono essere riconosciuti dal sistema immunitario innato attraverso la legatura ai recettori pattern-recognition (PRR). i membri ben descritto dei PRRs appartengono alla famiglia dei recettori Toll-like (TLR). può TLR bind per strutture caratteristiche di microrganismi infettivi, che sono modelli patogeni associati definito molecolari (PAMPs). Legatura dei recettori porta all'attivazione della cellula ospite cascate di segnalazione che attivano l'espressione di citochine e chemochine 12, che a loro volta stimolano trasmigrazione delle cellule del sistema immunitario in tutto il BCSFB 13,14. E 'stato dimostrato che le cellule HIBCPP esprimono diversi TLR a livello di mRNA e che l'infezione con N. meningitidis si traduce in secrezione di diverse citochine e chemochine, tra cui CXCL1-3, IL-6, TNF IL8 e 15,16.

Qui, descriviamo coltivazione e infezione della linea cellulare umana HIBCPP in un sistema di inserto di coltura cellulare invertita che imita il BCSFB. Questo sistema modello consente di studiare le interazioni di agenti patogeni con il lato in vivo corrispondente cella basolaterale nonché la successiva risposta cellulare.

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Protocollo

1. Preparare cultura cellulare di filtro Inserti per celle semina HIBCPP in un sistema invertito modello

  1. Pre-caldo DMEM / F12 (Ham) supplementato con 5 mg / ml di insulina, 100 U / ml di penicillina, 100 ug / ml di streptomicina e 10% di siero fetale bovino (FCS).
  2. Utilizzare pinza sterile per posizionare 0,33 cm² area di crescita inserti del filtro coltura cellulare con una dimensione dei pori di 3 micron a testa in giù in un 12-pozzetti (Figura 1E).
  3. Riempire media nel vano inferiore dell'inserto filtro di coltura cellulare (circa 3 ml) e 100 ml sulla parte superiore del dispositivo di filtrazione. Inondare la piastra e il vano inferiore con il mezzo. Aspirare il mezzo eccessivo in modo tale che il vano inferiore dell'inserto filtrante rimane riempito (Figura 1E).
    Nota: Si consiglia di utilizzare una pipetta sierologica per questo passo.
  4. Coprire 12-pozzetti con il coperchio e trasferire gli inserti preparati filtri coltura cellulare per l'incubatore, 37 ° C,5% di CO 2 fino aggiunta di cellule.

2. La coltivazione e Passaging di celle HIBCPP

  1. Preparare DMEM / F12 (prosciutto) integrato con 5 mg / ml, 100 U / ml di penicillina, 100 ug / ml di streptomicina e 10% FCS.
  2. Pre-caldo medio e PBS a bagnomaria C 37 °. medio Aspirare dalla boccetta. Aggiungere 10 ml di PBS al pallone e turbolenza. Ripetere questa operazione una sola volta.
  3. Aggiungere 3 ml di 0,25% tripsina-EDTA al pallone e turbolenza. Mettere in incubatrice, 37 ° C, 5% di CO 2.
  4. Dopo circa 20 minuti togliere il pallone dal termostato. Assicurarsi che le cellule vengono staccate dal fondo del pallone e mostrano una forma rotonda quando esaminato con il microscopio.
    Nota: Le cellule non staccano completamente l'uno dall'altro e si trovano spesso in agglomerati. Si consiglia di utilizzare le cellule fino a passaggio 38.
  5. Per interrompere tripsinizzazione aggiungere 17 ml di mezzo. Risospendere le cellule pipettando su e giù e trasferire la sospensionein un tubo da 50 ml. Centrifugare a 50 xg per 10 min a temperatura ambiente.
  6. Risospendere le cellule in un volume adeguato di medie e contare le cellule utilizzando un emocitometro.
    Nota: La concentrazione di cellule risospese HIBCPP dovrebbe essere di 1 x 10 6 cellule / ml. Per la manutenzione di cellule HIBCPP si suggerisce di trasferire una quantità di 1-6 x 10 6 cellule in 10 ml di mezzo di un T75 in pallone. Modificare media ogni due giorni.

