Studiando l'organizzazione supramolecolare di fotosintetici membrane all'interno di tessuti fogliari Gelo-fratturati da Cryo-microscopia elettronica a scansione

Riepilogo

Here we describe a procedure for studying freeze-fractured plant tissues. High-pressure frozen leaf samples are freeze-fractured and double-layer coated, yielding well preserved frozen-hydrated samples that are imaged using the cryo-scanning electron microscope at high magnifications with minimal beam damage.

Abstract

microscopia elettronica Cryo-scansione (SEM) di campioni freeze-fratturato permette di indagine delle strutture biologiche in condizioni vicine native. Qui, descriviamo una tecnica per studiare l'organizzazione supramolecolare di fotosintetici membrane (tilacoidali) all'interno di campioni di foglie. Ciò si ottiene alta pressione congelamento del tessuto fogliare, liofilizzazione fratturazione, rivestimento a doppio strato e infine l'imaging crio-SEM. L'utilizzo del metodo di rivestimento a doppio strato consente l'acquisizione di alto ingrandimento (> 100,000X) le immagini con danni raggio minimo per i campioni congelati idratata così come gli effetti di ricarica minimi. Usando le procedure descritte abbiamo studiato le alterazioni nella distribuzione del fotosistema supramolecolare e proteine ​​antenna luce raccolta complessi che si svolgono durante la disidratazione della pianta risurrezione Craterostigma pumilum, in situ.

Introduzione

la fotosintesi Oxygenic, originari di antica cianobatteri, fu ereditato da alghe e piante terrestri da eventi endosimbiontica che hanno portato allo sviluppo del organello cloroplasto. In tutti i fototrofi Oxygenic moderni, di trasporto degli elettroni fotosintetica e la generazione di forza proton-motrice e potere riducente sono svolte all'interno di vescicole sac-come appiattite denominati membrane 'tilacoidali. Queste membrane ospitano complessi proteici che effettuano le reazioni luce-driven di fotosintesi e forniscono un mezzo per la trasduzione di energia. Le membrane tilacoidi di piante e di (alcuni) alghe si differenziano in due domini morfologiche distinte: le regioni di membrana strettamente appressed chiamati 'grana' e membrane unstacked che interconnettono la grana, chiamati 'stroma lamelle' ^1. sono stati condotti diversi studi freeze-frattura degli impianti e delle membrane tilacoidi algali, a partire dai primi anni 1970. Quando freeze-fratturato, membraneraggruppati lungo il loro core idrofobico ^2, generando una faccia exoplasmic (EF) e una faccia protoplasmatico (PF), a seconda del compartimento cellulare cui i confini semi-membrana, come originariamente coniato da Branton et al. . nel 1975 ³ Impianti e tilacoidi alghe hanno quattro diverse facce della frattura: EF, EFU, FP e PFU, con 's' e che denotano e regioni 'u' '' 'impilati unstacked' membrana, rispettivamente. I complessi di proteine ​​di membrana, che non sono tagliati o rotti, hanno la tendenza a rimanere sia con la E o laterale P della membrana. Le osservazioni iniziali che le diverse facce della frattura dei tilacoidi contengono particelle di diverse dimensioni e densità ^4, e le numerose indagini che seguirono, ha portato all'identificazione e correlazione tra le particelle osservate ed i complessi proteici di membrana che svolgono le reazioni luce ^5-13 (vedi anche ^14,15).

freesperimenti di Eze-frattura delle membrane tilacoidi sono in genere effettuate su preparazioni di cloroplasti o isolate membrane tilacoidi (ma si veda ^16,17), con il rischio di ogni cambiamento di / organizzazione strutturale e supramolecolare o che possono verificarsi durante la procedura di isolamento. A seguito della frattura, repliche sono preparati mediante evaporazione del platino / carbonio (Pt / C), poi da uno spesso strato di carbonio (C), ed infine la digestione del materiale biologico ^18. Repliche vengono visualizzati mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM). La tecnica di congelamento-frattura-replica tradizionale continua a servire come un importante strumento per lo studio della organizzazione supramolecolare delle membrane fotosintetiche e il loro adattamento al diverso, ad esempio., La luce, le condizioni di ^19-23.

