PTR-ToF-MS accoppiato con un sistema di campionamento automatizzato e analisi dei dati su misura per gli studi alimentari: monitoraggio del bioprocesso, screening e analisi dello spazio del naso

Riepilogo

Proton Transfer Reaction Time of Flight Mass Spectrometry allows high-sensitivity, rapid and non-invasive analysis of volatile organic compounds. To demonstrate its potential, we give three examples: lactic acid fermentation of yogurt (on-line bioprocess monitoring), different apple genotypes (large-scale screening), and retronasal space after drinking coffee (nosespace analysis).

Abstract

La Reazione di Proton Transfer (PTR), combinata con un Spettrometro di Massa (MS) di Time-of-Flight (ToF), è un approccio analitico basato sulla ionizzazione chimica che appartiene alle tecnologie DIMS (Direct-Injection Spectrometric Mass). Queste tecniche consentono la rapida determinazione di composti organici volatili (VOC), garantendo elevata sensibilità e precisione. In generale, PTR-MS non richiede né preparazione di campioni né distruzione di campioni, permettendo un'analisi in tempo reale e non invasiva dei campioni. PTR-MS è sfruttato in molti campi, dalla chimica ambientale e chimica atmosferica alle scienze mediche e biologiche. Più di recente abbiamo sviluppato una metodologia basata sull'accoppiamento di PTR-ToF-MS con un campionatore automatizzato e strumenti di analisi dei dati su misura per aumentare il grado di automazione e, di conseguenza, aumentare il potenziale della tecnica. Questo approccio ci ha permesso di monitorare i bioprocessi ( es. Ossidazione enzimatica, fermentazione alcolica)Per esempio diverse origini, interi germoplasmi) e per analizzare diversi modi sperimentali ( ad es. Concentrazioni diverse di un determinato ingrediente, intensità diverse di un determinato parametro tecnologico) in termini di contenuto di VOC. Qui riportiamo i protocolli sperimentali che esemplificano le diverse possibili applicazioni della nostra metodologia: cioè la rilevazione di VOC rilasciati durante la fermentazione di acido lattico di yogurt (monitoraggio bioprocesso on-line), il monitoraggio dei VOC associati a varie cultivar di mele (screening su larga scala) , E lo studio in vivo del rilascio di VOC Retronasal durante il bere da caffè (analisi dei nasespazi).

Introduzione

Le tecnologie spettrometriche di massa a iniezione diretta (DIMS) rappresentano una classe di approcci strumentali analitici che offrono una notevole risoluzione di massa e di tempo con elevata sensibilità e robustezza, consentendo la rapida rilevazione e la quantificazione dei composti organici volatili (VOC) ¹ . Questi approcci strumentali includono, tra gli altri, MS-e-nose, spettrometria di massa di ionizzazione chimica a pressione atmosferica (APCI-MS), spettrometria di massa di proton-trasferimento-reazione (PTR-MS) e spettrometria di massa di massa ionica SIFT-MS) ¹ . I pro ei contro di ogni approccio dipendono da: il tipo di iniezione del campione, la sorgente e il controllo degli ioni precursori, il controllo del processo di ionizzazione e l'analizzatore di massa ^{1 , 2} .