3. Semina filtro Cell Culture invertito inserti con le cellule HIBCPP

  1. Sulla parte superiore di ogni elemento filtrante invertita (cioè il lato inferiore del filtro) aggiungere 80 ml ​​di sospensione cellulare (cioè. 8 x 10 4 cellule) (Figura 1E).
    Nota: Assicurarsi che le cellule sono uniformemente distribuiti in sospensione invertendo il tubo prima della semina.
  2. Coprire le cartucce filtranti coltura seminato cellule con il coperchio della piastra 12 pozzetti e trasferimento in incubatore a 37 ° C, 5% CO 2.
  3. Il primo giorno, riempire 1 ml di mezzo nei pozzetti di una piastra da 24 pozzetti. Sollevare gli inserti del filtro di coltura cellulare utilizzando una pinza fuori dal 12-pozzetti, scartare il medium all'interno, girare gli inserti del filtro e metterli in orientamento standard nel preparato 24-pozzetti (Figura 1E).
  4. Mettere le cellule in terreno fresco ogni due giorni. Preparare 24 pozzi con terreno fresco e trasferire gli inserti del filtro ad esso. Riempire inserti con 0,5 ml di terreno fresco. Controllare TEER ogni giorno come descritto nel paragrafo 4.
  5. Quando i valori di Teer HIBCPP seminate cellule su inserti colture cellulari supera il 70 Ω x cm² (circa 4 giorni dopo la semina), per poi proseguire coltura cellulare in mezzo contenente 1% FCS e 5 mg / ml di insulina. Preparare piastre da 24 pozzetti con 1 ml di mezzo per ciascun pozzetto. Trasferire elementi filtranti ai pozzetti preparate e mezzo di scambio nel compartimento superiore.
    Nota: Questo ritiro siero dopo confluenza porta alla formazione diun potenziale di membrana superiore.
  6. Aspirare media dal vano del filtro, il trasferimento al preparato bene e riempire con 500 microlitri di media. Ripetere questa operazione una sola volta. Mettere le cellule durante la notte in incubatrice, 37 ° C, 5% di CO 2.

4. Misura della Transepithelial Resistenza elettrica (TEER)

  1. Immergere le punte degli elettrodi di voltohmmeter tessuto epiteliale per 15 minuti in 80% di etanolo. Trasferire voltohmmeter sotto il cofano e lasciare asciugare l'elettrodo per un momento. Mettere elettrodo nel rispettivo terreno di coltura usato per le celle per altri 15 minuti per equilibrare.
  2. Eseguire misurazioni posizionando il braccio più lungo dell'elettrodo modo che tocchi il fondo del vano inferiore ogni volta, posizionare il braccio più corto nel vano di alloggiamento del filtro.
    Nota: Valori di resistenza delle cartucce filtranti di coltura cellulare senza cellule in terreno dovrebbero essere utilizzati come valori vuoti ((valore misurato (Ω) - valore del bianco (Ω)) x Filtrodi superficie (cioè 0,33 cm²)).
  3. Dopo aver misurato posto l'elettrodo resta in 80% di etanolo per 15 min. Conservare in un tubo secca.

5. Determinazione della permeabilità paracellular

  1. Sciogliere 1 g FITC-inulina in 200 ml di mezzo la cultura integrata con 5 mg / ml di insulina 1% FCS. Applicare 50 ug / ml della soluzione nel vano filtro superiore prima infezione delle cellule.
  2. Dopo l'infezione raccogliere campioni di media dal basso bene per determinare la quantità di inulina passata dal vano filtro attraverso lo strato di cellule.
  3. Preparare una soluzione standard FITC-inulina ed eseguire 1: 2 diluizioni, 10 volte (100%, 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,13%, 1,56%, 0,78%, 0,39%, 0,2% e 0%) . Determinare la fluorescenza con la misurazione di tutti i campioni di lettore di micropiastre.