Nel nostro recente studio della pianta risurrezione homoiochlorophyllous Craterostigma pumilum ^24, abbiamo voluto indagare i cambiamenti nell'organizzazione o supramolecolaremembrane tilacoidi f, nonché in grado di organizzazione cellulare, durante la disidratazione e reidratazione. L'unicità di specie resurrezione homoiochlorophyllous è che sono in grado di sopravvivere in condizioni di disidratazione nelle loro tessuti vegetativi (foglie), pur mantenendo la loro fotosintetico. Una volta che l'acqua è disponibile, queste piante recuperare e riprendere l'attività fotosintetica in poche ore ad alcuni giorni ^25. Per questo studio, crio-scanning EM (SEM) per immagini di campioni di foglie freeze-fratturato è stato combinato con alta pressione congelamento per il campione crio-immobilizzazione. Queste procedure forniscono un mezzo per visualizzare campioni biologici congelati idratati in uno stato vicino al loro stato nativo ^26. Un vantaggio principale è che i campioni vengono esaminati direttamente dopo freeze-frattura e rivestimento senza passaggi successivi. Ciò è particolarmente rilevante per l'indagine di piante a diversi contenuti di acqua relativi (RWC), come il loro stato di idratazione viene mantenuto durante la preparazione. Comemai, uno svantaggio fondamentale è che i campioni congelati-idratato possono soffrire di danni fascio durante l'imaging, soprattutto quando scansione ad alti ingrandimenti, necessari per la misurazione accurata delle dimensioni di complessi fotosintetici. Per ovviare a questo, un metodo chiamato 'rivestimento a doppio strato' (DLC) ^27,28 combinata con state utilizzate condizioni specifiche di imaging crio-SEM. Questi hanno portato in campioni che sono significativamente meno-fascio sensibile e ha permesso per la delucidazione delle preziose informazioni sulla proteina fotosintetica organizzazione supramolecolare e di altri costituenti cellulari della pianta risurrezione C. pumilum ad alti ingrandimenti in situ.

Protocollo

1. Cryo-fissaggio di Leaf tessuti per congelamento ad alta pressione

Nota: Questa sezione descrive come effettuare ad alta pressione congelamento dei tessuti fogliari per un esperimento di congelamento-frattura. Per considerazioni relative ai campioni di piante vedere ^29. Questo può essere adattato per altri tipi di tessuti o campioni con alcune modifiche.

1. Utilizzando l'angolo di una lama di rasoio, graffiare il fondo della cavità 0.1 mm di una piastrina di alluminio di 0,1 / 0,2 mm (Figura 1). Preparare almeno una dozzina di piastrine (6 campioni). Fare attenzione a non creare marchi coltello sulla circonferenza del disco.
   1. Dopo graffi, lavare i dischi in etanolo assoluto, lasciarli asciugare e conservare in un piatto pulito.
2. Preparare la macchina di congelamento ad alta pressione secondo le istruzioni del produttore. Riempire camera di alcol della macchina di congelamento ad alta pressione con isopropanolo.
3. Preparare un vacuum-assisted infiltratio fatta in casan dispositivo per sostituire il gas che si trova nel tessuto fogliare di liquido.
   1. Strettamente collegare un puntale 200 microlitri al fine di una siringa da 10 ml. Tagliare ~ 1 cm dalla punta. Fare un foro nel tappo di una provetta da 1,5 ml a stretto misura la punta tagliata. Vuoto può essere creato all'interno del tubo tirando lo stantuffo della siringa.
4. Tagliare un piccolo pezzo di foglia dalla pianta utilizzando una lama di rasoio e con le pinzette posizionare la foglia all'interno di una provetta riempito a metà con 1-esadecene. Infiltrati spazi intercellulari della foglia con il liquido tirando delicatamente lo stantuffo per creare il vuoto, tenere premuto per circa 30 secondi, quindi rilasciare lentamente lo stantuffo.
5. Rimuovere il pezzo foglia dal tubo con una pinzetta. Tagliare il foglio con una lama di rasoio in caso è più spesso di 0,2 mm e tagliare un piccolo pezzo che si inserisce in una delle piastrine.
6. Mettere una piastrina pulita con il lato graffiato fino nel supporto della macchina di congelamento e quindi inserire il pezzo tagliato di leaf in piastrine. Riempire lo spazio rimanente che circonda la foglia con 1-esadecene. Chiudere il sandwich utilizzando un altro piastrinica, con i graffi di fronte al foglio.
7. Chiudere e serrare il supporto e inserirlo nella camera della macchina. Quindi premere il pulsante 'Jet' di congelare (~ 2.100 bar per 300-500 msec), e trasferire rapidamente il supporto in azoto liquido. Rimuovere con attenzione il panino congelato dal supporto con una pinzetta pre-raffreddamento, facendo attenzione a non fratturare il panino.
   Nota: i panini surgelati chiuso può essere congelamento fratturato immediatamente o conservato in azoto liquido per un uso successivo. Usare indumenti protettivi e occhiali durante la manipolazione di azoto liquido.