La spettrometria di massa di spostamento-reazione di proton (PTR-MS) è stata sviluppata più di venti anni fa per monitorare in tempo reale e wiI limiti di rilevazione bassi (solitamente pochi ppbv, parte per miliardo di volume) i composti organici più volatili (VOC) nell'aria ^{3 , 4} . Gli usi correnti di PTR-MS vanno dalle applicazioni mediche, al controllo degli alimenti, alla ricerca ambientale ^{5 , 6} . Le caratteristiche principali di questa tecnica sono: la possibilità di misurazione rapida e continua, la fonte intensa e pura di ioni precursori e la possibilità di controllare le condizioni di ionizzazione (pressione, temperatura e tensione di deriva). Queste caratteristiche permettono di combinare usi versatili con un alto grado di standardizzazione ^{1 , 4} . Infatti, il metodo si basa sulle reazioni degli ioni idronici (H ₃ O ⁺ ), che inducono il trasferimento protonico non dissociativo nella maggior parte dei composti volatili (in particolare quelli caratterizzati da una affinità protonica superiore a quella dell'acqua), protonando i composti neutri(M) secondo la reazione: H ₃ O ⁺ + M → H ₂ O + MH ⁺ . A differenza di altre tecniche, ad esempio , l'APCI-MS, la generazione di ioni precursori e la ionizzazione del campione sono divisi in due diversi comparti strumentali (una rappresentazione schematica dello strumento PTR-MS è riportata in figura 1 ). Una scarica elettrica mediante vapore acqueo nella fonte ionica a catodo ustione genera un fascio di ioni idronio. Dopo questa fase, gli ioni attraversano il tubo di deriva, dove avviene la ionizzazione dei VOC ⁷ . Ioni entrano quindi in una sezione di estrazione dell'impulso e vengono accelerati nella sezione TOF. Attraverso i tempi di volo, è possibile determinare i rapporti mass-to-charge degli ioni ⁸ . Ogni impulso di estrazione porta ad uno spettro di massa completo ⁸ della gamma m / z selezionata. Gli spettri ionici sono registrati da un sistema di acquisizione veloce ⁷ . Uno spettro completo è in genereAcquisite in un secondo, sebbene sia possibile ottenere una risoluzione più elevata in base al livello del segnale e del rumore e una stima quantitativa della concentrazione dello spazio di volume del VOC può essere fornita anche senza taratura ^{9 , 10} .

Figura 1: Schema illustrato di un PTR-MS. Rappresentazione schematica dello strumento PTR-MS. HC: sorgente ionica esterna con catodo cavo; SD: deriva della sorgente; VI, entrata a venturi; EM, moltiplicatore di elettroni; FC1-2, regolatori di flusso. Ristampato con l'autorizzazione di Boschetti et al. ⁷ . Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

11 . PTR è di notevole interesse nelle scienze ambientali, atmosferiche, alimentari, tecnologiche, mediche e biologiche ¹² .

I VOC associati alle matrici alimentari sono di notevole interesse per la scienza e la tecnologia alimentare a causa del loro ruolo importante nella base molecolare di fenomeni biologici legati all'odore e alla percezione del sapore e, quindi, all'accettazione degli alimenti. Quindi, il nostro interesse per il rilevamento in tempo reale e non invasivo dei VOC si riferisce principalmente alle qualità sensoriali del cibo. Inoltre, se consideriamo la possibilità di individuare i microrganismi deteriorati e patogeni mediante i VOCs liberati ¹³ e / o per monitorare i composti organici volatili come marcatori( Ad es. I sottoprodotti di Maillard durante i trattamenti termici) ¹⁴ , diventa chiaro come l'identificazione e la quantificazione del VOC siano settori di interesse nella gestione della qualità alimentare ⁶ . Diversi usi recenti di tecnologie PTR-MS per il rapido monitoraggio e la quantificazione dei VOC in matrici alimentari testimoniano l'ampia gamma di applicazioni di questi approcci analitici ( Tabella 1 ).