6. Preparazione di batteri per l'infezione delle cellule HIBCPP sulla cultura delle cellule filtro Inserti

  1. Un giorno prima dell'esperimento, raschiare tegli N. congelato meningitidis ceppi fuori una glicerolo magazzino e strisciare su agar cioccolato con Vitox. Crescere durante la notte in incubatrice, a 37 ° C, con il 5% di CO 2.
  2. Estratto 20-30 colonie dalla cultura durante la notte e trasferire in una provetta contenente 8 ml proteoso peptonata medio integrato con 0,042% NaHCO 3, 0,01 M MgCl 2 e 1% Polyvitex.
  3. Agitare i batteri per 1,25 ore a 220 rpm, 37 ° C. Pellet i batteri da centrifugazione a 2.684 g per 10 min a temperatura ambiente. Gettare il surnatante e risospendere il pellet batterico con 8 ml di terreno privo di siero. Vortex per assicurare una sospensione.
  4. Per determinare la densità cultura, misurare una diluizione di 1:10 ad una densità ottica (OD) a 600 nm. Regolare la sospensione batterica ad un OD 600 di 0,1.
    Nota: Questa sospensione contiene circa. 1 x 10 8 UFC / ml.
  5. Per confermare la concentrazione cellulare batterica, diluire la sospensione graduale (1,10) fino ad undiluizione del 10 -5 e la piastra su piastre di agar cioccolato.
    Nota: diluizioni seriali simili devono essere eseguite per calcolare curve di crescita batterica.

7. l'infezione delle cellule HIBCPP sulla cultura cellulare di filtro Inserti e la determinazione del batterica Invasion con un doppio immunofluorescenza

  1. Dopo continuando coltura cellulare in terreno contenente 1% FCS e 5 ug / ml di insulina, misurare cellule ogni giorno utilizzando un voltohmmeter tessuto epiteliale. Se le cellule hanno raggiunto un TEER di circa 500 Ω x cm², effettuare l'infezione.
  2. Infettare le cellule con la sospensione batterica preparata ad una molteplicità di infezione (MOI) di 10. Conservare le cellule infettate nell'incubatore, a 37 ° C, con 5% di CO 2 per il periodo di tempo indicato.
    Nota: La MOI può essere calcolato tenendo conto del numero di cellule per inserto filtro coltura cellulare a confluenza (1,21 x 10 6 cellule / cm 2).
  3. Arrestare il infettareion mediante lavaggio tre volte con 500 microlitri terreno privo di siero (SFM) contenente albumina di 1% di siero bovino (BSA) applicata al compartimento filtro, 1 ml al vano inferiore.
  4. Blocco con 500 microlitri SFM contenente tampone BSA 1% nel vano del filtro e 1 ml nel vano inferiore per 20 minuti a temperatura ambiente per prevenire l'aderenza di anticorpi siti di legame non specifici.
  5. Incubare con 100 microlitri anticorpo primario anti- N. meningtidis α-OMP (1: 200) nel vano filtro e 500 microlitri nel vano inferiore per 20 min a temperatura ambiente.
    Nota: Se necessario, la concentrazione di anticorpi deve essere titolato.
  6. Lavare le cellule aspirando il medium dal vano del filtro, trasferire l'inserto del filtro di un preparato SFM bene con 1 ml contenente 1% di BSA e riempire il vano del filtro svuotato con SFM 500 microlitri contenente 1% di BSA. Ripetere questa operazione due volte.
  7. Fissare le cellule con 500 microlitri 4% formaldeide nel compa filtrortment, 1 ml nel vano inferiore per 10 min a temperatura ambiente.
  8. Lavare le cellule aspirando il medium dal vano del filtro, trasferire l'inserto del filtro ad una ben preparata con 1 ml di PBS e riempire il vano del filtro svuotato con 500 microlitri di PBS. Ripetere questa operazione una sola volta.
    Nota: I campioni possono essere conservati durante la notte in PBS a 4 ° C.
  9. coltura cellulare fisso Cut filtra degli inserti e lavare con 250 microlitri di PBS contenente 1% BSA. Incubare le cellule per 15 min a temperatura ambiente con 250 microlitri fluorescente etichettati (lunghezza d'onda di eccitazione 594 nm) anticorpo secondario di coniglio anti pollo (1: 500) per colorare batteri extracellulari.
    Nota: Se necessario, la concentrazione di anticorpi deve essere titolato.
  10. Permeabilize cellule con 250 microlitri di PBS contenente 1% di BSA e 0,5% Triton X-100 per 1 ora a temperatura ambiente. Lavare le cellule tre volte con 250 microlitri di PBS contenente 1% BSA.
  11. Incubare con 250 microlitri anticorpo primario anti- N. meningitidis α-OMP (1: 200) per 30 min a macchia batteri extra- ed intracellulari. Lavare le cellule tre volte con 250 microlitri di PBS contenente 1% BSA.
  12. Applicare 250 ml di fluorescenza etichettati (eccitazione lunghezza d'onda di 488 nm) anticorpo secondario (1: 500), fluorescente marcato (eccitazione lunghezza d'onda di 660 nm) falloidina (1: 250) e 4', 6-diamidino-2-phenylindole dicloridrato (DAPI) ( 1: 50.000) per 1 ora a temperatura ambiente per colorare batteri extra ed intracellulari, citoscheletro actina e nuclei.
    Nota: Se necessario, la concentrazione di anticorpi deve essere titolato.
  13. Lavare le cellule tre volte con 250 microlitri di PBS contenente 1% BSA. Incorporare le cellule in terreno e conservare a 4 ° C di montaggio fino a esame tramite microscopio.
  14. Determinare il numero di batteri invaso per campo predefinito. A tale scopo, contando 20 campi per filtro a membrana. Calcolare la percentuale di batteri invaso.
    Nota: Moltiplicare il numero di batteri media dei 20 campi microscopici con una Coëffic zonaiente. Il risultato esprime la quantità di batteri totali presenti in un inserto filtro coltura cellulare 0,33 cmq. Dividere questo valore per la quantità di batteri cresciuti in media durante la durata dell'infezione.