2. Fermo-frattura e doppio strato di rivestimento ^27,28

1. Preparare la macchina frattura congelamento per l'uso, tra cui entrambe le pistole per evaporazione del platino / carbonio (Pt / C) e carbonio, secondo le istruzioni del produttore. Posizionare la pistola Pt / C a 45 gradi unnd la pistola di carbonio a 90 gradi.
   1. Pre-programma di un ciclo di uno strato di 2 nm di Pt / C (tasso di rivestimento 0.02 - 0.04 nm / sec) e uno strato 6 nm di carbonio (a ~ 0.1 nm / sec).
      1. Inserisci il setup sullo schermo della macchina freeze-frattura. Selezionare un numero utente in cui verrà salvato il sistema di rivestimento.
      2. Scegli Pt / C per 'livello 1'. Selezionare un intervallo di tempo, ad esempio., 5 min (per superare il tempo necessario necessario per completare il rivestimento). Utilizzare le frecce su-giù per definire uno spessore di 2 nm.
      3. Premere il pulsante 'Layer' per passare al livello 2. Ripetere il punto 2.1.1.2, tranne selezionare carbonio e definire uno spessore di 6 nm.
   2. Testare e regolare il funzionamento della pistola.
      1. Seleziona 'livello 1'. Selezionare la pistola Pt / C premendo il pulsante 'GUN1' e premere il pulsante 'ON' sull'unità di controllo di evaporazione della macchina freeze-frattura. Monitorare la velocità di evaporazione e regolare utilizzando le manopole di tensione e di emissioni until raggiungimento di un tasso di 0,02 - 0.04 nm / sec. Premere 'OFF' per spegnere la pistola Pt / C.
      2. Seleziona 'livello 2'. Ripetere 2.1.2.1, tranne selezionare 'GUN2' e regolare per un tasso di evaporazione del ~ 0.1 nm / sec.
2. Raffreddare la fase di sistema di fratture congelamento a -140 C o -160 C (per le foglie idratati o disidratati, rispettivamente). Fissare la navetta di trasferimento vacuum crio alla macchina e riempire la sua camera con azoto liquido. Pressione nella camera di congelamento-frattura raffreddato è generalmente fra 1 - 8 x 10 ^-7 mbar.
3. Inserire un supporto esemplare congelamento fratturazione (adatto per le piastrine 3 mm) nella stazione di carico. Inondare la camera di stazione di carico con azoto liquido.
4. Caricare due panini congelate destinate al titolare uno ad uno con alta precisione pinzette grade. Serrare il primo panino nel supporto e poi capovolgere il supporto a controllare che si adatta saldamente in posizione. Ripetere l'operazione per il secondo panino.
5. Detach la navetta raffreddato dalla macchina frattura congelamento e collegarlo alla stazione di carico. Aprire la valvola shuttle, introdurre il braccio retrattile nel supporto e bloccarlo in posizione. Reintrodurre il braccio con il supporto nella navetta e chiudere la valvola a navetta con la manopola stazione di carico. Fissare la navetta per la macchina di congelamento-frattura e introdurre il supporto nella camera con il braccio retrattile. Staccare la navetta dalla macchina.
6. Allineare il coltello microtomo frattura congelamento ad un'altezza tale che possa staccare le prime piastrine dei panini.
7. Con il coltello microtomo, rompere rapidamente i panini, e poi subito sollevarla per evitare la contaminazione dei campioni da detriti aggrappato al coltello, e ruotare l'otturatore raffreddata sopra del piano appena esposto per proteggere i campioni da eventuali contaminazioni da molecole di acqua la Camera.
8. Cappotto i campioni con il platino e carbonio.
   1. Inserire 'livello 1' sul scReen. Accendere la pistola Pt / C premendo il pulsante 'GUN1' seguito dal tasto 'ON'. Esaminate la velocità di evaporazione e, una volta raggiunta 0.02 - 0.04 nm / sec, esporre contemporaneamente i campioni e premere il tasto 'Measure' per controllare lo spessore dello strato depositato.
      Nota: Gun si spegne automaticamente quando lo spessore raggiunge il valore pre-selezionato.
   2. Coprire i campioni con l'otturatore quando Pt / C evaporazione è completata.
   3. Premere il pulsante 'Layer' per passare a 'livello 2'. Ripetere i punti 2.8.1 e 2.8.2, con l'eccezione di selezionare 'GUN2' (per il carbonio) e un tasso di evaporazione di ~ 0,1 nm / sec.
9. Scaldare la fase di sistema di fratture congelamento a -120 ° C.