Matrice alimentare	Tipo di applicazione	Breve descrizione	Riferimento
Burro	Screening / Caratterizzazione	Origine geografica dei burro europei	15
Yogurt	Monitoraggio del bioprocesso	Evoluzione durante l'acido lattico fermentazione	16
Barre di cereali	Misura in vivo	Nosespace durante il consumo di cereali con composizione variabile di zucchero	17
Sistemi di modelli liquidi	Condizioni orali simulate	Valutazione della pressione della lingua e delle condizioni orali in una bocca del modello	18
Mela	Misura in vivo	Nosespace durante il consumo di mela con diversi parametri genetici, strutturali e fisico-chimici	19
caffè	Screening / Caratterizzazione	Differenziazione dei caffè specializzati	20
Mosto d'uva	Screening / Caratterizzazione	Effetto del processo di cottura	21
Caramelle aromatizzate	Misura in vivo	Determinazione su pannelli che utilizzano diversiMetodi di spettrometria diretta di massa	22
prosciutto	Screening / Caratterizzazione	Effetto del sistema di allevamento di suini	23
Pane	Condizioni orali simulate	Simulare l'aroma del pane durante la masticazione	24
latte	Screening / Caratterizzazione	Monitoraggio delle modifiche dinamiche indotte dalla fotooxidazione nel latte	25
caffè	Screening / Caratterizzazione	Diversità nei caffè tostati dalle diverse origini geografiche	26
Pane	Monitoraggio del bioprocesso	Effetto di diversi avviatori di lievito durante la fermentazione alcolica	27
caffè	Misura in vivo	Nosespace durante il consumo di diverse preparazioni di caffè arrosto	28
Pomodori	Screening / Caratterizzazione	Impatto della posizione di produzione, del sistema produttivo e della varietà	29
Pane	Monitoraggio del bioprocesso	Effetto della farina, del lievito e della loro interazione durante la fermentazione alcolica	30
Funghi	Screening / Caratterizzazione	Conservazione dei funghi porcini secchi	31
Yogurt	Monitoraggio del bioprocesso	Effetto delle diverse culture di avviamento durante la fermentazione lattica	32
Mela	Screening / Caratterizzazione	Diversità in una collezione di germoplasmi di mele	33
caffè	Screening / Caratterizzazione	Traccia dell'origine del caffè	34
caffè	Misura in vivo	Combinazione di aIl metodo sensoriale dinamico e l'analisi in-vivo del nosespace per comprendere la percezione del caffè	35

Tabella 1: Elenco degli studi scientifici che utilizzano PTR-ToF-MS nel settore alimentare. Lista non esaustiva di studi scientifici che utilizzano approcci basati su PTR per monitorare il contenuto di COV negli esperimenti alimentari.

Negli ultimi studi abbiamo riportato l'applicazione di PTR-ToF-MS accoppiati con un sistema di campionamento automatizzato e strumenti di analisi dei dati su misura per aumentare l'automazione e l'affidabilità del campionamento e, di conseguenza, aumentare il potenziale di questa tecnica ^{7 , 10 , 13} . Ciò ci ha consentito di esaminare, in termini di contenuto di VOC, grandi gruppi di campioni ( ad es. Cibo di origini diverse con molti replicati, interi germoplasmi), per analizzare l'influenza di diversi modi sperimentali sul rilascio di VOC ( ad es. Concentrazioni diverseDi un determinato ingrediente, di intensità diverse di un determinato parametro tecnologico) e di monitorare i COV associati ad una data bioprocessazione ( es. Ossidazione enzimatica, fermentazione alcolica). Qui, per esemplificare il potenziale del PTR-ToF-MS nel settore agroalimentare, presentiamo tre applicazioni paradigmatiche: la rilevazione di VOC rilasciati durante la fermentazione di acido lattico di yogurt indotti da diverse culture di avviamento microbico (monitoraggio bioprocesso on-line ), Il monitoraggio dei VOC associati a varie cultivar di mele (screening su larga scala) e lo studio in vivo del rilascio di VOC Retronasal durante il caffè (analisi del nasespazio).

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Protocollo

Il protocollo segue le linee guida del nostro comitato istituzionale sull'etica della ricerca umana.