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Risultati

Qui si descrive la coltura e l'infezione delle cellule HIBCPP in un sistema di coltura cellulare inserto invertita. Questo modello permette di studiare i meccanismi di invasione e le vie di segnalazione molecolari alla base dal lato delle cellule basolaterale, riproducendo una situazione fisiologica di batteri diffusione e che entrano cellule epiteliali attraverso il flusso sanguigno (Figura 1).

Le cellule...

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Discussione

Le cellule epiteliali del CP formano il BCSFB che separa il CSF dal 2,3 sangue. Recentemente abbiamo stabilito la linea cellulare HIBCPP come un modello umano funzionale del BCSFB. Le cellule mostrano importanti funzioni di barriera della BCSFB in vitro, compreso lo sviluppo di un elevato potenziale di membrana, una bassa permeabilità per le macromolecole, così come la presenza di filamenti continui di TJs 5. Le proteine ​​TJ contribuiscono ad una polarità apicale / basolaterale del...

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Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Riconoscimenti

The authors would like to thank Prof. Hartwig Wolburg for performing the electron microscopy.

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% Trypsin-EDTAGibco25200-056
4´,6 diamidino-2-phenylindole (DAPI)Life TechnologiesD1306
12-well platesStarlabCC7682-7512
24-well platesStarlabCC7682-7524
Anti Neisseria meningitidis α-OMPThis antibody was a gift from Drs. H. Claus and U. Vogel (University of Würzburg, Germany)
Alexa Fluor 488 (chicken anti rabbit)InvitrogenA21441
Alexa Fluor 594 (chicken anti rabbit)InvitrogenA21442
Alexa Fluor 660 PhalloidinInvitrogenA22285
Bovine serum albumine (BSA)Calbiochem12659
Chocolate agar platesBiomerieux43109
Cytochalasin DSigmaC8273
DMEM/F12 + L-Glut + 15 mM HEPESGibco31330-095
DMEM/F12 + L-Glut + 15 mM HEPES w/o PhenolredGibco11039-047
Dimethyl sulfoxideSigmaD2650
Fetal calf serum (FCS)Life Technologies10270106
FITC-InulinSigmaF3272
InsulinSigma19278
MgCl2Sigma2393
NaHCO3Sigma55761
PBS + Mg + CaGibco14040-174
Penicillin/StreptomycinMP Biomedicals1670049
PolyvitexBiomerieux55651
Proteose peptoneBD211684
Serum-free mediumGibco10902-096
Thincert cell culture inserts for 24-well plates, pore size 3 µmGreiner662630
Tissue culture flask 75 cm² red cap sterileGreiner658175
Triton X-100SigmaT8787
Volt-Ohm Meter Millicell-ERS2 with MERSSTX01 electrodeMilliporeMERSSTX00

Riferimenti

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