3. Cryo-microscopia elettronica a scansione

1. Preparare il microscopio elettronico a scansione per il lavoro crio.
   1. Selezionare Fase / Fase di inizializzazione dal menu principale e confermare.
   2. Selezionare Strumenti / Goto pannello, e aprire il pannello 'Airlock' selezionandolo dalla lista. Fare clic sul pulsante 'Chiudi Colonna camera della valvola'. Ventilare la camera microscopio facendo clic sul pulsante Vent nella scheda 'vuoto'.
   3. Selezionare Strumenti / Goto Panel, e aprire il pannello 'punti tappa List'. Selezionare la posizione di crio-scambio per spostare il palco per le coordinate appropriate per l'accettazione supporto del campione. Nota: La 'posizione di crio-scambio' è preimpostata per essere in allineamento con la posizione dell'unità di trasferimento a vuoto.
   4. Aprire la camera campione con un pulito paio di guanti e inserire il crio-stage sul palco principale del microscopio. Chiudere la camera e fare clic sul pulsante della pompa sotto la 'scheda del vuoto'.
   5. Raffreddare il microscopio a -120 ° C. Riempire il microscopio Dewar con azoto liquido. Attivare la funzione di calore sull'unità di controllo crio-transfer a -120 C una volta la temperatura della fase scende sotto -120 ° C.
2. Attach la navetta crio-trasferimento al microscopio e trasferire il supporto del campione usando il braccio retrattile in fase di microscopio crio (come nel passaggio 2.5). Staccare la navetta dal microscopio.
3. Fare clic sul pulsante 'Open Colonna camera della valvola' nel Pannello Airlock.
4. muoversi con cautela il titolare del campione vicino alla lente dell'obiettivo (distanza di lavoro 1 - 2 mm) utilizzando il joystick. Selezionare un'apertura di 10 micron nella scheda 'aperture'. Fare doppio clic sul campo EHT nella scheda 'Gun'. Inserire 10 (kV) per il target EHT e fare clic su OK. Fare clic sulla scheda EHT basso e selezionare 'EHT On'.
5. Seleziona 'InLens' dall'elenco a discesa rivelatori nella scheda 'rivelatori'. Ottimizzare le condizioni di imaging (messa a fuoco, luminosità e contrasto, allineamento del fascio, astigmatismo) a seconda dei casi.
6. Fare clic sulla scheda 'Scansione'. Scegliere una scansione veloce ( 'Scan Speed ​​= 1', corrispondente ad un tempo di permanenza di 100 nsec per pixel) per minimizzare i danni del fascio, euna 'risoluzione Store' di 1.024 x 768 pixel. Seleziona 'Linea Avg' nel menu a discesa la 'riduzione del rumore'. Regolare il valore di N per 20 - 30 linee per la ricerca. Spostare il campione utilizzando la funzione 'Centre Point' (premendo Ctrl-Tab sulla tastiera) per cercare per le regioni con le cellule fratturate e cloroplasti (figure 2a e 2b).
7. Acquisire le immagini di cloroplasti fratturati a basso ingrandimento (50 - 70 kX) (Figura 2C e 2D). Utilizzare la funzione di 'Centro Feature' (premendo Control-Shift-Tab sulla tastiera) per ingrandire in interessanti volti della frattura cloroplasto e acquisire immagini ad alti ingrandimenti (100-200 kX, figure 3 e 4). Utilizzare gli stessi parametri come al punto 3.6 per l'acquisizione delle immagini, ma cambiare la linea del valore medio per N> 100 per la riduzione del rumore ^30.
   1. Premere FREEZE sull'unità di controllo del microscopio principale o nella scheda 'Scansione' per fermare la scansione e salvarel'immagine premendo il pulsante 'Salva TIFF'.

Analisi 4. Immagine

Nota: Questa sezione descrive una breve procedura per la segmentazione di particelle di membrana da immagini freeze-frattura SEM utilizzando il pacchetto open-source Fiji ^31. Risultati simili possono essere ottenuti con altri software di analisi di immagine.