1. Preparazione del campione e condizioni dell'autocampionatore

1. Monitoraggio bioprocesso on-line: rilevare i VOC rilasciati durante la fermentazione di acido lattico di yogurt
   NOTA: Questa sezione del protocollo rappresenta una parte della procedura riportata da Benozzi et al. ³²
   1. Aggiungere 5 ml di latte pastorizzato a ciascuna fiala (20 ml di fiale di vetro dotate di PTFE / septa di silicone). Prendere nota del tipo di latte utilizzato e riscaldare rapidamente i campioni a 45 ° C. Trasferitelo ad un autocampionatore multifunzionale GC dotato di un vassoio a temperatura controllata (45 ° C).
   2. Utilizzare il braccio robotico dell'autocampionatore per inoculare le fiale con le colture di starter microbiche (secondo le specifiche del produttore della coltura di avviamento). Impostare il tempo di incubazione in base alla tipologia del yogurt desiderato e alla specificaS riferito dal produttore della cultura di avviamento. Impostare il campionatore automatico per analizzare in modo rapido un campione dopo l'altro, ottenendo un monitoraggio VOC in linea della fermentazione dell'acido lattico durante la preparazione di yogurt.
2. Proiezione su larga scala: monitoraggio di COV associati a diversi genotipi di mele
   NOTA: Questa sezione del protocollo fa parte della procedura riportata da Farneti et al. ^{33 , 36}
   1. Mostrare le mele alla fase desiderata di maturazione / conservazione ( ad es. In fase di raccolta commerciale). Selezionare almeno cinque frutti omogenei senza danno visibile per ogni clone. Conservare le mele per il periodo desiderato a temperatura ambiente (25 ° C) o in frigorifero (4 ° C).
   2. Raccogliere cinque dischi cilindrici (1,7 cm di diametro e 1 cm di spessore) da ciascuna mela con un campionatore a lama. Includere una parte del tessuto corteccia e evitare la parte centrale con i semi.Immediatamente homogenizzare i campioni e congelare in azoto liquido. Conservare a -80 ° C fino all'analisi.
   3. Prima dell'analisi, inserire tre repliche del campione di 2,5 g di mele da ciascuna replica biologica nei flaconi (flaconi di vetro da 20 ml dotati di PTFE / septa di silicone). Mescolare il campione con 2,5 ml di acqua deionizzata, 1 g di cloruro di sodio, 12,5 mg di acido ascorbico e 12,5 mg di acido citrico e conservare i campioni a 4 ° C fino all'analisi (massimo 3 giorni).
   4. Incubare i campioni a 40 ° C e quindi impostare l'auto campionatore per analizzare automaticamente i VOC.
3. Analisi dei Nosespace: studiare il rilascio retronasale di VOC durante il consumo di caffè
   NOTA: Questa sezione del protocollo rappresenta una parte della procedura descritta da Romano et al. ²⁸
   1. Preparare il caffè preparato da campioni di caffè macinato.
      1. Utilizzare una macchina da caffè: segnalare il rapporto acqua / polvere, il tipo di acqua minerale utilizzata,Il tipo di caffettiera e la procedura adottata per ottenere la bevanda del caffè (i quantitativi sono funzione della dimensione della macchina del caffè).
      2. Utilizzare un creatore di caffettiera a sei tazze, noto in Italia come "moka", utilizzando 450 ml di acqua e 30 g di polvere di caffè. Mettere il caffè preparato in una vasca e trasferirlo in un bagno d'acqua termostatico (60 ° C).
   2. Per ogni birra di caffè, trasferire aliquote di 7,5 ml in una tazza di polistirene (40 mL) con un tappo in plastica. Avere ciascun panelista a gustare la bevanda secondo il protocollo: i) 30 s di respirazione libera, ii) un solo sorso di caffè, seguita da una rapida swallow e iii) 3 minuti di respirazione in un orlo ergonomico del vetro ²⁸ .
   3. Ripetere l'intero esperimento per tre giorni consecutivi, randomizzando ogni giorno l'ordine di campioni di caffè e pannelli.
   4. Eseguire il campionamento applicando un nosepiece ergonomico monouso in gomma siliconica al naso dei panelists. Collegare il nIl pezzo al PTR-ToF-MS mediante un tubo PEEK che non viene riscaldato solo nella prima parte a contatto con il corpo del pannello, quindi riscaldato a 110 ° C in un tubo di ingresso che collega l'interfaccia di campionamento con il PTR-MS strumento.
      NOTA: Nella tabella 2 un elenco di prodotti analizzati con procedure analoghe a quelle riportate da Benozzi et al. ³² , Farneti et al. ^{33 , 36} e Romano et al. Viene segnalato ²⁸ .

Matrice alimentare	Numero e tipo di campioni	Riferimento
Mela	Gli autori hanno proiettato una collezione rappresentata da 190 accessioni, composta da vecchie e nuove cultivar di mele	33
Yogurt	Quattro avviatori sono stati analizzati in termini di VOC rilasciati durante la fermentazione lattica di yogurt (A, FD-DVS YF-L812 Yo-Flex, Chr Hansen, B, FD-DVS YC-380 Yo-Flex, Chr Hansen; -DVS YC-X11 Yo-Flex, Chr Hansen; D, YO-MIX 883, Danisco)	32
caffè	Sono stati utilizzati tre diversi tipi di caffè macinato ottenuti da una singola miscela di caffè Arabica pura: arrosto medio, arrosto scuro e arrosto medio decaffeinato	28

Tabella 2: Elenco dei prodotti analizzati. Elenco dei prodotti analizzati con procedure analoghe a quelle riportate da Benozzi et al. ³² , Farneti et al. ^{33 , 36} e Romano et al. ²⁸

2. Disegno sperimentale e precauzioni pratiche

1. Eseguire almeno tre repliche biologiche interneTes, ognuno con tre repliche tecniche, per ogni modalità sperimentale.
2. Prima dell'incubazione e dell'analisi del campione, scorrere lo spazio di testa con aria pulita per 1 min a 200 sccm per ogni fiala.
3. Preparare un vuoto per ogni modalità sperimentale, incubare ed analizzare il vuoto nelle stesse condizioni dei campioni.
4. Randomizza l'ordine di campioni / spazi per analisi.
5. Analogamente ad altri metodi utilizzati per rilevare i VOC, limitare l'uso di prodotti per la cura della persona profumati, come gomma e sigarette, prima di utilizzare lo strumento. Bloccare con cautela tutti i prodotti chimici volatili nel laboratorio e controllare il più possibile durante il test ³⁷ .

3. Ottimizzazione e analisi dello strumento PTR-MS

NOTA: Le condizioni strumentali sono descritte nei riferimenti ( es. Makhoul et al ²⁷ ).

1. Eseguire le misurazioni dello spazio di testa dei campioni con un commerciAl PTR-ToF-MS nel modo di configurazione standard.
2. Iniettare direttamente l'aria nel condotto del tubo di deriva PTR-MS senza alcun trattamento. C'è un flusso continuo di aria di campionamento attraverso il PTR-MS in modo che l'iniezione si ottiene inserendo semplicemente l'estremità dell'ingresso PTR-MS nello spazio del campione.
3. Impostare e verificare costantemente le seguenti condizioni di ionizzazione nel tubo di deriva: temperatura del tubo di deriva di 110 ° C, pressione di deriva di 2.30 mbar, tensione di 550 V di deriva. Ciò porta ad un rapporto E / N di circa 140 Td (1 Td = 10 ^-17 cm ² V ^{- 1} s ^{- 1} ). La linea di ingresso è costituita da un tubo capillare PEEK (diametro interno 0,04 in.) Riscaldato a 110 ° C. Per impostazione predefinita, impostare il flusso di ingresso a 40 sccm.
4. Impostare il tempo di campionamento per canale di acquisizione di ToF a 0,1 ns, pari a 350.000 canali per uno spettro di massa che va fino a m / z = 400. Ogni singolo spettro è la somma di circa 28.600 acquisizioni durate 35Μs ciascuno, con una risoluzione di tempo di 1 s.
   NOTA: la Spectra viene quindi continuamente memorizzata. I segnali spettrometrici crescono da un livello di fondo a un valore stabile in pochi secondi (il tempo necessario per sostituire il gas nelle linee di ingresso) e solo gli spettri acquisiti dopo questo transitorio vengono considerati in ulteriore analisi.