1. Apri l'immagine con le Figi trascinando file immagine nella finestra principale del programma. Convertire l'immagine a 8 bit selezionando Immagine / Tipo / 8-bit. Seleziona Immagine / Regola / Luminosità / Contrasto e regolare come necessario (Figura 5A).
2. Utilizzando lo strumento linea retta, tracciare una linea delle dimensioni della barra di scala immagine incorporata. Selezionare Analizza / Set Scala. Immettere le informazioni di scala adeguata (distanza nota e l'unità di lunghezza) e fare clic su OK. Salva questa immagine in scala regolata.
3. Selezionare Processo / filtri / sfocatura gaussiana (1,5 raggio nm) e fare clic su OK (Figura 5B).
4. Seleziona Immagine / Regola / AutO soglia locale (utilizzando il metodo Niblack) e fare clic su OK (Figura 5C).
5. Selezionare Modifica / invertito e poi di processo / Binario / Watershed (Figura 5D).
6. Disegna un bordo intorno alla regione di interesse (ROI) con lo strumento Selezione a mano libera. Aggiungere la selezione al gestore ROI selezionando Modifica / Selezione / Aggiungi al Manager o cliccando su 'T'.
7. Selezionare Modifica / Liberata Esterno (Figura 5E).
8. Selezionare Analizza / Set Misure, scegliere i parametri appropriati (ad esempio, area, ellisse in forma).
9. Selezionare Analizza / Analyze particelle. Inserisci una gamma appropriata per la dimensione delle particelle e segnare 'Risultati', 'Aggiungi al Manager' e, se necessario, il 'Escludi sui bordi' opzione e fare clic su OK. Il risultato è mostrato in Figura 5F.
10. Aprire il file ripreso in scala salvato (passo 4.2). Seleziona 'Mostra tutto' e deselezionare 'etichette' nella ROI Manager. Rivedere il partic selezionatoles posato sul immagine originale e aggiungere o rimuovere le selezioni utilizzando il 'Aggiungi' o 'Cancella' pulsanti del ROI Manager manualmente. Correggere eventuali selezioni necessarie utilizzando lo strumento Selezione a mano libera e il pulsante 'Aggiorna' del ROI Manager (figure 5G e 5H).
11. Analizzare i dati utilizzando le misure ottenute. Nella finestra Risultati, fare clic su Risultati / Riassumere per ottenere, ad esempio, l'area media, e dire Maggiore e assi minori delle particelle elencati nel ROI Manager. Clicca Risultati / Distribuzione, selezionare un parametro (come Area) e fare clic su OK per visualizzare un istogramma per questo parametro.

Risultati

La figura 1 mostra le immagini crio-SEM di piastrine contenenti alta pressione congelati, freeze-fratturati Craterostigma pezzi di foglia pumilum. In alcuni campioni, ampie regioni di cellule fratturati sono ottenuti (Figura 1A). In altri, il pezzo foglio rimane strettamente legata al disco superiore e viene buttato giù con esso (Figura 1B). Tuttavia, anche nel secondo caso, un po 'di tessuto fogliare può rimanere...

Discussione

La tecnica descritta in questo documento permette di indagine di membrane freeze-fratturato nel contesto dei tessuti vegetali congelati alta pressione ben conservate mediante microscopia elettronica crio-scansione. Il principale vantaggio di utilizzare queste procedure è che la preparazione del campione è puramente fisica; non sono necessarie operazioni che coinvolgono sostanze chimiche o disidratazione. Quindi, consente lo studio delle strutture biologiche in uno stato quasi native ^26,32. Il vantaggio di u...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ethanol abs	Bio-Lab	052505
Isopropanol	Bio-Lab	162605
1-hexadecene	Sigma-Aldrich	H7009
0.1/0.2 Platelets	Engineering Office M. Wohlwend GmbH, Switzerland	241	Platelets are of 3-mm diameter and 0.5-mm-thick (Type A) with 0.1/0.2-mm-deep cavities (of diamater 2 mm). Similar platelets can be obtained from Leica Microsystems.
High-precision-grade tweezers	Electron Microscopy Sciences	72706-01	Dumont (Switzerland) Durostar style #5 tweezers; Can be substituted with other high-precision tweezers.
High-pressure freezing machine	Bal-Tec	HPM 010	High-pressure freezing alternatives: 1. HPF Compact 02, Wohlwend GmbH; 2. HPM 010, RMC Boeckeler; 3. EM PACT2, Leica Microsystems; 4. EM HPM 100, Leica Microsystems; 5. EM ICE, Leica Microsystems.
Freeze-fracture system	Leica Microsystems	EM BAF 060
Cryo preparation loading stage	Leica Microsystems	16770228
Specimen holder for univeral freeze fracturing	Leica Microsystems	16LZ04746VN	Clamp holder for specimen carriers of diameter 3 mm
Vacuum cryo-transfer shuttle	Leica Microsystems	EM VCT 100
Scanning electron microscope	Zeiss	Ultra 055
Cryo SEM stage	Leica Microsystems	16770299905
Image acquisiton software	SmartSEM, Carl Zeiss Microscopy GmbH
Image analysis software	Fiji/Image J, National Institute of Health	http://fiji.sc/Fiji