4. Analisi dei dati personalizzati

NOTA: L'analisi dei dati personalizzata è stata sviluppata utilizzando una procedura in MATLAB.

1. Correggere le perdite di conteggio dovute al tempo morto del rilevatore di ioni tramite una metodologia basata sulle statistiche di Poisson come descritto da Cappellin et al. ¹⁰ .
2. Eseguire la calibrazione interna secondo una procedura descritta da Cappellin et al. ³⁸ per ottenere una buona precisione di massa (fino a 0,001 Th).
3. Effettuare l'annotazione composta confrontando i dati spettrali ottenuti con i dati di frammentazione degli standard di riferimento e con i dati rRiportato nella letteratura scientifica.
4. Eseguire la riduzione del rumore, la rimozione della base e l'estrazione dell'intensità di picco secondo Cappellin et al. ³⁹ , utilizzando Gaussians modificati per adattarsi ai picchi.
5. Calcolare l'intensità di picco in ppbv (parti per miliardo per volume) tramite la formula descritta da Lindinger et al. ⁵ , utilizzando il coefficiente di frequenza di reazione appropriato o un valore costante per il coefficiente di velocità di reazione (k = 2,10 ^{- 9} cm ³ s ^{- 1} ), quando il composto sottostante non è noto. Quest'ultima introduce un errore sistematico fino al 30% che può essere considerato se il coefficiente effettivo è conosciuto ⁴⁰ .
6. Mina i dati eseguendo l'analisi del componente principale, l'analisi della varianza, il test post-hoc di Tukey e altri test / analisi statistici che adattano pacchetti esistenti sviluppati usando R ( ad esempio Cappellin et al. ^10).

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Risultati

Il profilo volatile dei campioni ha provocato uno spettro di massa completo per la gamma di massa desiderata acquisita ogni secondo. Nella figura 2 viene fornito un esempio dello spettro medio acquisito durante la bioprocesso on-line di yogurt ³² . In ogni spettro possono essere identificate più di 300 picchi di massa nell'intervallo m / z fino a 250 Th ³² .

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Discussione

La spettrometria di massa di reazione al trasferimento di protoni (PTR-MS) accoppiata al tempo di volo (ToF) rappresenta un compromesso valido tra la necessità di identificazione e quantificazione dei composti organici volatili e la necessità di una rapida analisi analitica. L'alta risoluzione di massa che caratterizza l'analizzatore di massa ToF fornisce / fornisce sensibili sensibilità e spettri di massa con notevole contenuto informativo. Inoltre, l'applicazione di PTR-ToF-MS accoppiata ad un tester au...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
PTR-TOF 8000 High-Resolution PTR-TOF-MS	Ionicon Analytik Ges.m.b.H.	PTR-TOF 8000	An detector for volatile organic compounds (VOCs) that allows for continuous VOC quantification with a very high mass resolution
GERSTEL MPS 2XL	Gerstel		A multifunctional autosampler
Gas Calibration Unit	Ionicon Analytik Ges.m.b.H.	GCU-s / GCU-a	A dynamic gas dilution system that provides variable but known quantities of different standard compounds in a carrier gas stream
TofDaq	Tofwerk AG	free available at http://soft.tofwerk.com/	A data acquisition software (for spectra  acquisition)
MATLAB	MathWorks	http://it.mathworks.com/products/matlab/	A technical computing language and interactive environment for algorithm development, data visualization, and data analysis
R	The R Foundation	free available at https://cran.r-project.org/mirrors.html	A language and environment for statistical computing and graphics